超抗原SEA联合PML-RARα对外周血T细胞TCR Vβ亚家族基因表达的影响

目的探讨超抗原SEA联合PML-RARα多肽对外周血T细胞TCR Vβ亚家族基因表达的影响。方法分别将SEA、PML-RARα多肽以及SEA联合PML-RARα多肽与正常人外周血单个核细胞共同培养,20d后收集增殖细胞,利用RT-PCR及基因扫描技术分析诱导后增殖T细胞TCRVβ亚家族的利用和克隆性增殖的特点。结果单纯SEA诱导后,T细胞表达了11个TCR Vβ亚家族,且仍为多克隆增殖。单纯PML-RARα多肽诱导后,T细胞限制性表达8个Vβ亚家族,其中Vβ13、Vβ14表现出寡克隆或寡克隆趋势。PML-RARα多肽联合SEA共同诱导,其T细胞表达TCR Vβ亚家族依然呈明显的限制性,且Vβ13、Vβ14亚家族呈寡克隆、双克隆及寡克隆趋势。结论SEA能协同PML-RARα多肽诱导的T细胞克隆性活化与增殖。

PML-RARα及RARα融合蛋白在三硫化二砷诱导的NB4细胞凋亡中的作用研究

为研究PML RARα及RARα融合蛋白在三硫化二砷 (As2 S3 )诱导的人早幼粒细胞白血病细胞系NB4细胞凋亡中的作用 ,本研究应用细胞形态观察、流式细胞术测定及DNA电泳等方法观察三硫化二砷对NB4细胞的诱导凋亡作用 ,用染色体G显带技术、反转录PCR及Western印迹测定这一过程中PML RARα融合基因及其表达产物、野生型RARα蛋白的变化。结果表明 ,三硫化二砷在 0 .5 - 2 μmol/L之间能诱导NB4细胞凋亡 ,在此过程中PML RARα融合基因无明显变化 ,但PML RARα融合蛋白和野生型RARα蛋白明显减少。结论提示PML

超抗原SEA增强PML-RARα多肽体外诱导特异性CTL杀伤活性的机制

目的探讨超抗原SEA体外增强PML-RARα多肽诱导特异性CTL杀伤活性的机制。方法分别将SEA、PML-RARα多肽以及SEA联合PML-RARα多肽与正常人外周血单个核细胞共同培养,利用CCK-8比色法检测诱导后T细胞对NB4和K562细胞株杀伤活性,同时利用流式细胞术测定诱导T细胞表面CD4与CD8表达情况。结果诱导后第20天,SEA能明显增强PML-RARα多肽特异性杀伤NB4细胞株的作用。诱导后第5、10、20天动态检测表明,多肽及SEA联合多肽组CD4+/CD8+比值逐渐降低,其中SEA联合PML-RARα多肽诱导组降低最显著。结论超抗原SEA能明显增强PML-RARα多肽体外诱导特异性CD8+T细胞的增殖与特异性的杀伤作用。

硒化壳聚糖通过下调PML-RARα融合蛋白对急性早幼粒白血病NB4细胞增殖和凋亡的作用

目的研究硒化壳聚糖对急性早幼粒白血病细胞株NB4增殖和凋亡的影响及其与PML-RARα融合蛋白表达的关系。方法应用MTT法检测硒化壳聚糖对细胞增殖的影响，电镜下观察药物诱导细胞凋亡作用，应用Western印迹法检测细胞PML－RARα融合蛋白含量的变化。结果硒化壳聚糖对体外培养的NIM细胞可产生剂量和时间依赖性的抑制作用，50～100mg／L硒化壳聚糖作用NIM细胞24h可诱导细胞出现明显的凋亡现象，经硒化壳聚糖作用24h后，NB4细胞内PML—RARα融合蛋白含量明显减少。结论硒化壳聚糖可通过百调PML-RARα融合蛋白含量对NB4细胞产生抑制增殖和诱导凋亡作用。

丹参酮ⅡA诱导NB4细胞分化与PML-RARα融合蛋白的关系

背景与目的:目前研究证实丹参酮ⅡA(TanⅡA)对白血病细胞具有抑制增殖、诱导分化和促凋亡的作用,但其具体作用机制尚不明确。本实验旨在研究TanⅡA与全反式维甲酸(all-tram retinoid,ATRA)及三氧化二砷(As2O3)诱导NB4细胞分化在细胞形态学、免疫表型和对PML-RARα融合基因及其蛋白影响的比较。方法:采用免疫荧光法观察NB4细胞内PML蛋白,Western blot检测PML-RARα融合蛋白,实时定量PCR方法检测PML-RARαmRNA;同时计算细胞生长抑制率,观察细胞形态学、免疫表型的变化。结果:TanⅡA能抑制NB4细胞生长,诱导分化,使NB4细胞PML蛋白异常分布重新定位、NBs结构恢复、PML-RARα融合蛋白降解。结论:降解PML-RARα融合蛋白可能是TanⅡA诱导NB4细胞分化的机制。

硒化壳聚糖通过下调PML-RARα融合蛋白来对NB4细胞产生抑制增殖和诱导凋亡作用(英文)

目的研究硒化壳聚糖对急性早幼粒白血病细胞株NB4增殖和凋亡的影响,探讨这种影响与PML-RARα融合蛋白表达的关系。方法应用MTT法检测硒化壳聚糖对细胞增殖的影响,应用AO/EB荧光染色法共聚焦显微镜下观察诱导凋亡作用,应用Western blot的方法检测细胞PML-RARα融合蛋白含量的变化。结果硒化壳聚糖可对体外培养的NB4细胞产生剂量和时间依赖性的抑制作用,50 mg/L至100 mg/L硒化壳聚糖作用NB4细胞24 h可诱导细胞出现明显的凋亡现象,经硒化壳聚糖处理24 h后,NB4细胞内PML-RARα融合蛋白含量明显减少。结论硒化壳聚糖可通过下调PML-RARα融合蛋白含量对NB4细胞产生抑制增殖和诱导凋亡作用。

儿童急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因的动态观察

目的 探讨儿童急性早幼粒细胞白血病 (APL)PML RARα融合基因转阴的速率与治疗方案的关系。方法 1 0例患儿给全反式维甲酸 (ATRA)诱导分化 ,HOAP(三尖杉酯碱、长春新碱、阿糖胞苷、强的松 )或DA(柔红霉素、全反式维甲酸 )巩固治疗 ,三联序贯疗法维持强化。治疗不同阶段用RT/PCR法检测融合基因。结果 1 .诱导缓解 (CR) 90 % ,持续缓解 (CCR) 80 %。 2 .PML RARα融合基因转阴情况 :4/ 9例转阴CR后 2～ 6个月 ;5/ 9例转阴CR后 1 2～ 32个月 ,首次转阴的总平均时间为CR后 1 4个月。结论 1 .ATRA诱导分化有显著效果 ,但不能清除体内白血病细胞 ,复发率极高。 2 .联合化疗方案 ,融合基因转阴率增高 ,而转阴的速度与化疗方案的强度成正比。 3 .融合基因的暂时转阴 ,说明该病人对化疗敏感 ,可能预后较好。而持续转阴和足够治疗时间 (CCR 4年以上 )

PML-RARα多肽和NB4细胞体外诱导CTL细胞杀伤活性分析

目的了解PML-RARα多肽和NB4细胞体外诱导体外诱导增殖的T细胞的特异性细胞毒作用.方法采用混合淋巴细胞/肿瘤细胞培养(MLTC)方法,经丝裂霉素C处理的NB4细胞或PML-RARα多肽(LSSCITQGKAI-ETQSSSSEE)作为刺激原体外诱导脐血单个核细胞增殖.利用LDH方法检测诱导后T细胞的细胞毒性.结果PML-RARα多肽诱导组第10d和第15d T细胞对NB4细胞的杀伤活性为:49.65±6.7%(p<0.01)和73.13±8.42%(p<0.01),NB4细胞诱导组第10d和第15d T细胞对NB4细胞的杀伤活性为:53.33±8.82%(p<0.01)和74.46±9.57%(p<0.01),而无诱导组的第10d和第15d T细胞对NB4细胞的杀伤活性为:15.93±9.25%和38.19±10.54%,前两组T细胞对NB4细胞的杀伤作用均明显高于对照组.结论PML-RARα多肽和NB4细胞体外可诱导出特异性T细胞,他们对表达PML-RARα的NB4细胞具有选择性杀伤作用.

实时定量RT-PCR检测PML-RARα融合基因诊断APL的临床价值

目的探讨一步法实时定量RT-PCR(RQ-RT-PCR)技术在急性早幼粒细胞白血病(APL)患者诊断及微小残留病(MRD)检测中的临床价值。方法应用一步法RQ-RT-PCR、Taqman探针技术检测42例APL初诊患者和30例完全缓解(CR)患者骨髓PML-RARα融合基因的两种常见异构体转录本mRNA的表达。同时采用多参数流式细胞术(FCM)对部分患者骨髓MRD进行检测,并比较两种检测方法的一致性。结果①42例APL初诊患者的PML-RARα融合基因转录本中位标准拷贝数(NCN)为61%(13%～284%),其中L型34例,S型8例。L型和S型异构体中位NCN分别为56%(28%～278%)和70%(13%～284%),两者比较,P>0.05;②30例APL患者经标准诱导治疗CR后PML-RARα融合基因转录本中位NCN为4.00%(0.00%～8.26%);③一步法RQ-RT-PCR和FCM同时检测结果有较好的一致性(χ2=0.278,P=0.598),总符合率83.3%。结论一步法RQ-RT-PCR具有操作简便、特异性好、灵敏度高、结果可靠、直观等特点,有利于对APL的诊断和MRD检测。

pIRES-PML-RARα-hIL-2重组质粒的构建和表达研究

目的构建PML-RARα融合基因与人白介素-2(hIL-2)基因真核双表达质粒。方法利用RT-PCR技术从NB4细胞的RNA中扩增出PML-RARα融合点附近的部分基因片段,通过RT-PCR扩增Jurkat细胞中的hIL-2基因,并分别将两基因片段连接到pIRES质粒的多克隆位点(MCS)A和B中,构建真核双表达质粒。利用酶切和序列分析方法验证所构建质粒的正确性。将构建成功的重组质粒转染A549细胞,通过RT-PCR检测重组质粒在真核细胞中的转录情况,利用点杂交、ELISA检测目的蛋白的表达情况。结果NheⅠ/MluⅠ和SalⅠ/NotⅠ双酶切证明重组质粒中含有相应大小的PML-RARα基因片段及hIL-2基因,序列分析证明重组质粒中插入片段的碱基序列均完全正确。将所构建的pIRES-PML- RARα-hIL-2质粒转染A549细胞后经RT-PCR鉴定表明,插入到重组质粒中的PML- RARα和hIL-2基因能够在真核细胞中进行正常转录。经点杂交和ELISA检测显示重组质粒在真核细胞中可表达hIL-2蛋白。结论成功构建了pIRES-PML-RARα-hIL-2质粒,该重组质粒能够在真核细胞中正常转录并表达PML—RARα和hIL-2蛋白。

SEA对PML-RARα多肽体外诱导外周血单个核细胞TCRζ链表达的作用

目的:了解金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)联合PML-RARα融合多肽体外诱导正常人外周血T细胞活化TCRζ链基因表达情况。方法:利用T细胞液体培养法分别与正常人外周血淋巴细胞加入PML-RARα融合多肽、SEA和SEA联合PML-RARα多肽诱导培养T细胞,其中SEA刺激包括培养初始或培养第5天加入SEA两组(PS、PSI),并设空白对照组(不加多肽及SEA)。分别收集各组培养20 d后细胞提取mRNA并合成cDNA,采用SYBR G reenⅠ荧光定量PCR和相对定量检测TCRζ链在不同组别T淋巴细胞中的表达情况,以β2微球蛋白基因(β2M)作为内参,根据相对定量公式:2-△△C t分析TCRζ链表达差异。结果:与空白组相比,联合诱导组在培养初始加入SEA及第5天加入SEA的培养T细胞中TCRζ链表达上升,而单独SEA诱导组的TCRζ链表达下降。结论:超抗原SEA联合PML-RARα多肽体外诱导T细胞可使TCRζ链基因表达水平升高,有望为研制急性早幼粒细胞白血病疫苗提供新的切入点。

丹参酮ⅡA诱导NB_4细胞分化凋亡与PML-RARα融合蛋白的关系

目的 探讨丹参酮ⅡA (TanⅡA )诱导NB4细胞分化和凋亡过程中PML RARα融合蛋白变化及其与细胞分化、凋亡的关系。方法 采用免疫荧光法检测PML RARα融合蛋白的变化 ;同时计算细胞生长抑制率 ,观察细胞形态学变化 ,进行NBT还原实验 ,采用流式细胞术检测细胞凋亡和分析细胞周期。结果 TanⅡA能减少NB4细胞中微小荧光颗粒数 ,恢复NBs大斑点荧光颗粒 ,作用 72h后颗粒数减少最明显 ;同时 ,TanⅡA能提高细胞生长抑制率、诱导分化 ,增强NBT还原能力和提高凋亡细胞比率 ,降低细胞增殖指数 ,作用 12 0h后细胞分化和凋亡作用最强。结论 PML

比较丹参酮ⅡA、ATRA和As_2O_3对NB_4细胞PML-RARα融合蛋白作用的规律

目的 :比较丹参酮ⅡA、ATRA和As2 O3 对NB4细胞PML -RARα融合蛋白作用的规律 ,探索TanⅡA降低PML -RARα融合蛋白水平的原因。方法 :药物作用 2 4、 72、 12 0h ,用间接免疫荧光方法检测PML -RARα融合蛋白的变化。结果TanⅡA影响NB4细胞PML -RARα荧光染色颗粒的规律与ATRA作用一致 ,与As2 O3 作用不一致。结论 :TanⅡA可能通过激活caspase裂解PML -RARα融合蛋白或通过PML -RARα融合蛋白中RARα的AF - 2部分而降解PML -RARα融合蛋白 ,致PML -RARα融合蛋白水平降低 ,NB4细胞分化。

急性早幼粒细胞白血病患者外周血单个核细胞PML-RARα融合基因检测和意义

目的:探讨PML-RARα融合基因与急性早幼粒细胞白血病(APL)的相关性。方法:利用实时荧光定量PCR检测50例APL患者血液标本(骨髓/外周血)中PML-RARα融合基因含量,30例健康体检者作为正常对照组。结果:50例APL患者血液标本中PML-RARα融合基因含量阳性47例(94%;47/50),阴性3例(6%;3/50)。正常对照组均阴性,APL组阳性率明显高于正常对照组,差异具有统计学意义。30例治疗后血液学完全缓解的患者治疗前后进行PML-RARα融合基因的检测,其中25例患者(25/30;83.3%)的PML-RARα融合基因拷贝数较治疗前有明显降低,差异具有统计学意义。另16.7%(5/30)患者复发时PML-RARα融合基因拷贝数明显增高,与初诊时无明显差异。结论:检测PML-RARα融合基因对APL患者在诊断、疗效观察和预后判断等方面都具有重要意义。

急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因的检测及其临床意义

目的 探讨 PML - RARα融合基因检测对急性早幼粒细胞白血病 (APL )诊断的意义。方法 RT- PCR检测 PML - RARα融合基因表达。结果 (1) APL患者 32例中 2 6例 PML - RARα融合基因阳性 ,其中 L型 10例 ,S型 10例 ,L型 +S型 6例。 (2 ) 1例 M3患者伴 t(9;17)染色体易位 ,PML - RARα融合基因 L型和 S型均阳性 ,未见报道。结论 存在 PML - RARα融合基因 L型和 S型均阳性的 M3。 PML -

检测急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因的DNA传感器研制

利用共价键合法,将氨基修饰的具有急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因特异性的单链DNA探针固定在玻碳电极表面,构成急性早幼粒细胞白血病DNA传感器(急粒DNA传感器)。以电活性的芦荟大黄素(AE)为杂交指示剂,考察了杂交温度及传感器的特异性、重现性和检出限等性能。结果表明:AE在裸电极上的吸附常数为(4.5±0.2)×105L.mol-1,与单链DNA修饰的玻碳电极(ssDNA/GCE)和双链DNA修饰的玻碳电极(dsDNA/GCE)结合常数分别为(2.1±0.4)×105和(2.7±0.2)×105L.mol-1。这种新型的DNA传感器具有特异性强、灵敏度高和重现性好的优点。应用此方法于临床血清分析,初步探索了将该法应用于临床检测的可行性。

PML-RARα-hIL-2 DNA疫苗诱导BALB／c小鼠的细胞和体液免疫应答

目的分析PML-RARα融合基因疫苗诱导小鼠特异体液和细胞免疫应答情况。方法用成功构建的重组质粒(pIRES-PML-RARα-hIL-2)免疫小鼠后,分别利用ELISA法检测小鼠血清中INF-γ生成情况;LDH释放法检测小鼠脾细胞特异性CTL细胞针对APL细胞株NB4的杀伤率;用间接免疫荧光法检测血清中抗PML-RARα抗体。结果免疫后第7周时,小鼠血清中INF-γ含量、抗PML-RARα抗体及脾脏CTL细胞针对NB4的杀伤率均高于对照组。结论所构建的pIRES-PML-RARα-hIL-2重组质粒可诱导小鼠产生了特异性体液和细胞免疫应答。

PML-RARα-hIL-2 DNA疫苗免疫BALB／c小鼠后胸腺初始T细胞水平变化

目的了解PML-RARα-hIL-2基因疫苗免疫小鼠后胸腺初始(na(?)ve)T细胞变化情况。方法利用实时定量PCR检测小鼠胸腺组织DNA中T细胞受体删除DNA环(TRECs)的水平,从而评价小鼠胸腺中na(?)ve T细胞含量。结果利用PML- RARα-hIL-2 DNA疫苗免疫小鼠后胸腺中所含的TRECs拷贝数明显高于单个基因疫苗PML-RARα或hIL-2组及对照组。结论所构建的PML-RARα-hIL-2双表达质粒可诱导小鼠胸腺产生na(?)ve T细胞数量增加,可能与产生更强的细胞免疫应答有关。

PML-RARα/pIRES和PML-RARα/pSecTag重组载体的构建和鉴定

目的构建PML-RARα基因重组表达质粒,为发展PML-RARα基因疫苗提供实验依据。方法利用RT-PCR方法从急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞中扩增出465bp的位于PML-RARα融合基因的框内结构的片段,克隆至真核表达载体pIRES和分泌载体pSecTag后,经酶切和序列分析鉴定重组质粒的构建情况。结果经酶切鉴定和序列测定表明,PML-RARα目的基因已正确插入真核表达载体中,构成了目的重组载体。结论成功构建了PML-RARα/pIRES和PML-RARα/pSecTag重组真核表达质粒,可进一步用于PML-RARα基因疫苗的实验研究。

丹参酮ⅡA作用NB_4细胞时PML-RARαmRNA与细胞分化和凋亡的关系

目的 研究丹参酮ⅡA(Tan ⅡA)诱导NB4细胞分化和凋亡时PML-RAR α mRNA与细胞分化、凋亡的关系。方法用NBT还原实验和细胞表面特异性标记CD11b、CD33的表达检测细胞分化,用流式细胞术进行细胞周期和细胞凋亡分析,用巢式RT-PCR法检测NB4细胞中PML-RAR α mRNA。结果Tan ⅡA能增强NBT还原能力、升高CD11b而降低CD33、降低细胞增殖指数、增加凋亡细胞,但不影响PML-RAR α mRNA表达。结论 Tan ⅡA诱导细胞分化和凋亡,而不抑制PML-RAR α融合基因转录。