甜樱桃茎尖培养及PNRSV的RT-PCR检测

研究了茎尖大小、接种方式、培养基成分、试材基因型对甜樱桃品种茎尖培养的影响。 1年生成熟枝条上茎尖成苗率为 8.3%～ 2 3.7% ,嫩梢上的茎尖成苗率为 2 7.3%～ 37.5 %。利用RT PCR技术对部分甜樱桃试管苗进行了早期病毒鉴定 ,筛选出一些不带李坏死环斑病毒 (PNRSV)的甜樱桃试管苗 ,并证明甜樱桃试管苗微茎尖培养不能有效脱除PNRSV。

李属坏死环斑病毒怀柔分离物(PNRSV-HR)外壳蛋白基因片断的克隆与序列分析

应用RT-PCR方法检测了采自北京市怀柔区的樱桃叶片,将此PCR扩增产物连接到pMD18-T载体上,通过转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,克隆了含有目的片段的重组质粒,并进行序列测定和分析。序列分析结果表明,认为该分离物外壳蛋白基因片断与李属坏死环斑病毒的NRSiz8株系的同源性最高,为98%,与德国分离物Ring17的同源性达99%;通过进化关系分析,认为该分离物属于引起温和症状的group,认为该分离物的第5,62,81和126位氨基酸也与CH9血清型引起温和症状的保守的替换相同。

李属坏死环斑病毒(PNRSV)RT-LAMP检测方法的建立

针对李属坏死环斑病毒(PNRSV)外壳蛋白(CP)基因保守序列,设计了1套特异性识别CP基因中6个不同区段的环介导等温扩增(LAMP)引物。通过对反应条件的优化,建立了适用于PNRSV的RT-LAMP检测技术,对优化后的方法进行特异性、灵敏度评价。结果显示,此方法能够特异性的检测出PNRSV,对马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、黄瓜花叶病毒(CMV)、蚕豆萎蔫病毒(BBWV)的检测均为阴性,灵敏度高于RT-PCR 10倍。

李属坏死环斑病毒(PNRSV)新疆巴旦木分离物外壳蛋白基因(CP)片断的克隆与序列分析

【目的】为了查明新疆巴旦木果树病原病毒的种类,为病毒的分子检测提供基础。【方法】采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA),从巴旦木果树叶片中检测到李属坏死环斑病毒(PNRSV)。以阳性样品的总RNA为模板进行PNRSV外壳蛋白基因(CP)RT-PCR扩增,对预期430 bp大小的4个扩增产物进行克隆、测序和序列分析。【结果】结果表明,PNRSV新疆巴旦木分离物CP基因的核苷酸和氨基酸序列与世界各地已报道的分离物具有较高的同源性,分别为80.0%～97.2%和80.1%～94.1%,其中与阿根廷分离物AY217的同源性最高;而与同属03亚组的苹果花叶病毒(ApMV)同源性较低,仅为52.9%～55.4%和45.6%～48.6%。新疆PNRSV各分离物之间CP基因高度同源。序列比对与系统发生树的分析显示,PNRSV新疆巴旦木分离物的株系属于GroupⅠ组。【结论】确定了PNRSV为侵染新疆巴旦木果树的病原病毒。这是PNRSV在新疆发现的首次报道。

改良RNA提取法及樱桃PDV和PNRSV的RT-PCR检测(英文)

介绍了一种从木本植物组织中获得高质量RNA的快速、简单和高效的核酸提取方法。该方法是基于核酸的二氧化硅捕获,避免了使用苯酚、氯仿等有机溶剂。利用该方法从樱桃组织中提取的总RNA用RT-PCR技术检测PDV,PNRSV均获得成功。从感病植株的一年生枝的叶片、韧皮部及芽组织中扩增出了预期的目的片段,即172和449bp,而健康组织中无此扩增带。该法提取的总RNA用于RT-PCR技术检测,其敏感性至少与商业出售的QiagenRNeasy提取试剂盒相当,但简单经济。

采用RT-PCR技术检测甜樱桃“红灯”上的PNRSV

[目的]调查大连市特色水果品种甜樱桃“红灯”的田间植株携带PNRSV的情况．[方法]利用作者已建立的PNRSV RT-PCR检测体系．[结果]被检植株PNRSV的感染率达100％,但程度不同．[结论]对于其中感染PNRSV较轻的植株可以作为今后培育无PNRSV苗木的原材料．

3种甜樱桃病毒PNRSV、PDV及LChV-2的多重RT-PCR检测方法的建立与应用

【目的】建立可同时检测李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)、李矮缩病毒(Prune dwarf virus,PDV)、樱桃小果病毒2(Little cherry virus-2,LChV-2)的多重RT-PCR检测方法。【方法】以复合感染3种病毒的甜樱桃病株叶片为材料,采用CTAB法提取样本总RNA,选用随机六聚体引物对植物样本总RNA进行反转录,所得cDNA作为多重RT-PCR的扩增模板。根据GenBank中PNRSV、PDV、LChV-2基因组序列共设计6对特异引物,分别通过单一RT-PCR和多重RT-PCR筛选出可用于同时检测3种甜樱桃病毒的引物组合。对多重RT-PCR的退火温度及循环数进行优化,以筛选出各引物组合的最适扩增条件。分别以单一感染PNRSV、PDV、LChV-2、复合感染3种病毒、单一感染樱桃病毒A(Cherry virus A,CVA)及甜樱桃无毒苗为样本,对多重RT-PCR引物的特异性进行分析。选取复合感染3种病毒的甜樱桃总RNA的反转录产物为初始模板,按照梯度稀释法依次将模板稀释为2、22、23、24、25倍,在相同PCR反应体系及反应条件下分别对各引物组合的灵敏度进行分析。多重RT-PCR的扩增条带经凝胶回收试剂盒回收纯化后连接至pMD18-T vector,克隆测序,以验证多重RT-PCR检测的准确性。并应用该方法对山东泰安地区甜樱桃生产园中间隔栽培的中国樱桃进行检测。【结果】筛选到2个可以应用的引物组合,组合1"PNRSV-S1/A1、PDV-S2/A2、LChV2-S1/A1"可分别特异性地扩增733、467、337 bp的片段。组合2"PNRSV-S1/A1、PDV-S3/A3、LChV2-S1/A1"可分别扩增得到733、265、337 bp的片段。扩增产物大小与预期相符。多重RT-PCR反应条件优化结果显示,在退火温度52℃、35个循环条件下,2个引物组合的检测效果均较为理想。特异性分析结果显示,2个引物组合均能特异性检测其各自的靶病毒。灵敏度分析结果显示,2个引物组合在cDNA的23×稀释液中仍能特异性扩增,但扩增条带的强度稍有差异,其对植物总RNA的反转录产物的最低检测浓度为107.9 ng·μL-1。克隆测序及序列分析表明,2个引物组合对各自靶病毒的检测结果可靠。应用该方法对9个中国樱桃样本进行检测,结果显示,测试样品均至少感染了2种病毒,其中5个样品复合感染了3种病毒,2个样品同时感染PDV和LChV-2,2个样品同时感染PNRSV和LChV-2。【结论】应用建立的多重RT-PCR检测方法可稳定、准确、灵敏的同时检测单一或复合侵染的3种甜樱桃病毒。

PNRSV RT-PCR检测体系的建立与应用

以指示植物GF305和田间果树为试材,建立并优化了特异性强、灵敏度高、成本低的李属坏死环斑病毒(PNRSV)RT-PCR检测体系,使用该优化体系对樱桃树、桃树和杏树中携带PNRSV的情况进行了调查。结果表明,被检材料的李属坏死环斑病毒(PNRSV)感染率均较高,但程度不同。

北京怀柔地区樱桃上发现李属坏死环斑病毒

李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)属雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)等轴不稳环斑病毒属(Ilarvirus),是我国二类检疫性有害生物.PNRSV主要危害李属和蔷薇属植物.如,樱桃、桃、李、月季等.春季感染PNRSV的樱桃早期幼叶会出现深棕色坏死斑和线纹,叶片展开期坏死斑脱落造成穿孔症状.受PNRSV危害后,果树树势减弱,产量降低,甚至死树.我国学者调查陕西、辽宁和山东等省的果树病害时发现并报道了该病毒[1～3].

桃树李坏死环斑病毒的RT-PCR检测方法研究

以桃树叶片为材料提取总RNA,根据PNRSV外壳蛋白基因设计引物,进行RT和PCR扩增,获得良好结果,对目的片段经过克隆测序,与NCBI中报道的PNRSV外壳蛋白基因序列同源性最高达98%。在建立的RT-PCR技术基础上,对RT-PCR体系中的主要影响因子进行了优化研究。

侵染月季的李坏死环斑病毒的检测及CP基因序列分析

Rose leaves with virus symptoms(mosaic,ring spot and line pattern) were detected by DAS-ELISA and RT-PCR.The results showed Prunus necrotic ring spot virus(PNRSV) infection in the leaves.CP gene of PNRSV isolated from Yunnan province was cloned and sequenced.Analysis of sequence showed that CP gene of PNRSV-yunnan contained 683 nucleotides encoding 165 aminoacids(EMBL accession number: AY684271).Nucleotide similarity of CP gene was more than 98% between PNRSV-yunnan and group I isolates,and less than 95% between PNRSV-yunnan and group II and III isolates.According to the results,PNRSV-yunnan was identified as a member of group I.

应用RT-PCR检测歇马杏李属坏死环斑病毒

利用作者已建立的PNRSV RT-PCR检测体系对辽宁省大连市地方特产歇马杏田间植株携带PNRSV的情况进行了调查,结果表明被检植株PNRSV的感染率达83.33%,但带毒程度不同。

侵染昆明玫瑰的李坏死环斑病毒的鉴定及其分子检测

采集昆明地区种植的花叶症状明显的玫瑰样品,运用现代分子生物学技术与常规技术相结合的方法,初步鉴定引起玫瑰花叶病的主要病毒病原为李坏死环斑病毒。该病毒引起玫瑰植株的系统花叶、畸形和皱缩等症状;电镜下病毒粒体为球形,直径为22～23nm;ELISA检测发现该病毒在植株芽、花粉和顶部叶片的浓度最高;同时,根据外壳蛋白的保守区利用Primer5.0设计该病毒的特异引物,对该病毒进行分子检测,得到450bp的预期DNA片断,并在此基础上,进行了巢式RT-PCR的分子检测,表明巢式RT-PCR的检测能力最强。并通过序列的同源性分析得知该病毒的外壳蛋白与已知PNRSV的同源性为98.0%,进一步证明了该病毒为李坏死环斑病毒。

RT-PCR检测李坏死环斑病毒的研究

为了从植物组织中快速检测李坏死环斑病毒 (PNRSV) ,根据该病毒RNA 3序列设计引物 ,对感病和健康组织总RNA进行RT PCR ,结果从感病组织中扩增出了大约 45 0bp的目的片段 ,而健康组织中无此扩增带。将此PCR产物连接到 pGEM T easy载体 ,转化大肠杆菌DH5 5α菌株 ,得到了含有目的片段的重组子 ,并采用双脱氧终止法进行序列分析 ,结果与美国报道的李坏死环斑病毒RNA3序列对应部分核苷酸基本一致 (其同源性达 93.6 %) ,这表明应用RT PCR来检测李坏死环斑病毒是可行的 ;PCR产物克隆作为RT PCR反应的阳性对照解决了检疫对象不能扩散的问题 ,从而建立了RT

浙江海宁月季上发现李属坏死环斑病毒

采用双夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA),对杭州、嘉兴、绍兴3市6县(市、区)的果树园林植物进行李属坏死环斑病毒病的病情调查,采集检测样品包括樱桃、桃、李、杏和月季等12种寄主植物共计102个。结果表明,10个海宁月季样品的ELISA结果呈阳性,其他样品呈阴性;阳性样品经RT-PCR检测和CP基因测序验证,确认海宁月季感染了李属坏死环斑病毒。

李坏死环斑病毒检测方法的比较研究

针对感染李坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)植株病毒的特异性检测,将DAS- ELISA、RT-PCR方法综合改进、优化,建立了免疫捕获反转录PCR(IC-RT-PCR)检测PNRSV的方法.该方法采用PNRSV抗体特异性免疫捕获病毒,并根据GenBank中PNRSV序列设计的特异性引物对PN5/PN3进行PCR扩增,得到约760 bp大小的特异性基因片段.扩增产物经克隆测序后,结果表明:产物序列与PNRSV的外壳蛋白编码基因存在94%～98%的同源性.检测广泛性以及灵敏度比较研究显示.IC-RT-PCR方法能从含量很低的受病样品中检出PNRSV,检测灵敏度与RT-PCR相近,但所检测样品的范围更广,适用于从植物各部位检测低含量的病毒.IC-RT-PCR检测灵敏度比DAS-ELISA方法高出1000倍.

逆转录—聚合酶链式反应技术检测“歇马杏”主要病毒

目的:调查“歇马杏”携带主要病毒的情况。方法:利用作者已建立的ACLSV、PNRSV和PDV RT-PCR检测体系对辽宁省大连市地方特产“歇马杏”田间植株携带三种病毒的情况进行了调查。结果:被检植株ACLSV、PNRSV和PDV的单独感染率分别为83.33%、83.33%和90%,复合感染率达到76.67%,但带毒程度不同。

樱桃李属坏死环斑病毒病发生规律与控制技术研究

对李属坏死环斑病毒病的发生危害特点进行了广泛调查,总结得出该病毒病发生与品种、树龄及地形等环境因子的关系．不同品种间樱桃李属坏死环斑病毒病发病程度存在差异,国外引进品种重于本地品种;不同树龄的樱桃感病率不一,一般来说,树龄越大,发病越重;地形对发病程度也有影响,川道区重于山岭区．选取两个不同的地点,对李属坏死环斑病毒病的药剂防治进行了试验,筛选出防效较好药剂．提出樱桃李属坏死环斑病毒病的综合治理措施．

西安地区樱桃李属坏死环斑病毒病鉴定和田间发生规律

通过实验室鉴定、田间定点监测和大田调查,发现樱桃李属坏死环斑病毒病可通过嫁接、汁液摩擦等途径传播,病毒形态为球形,大小30 nm,无包膜;在西安地区年发生消长历经始发期、快速增长期、稳定期、衰退期4个阶段,一年具有两个发病高峰,相邻年份病害发生差异不大,但有一个缓慢增长的过程。川道、密度大、管理粗放有利于樱桃李属坏死环斑病毒病的发生,目前种植的大樱桃品种发病较重,当地小樱桃品种发病较轻。