雄黄对NB4和HL-60细胞的形态,PML mRNA及蛋白的表达影响

本研究以NB4 ,HL 60细胞为研究对象 ,采用Wright′s染色法及荧光染色法、免疫荧光技术及RT PCR法 ,探讨雄黄对NB4 ,HL 60细胞的形态、PMLmRNA及蛋白的表达影响。结果发现 :①经雄黄处理后 ,各组均出现细胞凋亡的形态学上改变。②雄黄处理后NB4细胞内融合蛋白降解 ,PML蛋白聚积于POD结构 ,随后降解 ;在HL 60细胞中PML蛋白发生相似改变。③雄黄处理后各组细胞PMLmRNA表达均无显著影响。结论指出 ,在雄黄诱导下PML在蛋白水平参与诱导白血病细胞凋亡机制 ,雄黄能诱导NB4 ,HL 60细胞凋亡 。

从石蜡包埋肺癌组织提取RNA检测PML基因转录的研究

背景与目的甲醛固定石蜡包埋组织(FPE)包含大量临床病理信息,同时还含有大量的基因和蛋白物质可用来研究临床意义。本研究的目的是探讨从FPE中提取RNA的可能性,检测急性早幼粒细胞白血病基因(PML)在肺癌FPE中的转录表达。方法选取前期经免疫组织化学染色证实无PML蛋白表达的40例肺癌FPE,存档时间在60-85个月,5例新鲜冰冻肺腺癌组织作为对照;利用Trizol一步法提取RNA,经OD值检测验证RNA质量;RT-PCR检测PML的基因转录表达。结果自肺癌FPE和新鲜冰冻组织提取的RNA的OD比值在1.7-2.1。RT-PCR显示,40例FPE以及5例新鲜冰冻组织中,PML(295bp)以及β-actin(318bp)mRNA均有表达。结论利用Trizol一步法自FPE提取RNA进行RT-PCR,可有效扩增出300bp左右的产物;肺癌组织中PML蛋白存在转录后缺失。

PML-RARα及RARα融合蛋白在三硫化二砷诱导的NB4细胞凋亡中的作用研究

为研究PML RARα及RARα融合蛋白在三硫化二砷 (As2 S3 )诱导的人早幼粒细胞白血病细胞系NB4细胞凋亡中的作用 ,本研究应用细胞形态观察、流式细胞术测定及DNA电泳等方法观察三硫化二砷对NB4细胞的诱导凋亡作用 ,用染色体G显带技术、反转录PCR及Western印迹测定这一过程中PML RARα融合基因及其表达产物、野生型RARα蛋白的变化。结果表明 ,三硫化二砷在 0 .5 - 2 μmol/L之间能诱导NB4细胞凋亡 ,在此过程中PML RARα融合基因无明显变化 ,但PML RARα融合蛋白和野生型RARα蛋白明显减少。结论提示PML

四硫化四砷治疗急性早幼粒细胞白血病过程中PML/PML-RARα蛋白的变化

为了研究四硫化四砷 (As4S4)对急性早幼粒细胞白血病 (APL)患者白血病细胞中PML/PML RARα蛋白的作用 ,在患者治疗前和治疗后不同时间多次留取骨髓或外周血标本 ,用抗PML蛋白单抗对APL细胞进行间接免疫荧光染色 ,并在荧光显微镜下观察荧光信号的演变规律。结果显示 :治疗前APL细胞表现为细胞核内弥漫分布的大量微颗粒荧光信号。As4S4 治疗后 ,最早于第 2天即可出现荧光分布的改变 ,表现为微荧光颗粒消失 ,出现数个大荧光颗粒 ,并出现核周荧光 ,最终大荧光颗粒也消失。当As4S4 合用全反式维甲酸 (ATRA)时 ,PML蛋白荧光信号变化规律与单用As4S4 基本相同。但单独应用ATRA治疗后 ,PML蛋白荧光信号的改变与前两组明显不同 ,主要差别为微荧光颗粒不会很快消失 ,而是在微荧光颗粒逐渐减少的基础上 ,出现越来越多的大荧光颗粒 ,最终微荧光颗粒消失 ,而大荧光颗粒始终存在。结论 :As4S4 使患者体内APL细胞的PML/PML RARα蛋白发生重新分布 。

早幼粒细胞白血病蛋白与TAK1结合蛋白相互作用的生物信息学分析与验证

目的通过生物信息学方法预测早幼粒细胞白血病蛋白与TAK1结合蛋白的相互作用,并通过免疫共沉淀方法进行实验验证。方法使用Rosetta软件,采用比较建模的方法,构建TAB1蛋白的三维模型;在PDB数据库中检索PML蛋白二级结构,并解析其晶体结构和三维结构。Zdock3.0.2软件进行PML与TAB1的蛋白-蛋白对接,并提取最佳构象进行对接模型的分子结构分析。α-MMC处理的M1炎性巨噬细胞,利用免疫共沉淀技术检测两种蛋白的相互作用。结果以PML的6IMQ为对接部位时,PML蛋白与TAB1蛋白能形成3个盐桥、6个氢键和6个疏水作用;以PML的5YUF为对接部位时,PML蛋白与TAB1蛋白能形成1个氢键、3个静电相互作用和9个疏水作用,两种对接模式皆能形成良好的分子对接和相互作用;在α-MMC处理4h后,其PML-IP组的细胞裂解沉淀液中分别能检测到显著的PML和TAB1阳性蛋白条带。结论PML蛋白与TAB1蛋白能发生较强的相互作用。

丹参酮ⅡA诱导NB4细胞分化与PML-RARα融合蛋白的关系

背景与目的:目前研究证实丹参酮ⅡA(TanⅡA)对白血病细胞具有抑制增殖、诱导分化和促凋亡的作用,但其具体作用机制尚不明确。本实验旨在研究TanⅡA与全反式维甲酸(all-tram retinoid,ATRA)及三氧化二砷(As2O3)诱导NB4细胞分化在细胞形态学、免疫表型和对PML-RARα融合基因及其蛋白影响的比较。方法:采用免疫荧光法观察NB4细胞内PML蛋白,Western blot检测PML-RARα融合蛋白,实时定量PCR方法检测PML-RARαmRNA;同时计算细胞生长抑制率,观察细胞形态学、免疫表型的变化。结果:TanⅡA能抑制NB4细胞生长,诱导分化,使NB4细胞PML蛋白异常分布重新定位、NBs结构恢复、PML-RARα融合蛋白降解。结论:降解PML-RARα融合蛋白可能是TanⅡA诱导NB4细胞分化的机制。

硒化壳聚糖通过下调PML-RARα融合蛋白来对NB4细胞产生抑制增殖和诱导凋亡作用(英文)

目的研究硒化壳聚糖对急性早幼粒白血病细胞株NB4增殖和凋亡的影响,探讨这种影响与PML-RARα融合蛋白表达的关系。方法应用MTT法检测硒化壳聚糖对细胞增殖的影响,应用AO/EB荧光染色法共聚焦显微镜下观察诱导凋亡作用,应用Western blot的方法检测细胞PML-RARα融合蛋白含量的变化。结果硒化壳聚糖可对体外培养的NB4细胞产生剂量和时间依赖性的抑制作用,50 mg/L至100 mg/L硒化壳聚糖作用NB4细胞24 h可诱导细胞出现明显的凋亡现象,经硒化壳聚糖处理24 h后,NB4细胞内PML-RARα融合蛋白含量明显减少。结论硒化壳聚糖可通过下调PML-RARα融合蛋白含量对NB4细胞产生抑制增殖和诱导凋亡作用。

白血病细胞早幼粒细胞白血病(PML)蛋白存在形式的检测和临床意义

目的研究早幼粒细胞白血病(PML)蛋白在急性早幼粒细胞白血病(APL)不同阶段存在形式,探讨全反式维甲酸(ATRA)、砷剂、化疗药物对PML蛋白存在形式的影响。方法收集42例APL的骨髓细胞和白血病NB4、MR2细胞,采用1μmol/L三氧化二砷(As_2O_3)、1μmol/L四硫化四砷(As_4S_4)、1μmol/L ATRA、10 mg/L阿糖胞苷、1 mg/L高三尖杉酯碱处理,采用间接免疫荧光法,检测处理前后细胞PML荧光信号变化。结果 APL初发病例87.5%表现为小荧光信号(细胞核内密布满天星般荧光亮点,多于30个/细胞),完全缓解病例91.67%表现为大荧光信号(细胞核内有较大的荧光亮点,少于30个/细胞),复发病例中83.33%表现为小荧光信号;与未加药组相比,ARTA组、As_2O_3组、As_4S_4组能使初发患者APL细胞的PML蛋白表达由小荧光信号转变为大荧光信号,阿糖胞苷组、高三尖杉酯碱组则无明显影响;ARTA能使NB4细胞PML蛋白表达由小荧光信号转变为大荧光信号,而不能改变MR2细胞PML蛋白表达的小荧光信号,As2O3和As4S4能使NB4、MR2细胞PML蛋白表达由小荧光信号转变为大荧光信号。结论检测APL细胞PML蛋白存在形式对APL预后判断及合理药物选择具有实际应用价值。

重型再生障碍性贫血患者血清诱导淋巴细胞凋亡及PML蛋白表达

用免疫荧光染色及Westernblot检测重型再障患者血清对正常人淋巴细胞凋亡的促进作用及早幼粒细胞白血病 (PML)蛋白表达的诱导作用 ,并进一步观察Caspase3,8抑制剂作用前后这两者的变化 ,以探讨再生障碍性贫血(再障 )患者淋巴细胞凋亡增加的机制。结果显示 ,10例重型再障患者血清作用后 ,淋巴细胞的凋亡率较正常人血清作用后明显增加 (P <0 0 5 )。同时 ,PML蛋白也明显高表达 (P <0 0 0 1) ,两者呈正相关 (r =0 919,P <0 0 0 1)。caspase8抑制剂可部分阻断再障患者血清的这种作用 ,但caspase3抑制剂不能阻断这种作用。以上结果提示重型再障患者血清可诱导淋巴细胞PML蛋白的高表达 ,从而导致淋巴细胞凋亡 ,caspase8可能参与了这一过程。

丹参酮ⅡA诱导NB_4细胞分化凋亡与PML-RARα融合蛋白的关系

目的 探讨丹参酮ⅡA (TanⅡA )诱导NB4细胞分化和凋亡过程中PML RARα融合蛋白变化及其与细胞分化、凋亡的关系。方法 采用免疫荧光法检测PML RARα融合蛋白的变化 ;同时计算细胞生长抑制率 ,观察细胞形态学变化 ,进行NBT还原实验 ,采用流式细胞术检测细胞凋亡和分析细胞周期。结果 TanⅡA能减少NB4细胞中微小荧光颗粒数 ,恢复NBs大斑点荧光颗粒 ,作用 72h后颗粒数减少最明显 ;同时 ,TanⅡA能提高细胞生长抑制率、诱导分化 ,增强NBT还原能力和提高凋亡细胞比率 ,降低细胞增殖指数 ,作用 12 0h后细胞分化和凋亡作用最强。结论 PML

比较丹参酮ⅡA、ATRA和As_2O_3对NB_4细胞PML-RARα融合蛋白作用的规律

目的 :比较丹参酮ⅡA、ATRA和As2 O3 对NB4细胞PML -RARα融合蛋白作用的规律 ,探索TanⅡA降低PML -RARα融合蛋白水平的原因。方法 :药物作用 2 4、 72、 12 0h ,用间接免疫荧光方法检测PML -RARα融合蛋白的变化。结果TanⅡA影响NB4细胞PML -RARα荧光染色颗粒的规律与ATRA作用一致 ,与As2 O3 作用不一致。结论 :TanⅡA可能通过激活caspase裂解PML -RARα融合蛋白或通过PML -RARα融合蛋白中RARα的AF - 2部分而降解PML -RARα融合蛋白 ,致PML -RARα融合蛋白水平降低 ,NB4细胞分化。

PML-RARα对环腺苷酸诱导急性髓系白血病细胞分化的影响

为了进一步探讨环腺苷酸cAMP协同低剂量氧化砷诱导急性早幼粒白血病细胞分化的分子机制,以稳定转染了PML-RARα融合基因的PR9细胞为实验对象,通过观察细胞的生长,并利用形态学实验、流式细胞技术和荧光素酶报告基因转染实验等检测cAMP和/或氧化砷处理前后细胞相关指标的变化,研究PML-RARα在cAMP诱导AML细胞分化过程中的作用。结果显示,虽然cAMP单独能使表达PML-RARα的PR9细胞表面分化抗原CD11b的阳性率有所升高;但细胞形态学分析表明,cAMP单用无法诱导表达PML-RARα融合蛋白的PR9细胞分化,只有联合氧化砷才能使细胞表现出完全分化的特征,并伴有CD11b表达的显著升高。此外,PML-RARα还可以明显抑制含有cAMP反应元件的报告基因的转录。结论:PML-RARα融合蛋白对cAMP诱导AML细胞分化的信号转导途径具有显著的抑制作用。

抗PML抗体免疫荧光法快速诊断急性早幼粒细胞白血病

对35例白血病病人骨髓标本进行抗PML抗体免疫荧光测定。19例急性早幼粒细胞白血病(APL)标本中,11例未治、3例服ATRA4天以内,以及3例复发病人均为典型APL荧光表现,2例ATRA诱导完全缓解APL病人荧光表现为非APL型。16例未治的非APL病人均为典型非APL表现。研究结果表明,抗PML抗体免疫荧光法简便、快速、特异,适于诊断未治和复发的APL病人。

酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-PML-V的构建、表达及鉴定

目的:构建早幼粒细胞白血病基因变异蛋白(Promyelocytic leukemia,PML-V)的诱饵表达载体,为应用酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid system)筛选与PML-V相互作用的蛋白建立实验基础。方法:PCR扩增PML-V,克隆入诱饵载体pGBKT7中,经测序鉴定后,将构建好的诱饵载体pGBKT7-PML-V转化到酵母细胞AH109中,并利用蛋白印迹法(Western Blotting)分析诱饵蛋白的表达情况。同时检测诱饵蛋白有无毒性、渗漏和自激活作用。结果:成功扩增了PML-V基因片断,并克隆入pGBKT7中,测序结果正确。诱饵载体成功转化到酵母细胞AH109中,诱饵蛋白无毒性、渗漏和自激活作用,Western Blotting分析证实酵母细胞表达诱饵蛋白。结论:成功构建了PML-V结合域的酵母诱饵表达载体,为进一步运用酵母双杂交技术筛选与之相互作用的蛋白奠定了基础。

PML—RARα融合基因相关蛋白原核表达载体的构建、表达和纯化

目的构建PML-RARα融合基因相关重组表达质粒，在大肠埃希菌中表达可溶性蛋白并进行纯化。方法利用聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）以PML-RARα全长质粒为模板分别扩增出长度均为1200bp的PML和RARα序列，并将它们分别插入PET32a（＋）质粒中，构建重组表达质粒，化学法转化大肠埃希菌DH5α进行克隆，菌落PCR筛选阳性转化子，双酶切和测序鉴定重组质粒的正确性。正确重组的表达质粒分别命名为PML-Flag-PET32a（＋）和Flag-RARα-PET32a（＋）。将正确重组的表达质粒转化感受态大肠埃希菌BL21（DE3），经异丙基β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达，利用表达蛋白的组氨酸＂标签＂（His-tag）进行Ni2＋-树脂柱亲和层析纯化，SDS-PAGE和Western blotting鉴定纯化蛋白质。结果PCR扩增获得目的基因，重组表达质粒经EcoRI／HindIII双酶切和测序鉴定证明构建正确。转化感受态BL21（DE3）并经诱导后得到高效表达，SDS-PAGE和Western blotting显示纯化蛋白为目的蛋白。结论成功构建重组表达质粒，并经诱导表达后可纯化出目的蛋白，为进一步的抗体制备等实验奠定了基础。

微球阵列检测PML-RARα融合蛋白的研究

本文研究了融合蛋白PML-RARα二元流式微球阵列的分析性能,流式细胞仪检测结果显示:a,捕获抗体可以有效偶联到微球上;b,荧光抗体的最佳反应体积为0.5μL;c,加入NB4或HL60或K562细胞蛋白提取液,微球阵列能特异性检测NB4细胞中的PML-RARα融合蛋白;d,将NB4细胞提取液进行稀释,细胞浓度与荧光强度作图,流式检测获取标准曲线,计算出微球阵列灵敏度值为0.63%。

PML翻译后修饰在肿瘤细胞中的研究进展

早幼粒细胞白血病（promyelocytic leukemia，PML）基因最初被发现于急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）中，在大部分APL病例中发现染色体异位t(15;17)，即17号染色体上的维甲酸受体α（retinoic acid receptor α，RARα）基因与位于15号染色体上的PML基因相互异位，产生新的融合蛋白PML-RARα，这种融合蛋白在APL中发挥重要的作用［1］。PML蛋白又称TRIM19，属于三重基序蛋白（tripartite motif，TRIM）家族成员，有6个细胞核亚型和1个胞质亚型［2］。TRIM家族蛋白由1个锌指结构域、1个或2个B-box 基序、1个螺旋-卷曲-卷曲结构域构成，也叫RBCC（ring, B-box and coiled-coil）家族蛋白3］，PML蛋白有3个富集半胱氨酸的锌指结构域和1个螺旋-卷曲-卷曲结构域，这些结构域共同形成RBCC模块。PML核小体 (PML nuclear bodies，PML-NBs) 是核基质相关结构域，PML-NBs在多数细胞核中以点状分布（直径为0.1~1 μm），

PML蛋白翻译后修饰参与PML核体功能调节的研究进展

早幼粒细胞白血病基因(promyelocytic leukemia,PML)编码的PML蛋白,作为抑癌因子在急性早幼粒细胞白血病以及多种癌症的发生及发展中扮演着重要的角色。PML蛋白在细胞中可发生多种形式的翻译后修饰,如SUMO化(SUMOylation)、泛素化(ubiquitination)、磷酸化(phosphorylation)和乙酰化(acetylation)修饰等。PML蛋白的这些修饰可直接影响PML核体(PML nuclear bodies,PML-NBs)的形成、DNA损伤修复、细胞凋亡等功能。异常修饰不仅可以引起血液系统肿瘤的发生,同时与肿瘤耐药有着密切关系。因此解析PML蛋白的翻译后修饰对PML核体形成及功能的影响和作用机制,以及相关血液系统肿瘤的预防和治疗均有重要的意义。本文就PML蛋白的翻译后修饰过程与PML核体功能间的关系作一综述,以期为相关肿瘤的药物治疗提供潜在的靶点。

靛玉红及丹参酮Ⅱa促进雄黄降解突变型PMLA216T-RARα的作用机制研究

目的探讨靛玉红及丹参酮Ⅱa联用促进雄黄降解突变型PMLA216T-RARα的作用机制。方法用不同浓度雄黄作用于野生型及突变型PMLA216T-RARα,观察2组细胞PML-RARα降解作用,验证PMLA216T-RARα存在砷剂耐药。根据CCK8测出的IC50值确定各组分浓度,使用不同浓度、不同组合的雄黄、靛玉红、丹参酮Ⅱa作用于转染PMLA216T-RARα细胞,应用蛋白质印迹法检测单用、两两联合及三者联合对PML-RARα的降解及自噬相关因子(p-mTOR、LC3B)的作用。分别联用蛋白酶体抑制剂卡非佐米及自噬抑制剂巴佛洛霉素A1,应用蛋白质印迹法检测各组细胞中PML-RARα的降解情况。结果与对照组(不用药物干预)比较,雄黄浓度为0.5μmol/L,作用于PML-RARα野生型及突变型PMLA216T-RARα时,均使PML-RARα发生了明显降解(均P<0.01),突变型PMLA216T-RARα表达的PML-RARα均比野生型高(均P<0.01)。与对照组比较,雄黄4μmol/L、靛玉红8μmol/L、丹参酮Ⅱa 8μmol/L作用于PMLA216T-RARα时,均使PML-RARα发生降解(均P<0.01),可降低p-mTOR水平(均P<0.01),升高LC3B水平(P<0.05,P<0.01),雄黄+丹参酮Ⅱa+靛玉红三者联合时上述作用最强(P<0.01)。与对照组比较,雄黄+丹参酮Ⅱa+靛玉红、雄黄+丹参酮Ⅱa+靛玉红+卡非佐米联用作用于PMLA216T-RARα时,均使PML-RARα发生明显降解(均P<0.01);与对照组比较,单用卡非佐米、单用巴佛洛霉素A1、雄黄+丹参酮Ⅱa+靛玉红+巴佛洛霉素A1,作用于PMLA216T-RARα时,均使PML-RARα发生了明显蓄积,且雄黄+丹参酮Ⅱa+靛玉红+巴佛洛霉素A1组PML-RARα表达高于单用卡非佐米及单用巴佛洛霉素A1组(均P<0.01)。结论靛玉红及丹参酮Ⅱa联用可通过自噬增强雄黄对突变型PMLA216T-RARα的降解作用,三者联用自噬作用最强,可能为复方黄黛片治疗急性早幼粒细胞白血病的作用机制之一。

肝癌组织和细胞系PML蛋白表达及As_2O_3对其表达的调节作用

目的：观察肝癌（HCC）组织及细胞系PML蛋白表达和三氧化二砷（As2 O3）对HCC PML蛋白表达的调节作用。方法免疫组织化学法检测不同分化程度HCC组织PML蛋白表达水平，Western blot分析12例 HCC患者的癌组织，和 HuH7、HepG2、Hep3B、SMMC-7721、MHC97H等5种 HCC细胞系PML蛋白表达情况。观察低浓度As2O3处理72～96 h后，HuH7， HepG2，Hep3B、SMMC-7721、MHC97H细胞PML蛋白表达变化。结果免疫组织化学染色显示，HCC组织中细胞核、细胞质均有不同程度PM L蛋白表达，细胞内分布不均匀。高分化、中分化和低分化 HCC组织 PM L 蛋白表达差异不明显。Western blot分析发现12例HCC组织均有不同程度PML蛋白表达，而且各例 HCC的PML蛋白表达量不同。 HuH7、HepG2、Hep3B、SMMC-7721和MHC97H等5种细胞系均表达PML蛋白，而且PML蛋白灰度相差很小。 HuH7、HepG2、Hep3B、SMMC-7721、MHC97H经过0．25μg/mL的As2O3培养72～96 h后PML蛋白表达明显减少，As2O3可以下调肝癌细胞PML蛋白表达。结论 HCC组织和细胞系存在PML蛋白表达，而且As2O3可以调控肝癌细胞PML蛋白表达，PML蛋白可能是As2O3治疗肝癌的靶分子。