PP-1与PP-2A在金鱼眼(球)不同组织/细胞中的表达模式

为确定蛋白磷酸酶-1和-2A(protein phosphatase-1 and phosphatase-2A,PP-1,PP-2A)在水生低等脊椎动物眼球不同组织/细胞中的表达模式,提取金鱼眼球中4种组织视网膜、晶体上皮细胞、晶体纤维和角膜的RNA和蛋白,利用RT-PCR和Western印迹技术进行检测.同时运用荧光免疫组织化学技术进行了定位表达研究.结果表明:1)在mRNA水平上,PP-1催化亚基α和PP-2A催化亚基β在金鱼视网膜、晶体上皮和角膜中表达强烈,与其在高等哺乳类脊椎动物如小鼠中的表达形成鲜明的对比;2)在蛋白水平上,PP-1和PP-2A催化亚基在金鱼视网膜和晶体上皮细胞中的表达较高,而在角膜中的表达最低.这与它们在小鼠眼球视网膜和角膜中同时具备高表达的模式形成对比;3)在金鱼发育48h的眼球中,PP-1和PP-2A催化亚基定位于视网膜的色素视网膜和神经视网膜细胞中,晶体上皮和纤维细胞中及角膜上皮细胞中,而在性成熟金鱼眼球中,此二酶催化亚基主要定位于视网膜的色素视网膜,神经视网膜及晶体上皮细胞中.这些结果为探讨PP-1和PP-2A在金鱼眼球不同组织中的功能打下了重要基础。

逍遥散对大鼠阿尔茨海默病模型前额叶皮质PP-2A和GSK-3β的影响

目的:探讨逍遥散对阿尔茨海默病大鼠模型前额叶皮质相关指标的影响。方法:将清洁级4～5个月龄SD雄性大鼠随机分为4个组,模型组(B组)、西药组(C组)、中药组(D组)分别采用D-半乳糖腹腔注射和A-β1～42peptide双侧海马注射联合造模[用药剂量:D-半乳糖10 mL(100 mg·kg-1),每日1次,连续注射42 d;A-β每侧海马组织1次性注射2μL(10μg)],生理组(A组)仅用等体积生理盐水做相同的造模处理。造模完成后,C、D组每日分别用奥拉西坦溶液0.75 g·kg-1和逍遥散煎剂10.g-1ig干预,1次/d,连续28 d,用药体积均为5 mL·kg-1;A,B组采用等体积的生理盐水ig。ig结束后,4个组分别进行Y迷宫行为学检测,并对比分析。之后断头剥离前额叶皮质送检。结果:B,C,D两组与B组比较,其尝试次数和行为正确率均占明显优势,差异具有统计学意义(尝试次数P<0.05;行为正确率P<0.01);B组与A组比较,尝试次数和行为正确率降低,差异具有统计学意义(尝试次数P<0.05;行为正确率P<0.01);降低C、D组与A组比较差异无统计学意义。免疫组化染色显示,与B组比较,C组和D组PP-2A阳性细胞数量表达均明显增加,而GSK-3β阳性细胞数量表达均明显减少。结论:逍遥散能改善AD大鼠的空间记忆能力,与其能够上调AD大鼠前额叶的PP-2A的表达、抑制前额叶的GSK-3β的表达有关。

蛋白磷酸酯酶-1和-2A抑制剂对NG108-15细胞tau蛋白磷酸化的影响

Alzheimer痴呆(AD)的主要脑病理变化之一为由超磷酸化的tau蛋白组成的神经原纤维缠结(Neurofibrillary tangle,NFT)。AD的Tau蛋白异常磷酸化与蛋白磷酸酯酶(PP)-2A和-1缺陷有关。本文首先用免疫印迹法显示NG含两大组分的tau蛋白。MTT方法观察到PP-2A和PP-1抑制剂冈 田酸(Okadaic acid.OA)处理NG108-14细胞能导致细胞代谢明显下降,同时免疫印迹法显示OA能导致的NG细胞Tau蛋白磷酸化。该研究为建立AD样蛋白磷酸酯酶缺陷引起的tau蛋白磷酸化的细胞模型奠定了基础。

金鱼PP2A调节亚基PR55γ基因的克隆及表达分析

蛋白磷酸酶2A是一种重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶,对于调控多细胞的生命活动起重要作用。以金鱼大脑为材料,运用RT-PCR技术克隆得到PP2A调节亚基B55家族中PR55γ基因编码区部分序列。结果显示PR55γ基因cDNA长1218 bp,编码的多肽共含405个氨基酸。序列分析表明,该基因编码的蛋白与已知其他物种对应的PR55γ蛋白质均有着很高的同源性。用RT-PCR的方法检测了PR55γ基因在金鱼不同组织和胚胎发育不同时期的mRNA表达水平。结果表明,PR55γ基因表达呈现明显的组织和胚胎发育阶段差异性。在成体组织中,仅在大脑和鳍中有表达。在胚胎发育过程中,PR55γ从神经胚开始出现,整体呈现上升趋势,在出膜期达到最高水平。据此推测,PR55γ基因可能在金鱼胚胎发育中具有多种重要作用。

水稻磷酸酯酶2A基因蛋白的原核表达载体构建、表达和纯化

利用PCR技术,从水稻品种日本晴幼穗cDNA中扩增磷酸酯酶2A的基因ORF片段,并将其克隆入原核表达载体pGEX-6p-1中构建重组质粒pGEX-6p-1-PP-2A,经限制性内切酶酶切鉴定以及测序结果表明成功构建了原核表达载体pGEX-6p-1-PP2A,转化E.coliJM109并通过终浓度为0.4mmol/L的IPTG诱导,表达出39kD的GST-PP2A融合蛋白,并用蛋白亲和层析柱GSTrap FF对表达产物进行纯化,为下一步的研究打下了实验基础。

冈田酸所致微管相关蛋白tau Ser396位点过度磷酸化抑制细胞凋亡

目的探讨磷酸酯酶活性降低致tau过度磷酸化与细胞凋亡的关系。方法稳定表达人tau cDNA的鼠成神经瘤细胞(N2a/tau)分3组,对照组不处理;十字孢碱(staurosporine,STP,凋亡诱导剂)处理6h为STP组;用磷酸酯酶PP-2A的抑制剂冈田酸(okadaic acid,OA)处理4h,再用STP处理6h为OA+STP组。流式细胞仪检测凋亡率,免疫印迹检测Ser396位点磷酸化tau(Ser396 p-tau)和总tau的表达,免疫荧光双标检测Ser396 p-tau的阳性产物与活化的半胱氨酸蛋白酶(Cleaved Caspase-3)阳性产物的共定位关系。结果①凋亡率:对照组为(4.37±1.47)%,STP组为(19.84±3.25)%,OA+STP组为(12.12±2.46)%;②免疫印迹:OA+STP组Ser396 p-tau的表达明显高于另两组,总tau表达组间无差异;③免疫荧光双标:进一步印证免疫印迹结果,且3组均显示活化的Caspase-3和Ser396 p-tau阳性产物大多不共定位于相同细胞。结论PP-2A活性降低所致tau Ser396位点的过度磷酸化可抑制细胞凋亡,结合前期的实验进一步明确特殊位点过度磷酸化的tau可抑制细胞进入快速的凋亡程序。

虾青素缓解Tau蛋白过度磷酸化减轻视神经放射性损伤的分子生物学机制探讨

目的分析视神经放射性损伤的分子生物学机制及虾青素对Tau蛋白过度磷酸化减轻效果。方法选取64例离体培养鼠视网膜神经节细胞株RGC-5培养的神经元,30 Gyγ射线电离辐射,随机选择64个细胞培养小室,根据有无虾青素滴加分为虾青素标准品组及无虾青素标准品组各32个,观察两组照射后12 h、24 h、48 h、1周后Tau蛋白激酶、GSK-3β蛋白、PP-2A蛋白表达差异。结果同组不同时间比较可见虾青素标准品组照射后随时间增长,Tau蛋白激酶、GSK-3β蛋白有所下降,PP-2A蛋白表达有所上升,这种变化在无虾青素标准品组表现不明显(P>0.05),同时间组间比较照射后不同时间虾青素标准品组Tau蛋白激酶、GSK-3β蛋白表达低于无虾青素标准品组,而PP-2A蛋白表达高于无虾青素标准品组,数据经统计学处理,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论虾青素能够有效降低GSK-3β蛋白的表达及提高PP-2A蛋白表达,降低γ射线电离辐射致Tau蛋白过度磷酸化,从而可能对抑制Tau蛋白过度磷酸化而预防电离辐射对视神经的损伤。

补肾益智方对AD动物模型大脑神经元Tau蛋白及其相关酶类的影响

目的 :观察补肾益智方对AD动物模型大脑神经元磷酸化Tau蛋白及其相关酶类蛋白磷酸酶 1(PP 1)、蛋白磷酸酶 2A(PP 2A)的影响。方法 :用Wistar大鼠 80只以D 半乳糖腹腔注射 4周加上鹅膏覃酸 (ibotenicacid ,IBO)脑内Meynert核注射制造AD模型 ,随机分成AD模型组、双益平对照组、补肾益智方高、低剂量治疗组加上正常老年组和正常青年组总共设立六个组别。动物经治疗处理 6周后 ,应用免疫组织化学方法检测大鼠海马CA1和齿状回磷酸化Tau蛋白、PP 1、PP 2A神经元数目和光密度。结果 :AD模型组海马内神经元的Tau蛋白过度磷酸化而相互集结 ,形成成对螺旋细丝 ,表达脱Tau蛋白磷酸化的磷酸酯酶PP 1、PP 2A均明显减少 ;而补肾益智方治疗组可以使这种现象得到明显改善。结论 :补肾益智方能较有效地改善AD大鼠脑内神经元的Tau蛋白过度磷酸化 ,促进PP 1、PP 2A的表达。

逍遥散对大鼠阿尔茨海默病模型海马CA1区相关指标的影响

目的：研究逍遥散对阿尔茨海默病模型海马CA1区相关指标的影响。方法：将清洁级SD雄性大鼠按随机数字表法分为生理组（A组）、模型组（B组）、西药组（C组）、中药组（D组）,B、C、D 3组采用D-gal腹腔注射和A-β1~42peptide双侧海马注射联合造模,A组用等体积灭菌生理盐水做相同方法造模。造模结束后,每天上午9∶00对各组大鼠进行灌胃给药干预,每日灌胃1次,连续干预治疗28 d,灌胃体积均为0.5 mL/100 g。A、B组均采用生理盐水灌胃,C、D组分别采用奥拉西坦溶液和逍遥散煎剂灌胃。结果：经药物干预后,D组PP-2A阳性细胞数量较B组明显增加（P〈0.05）,阳性物面积、MOD、IOD均有明显增加（P〈0.01）;D组GSK-3β阳性细胞数量较B组明显下降（P〈0.05）,阳性物面积、MOD、IOD明显下降（P〈0.01）。结论：逍遥散抑制动物海马GSK-3β的表达,进而增强PP-2A的表达,从而逆转Aβ诱导的tau蛋白过度磷酸化,对记忆、认知障碍起到积极的调节作用。

柴胡疏肝散对阿尔茨海默病大鼠记忆功能的相关研究

目的:探讨柴胡疏肝散在阿尔茨海默病(Alzheimer's diseas,AD)治疗中的意义。方法:大鼠随机分6组,其中模型组(C),柴胡疏肝散低剂量和高剂量组(D,E),补肾组(F)均采用D-半乳糖(ip)和β-淀粉样蛋白(Aβ)双侧海马注射联合造模,Aβ造模成功后的第9 d,D,E组分别ig给予柴胡疏肝散10,20 g·kg-1,F组给予脑力宝20 g·kg-1。各组均在每天上午9:00按10 mL·kg-1的容积ig给药,连续ig 28 d。ig前后分别进行水迷宫行为学检测,最后处死动物取海马进行相关指标信使RNA(mRNA)表达的相对含量测定。结果:柴胡疏肝散高剂量组ig前后迷宫寻找平台时间分别为(17.34±3.35),(12.78±2.54)s,补肾组分别为(17.79±2.25),(14.11±2.66)s,2组ig前后比较及ig后与同期的模型组比较均有显著差异(P<0.01)。给药后,2组海马蛋白质磷酸酶-2A(PP-2A)mRNA的表达值分别为(0.230 4±0.035),(0.199 4±0.022 2),与模型组(0.099±0.028 8)比较明显增加(P<0.01),而细胞周期依赖性蛋白激酶5(CDK-5)和糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)mRNA的表达高剂量组,补肾组比较及高剂量,低剂量组比较均明显降低(P<0.01)。结论:柴胡疏肝散通过抑制动物海马GSK-3β,CDK-5表达而增强PP-2A的表达,可以逆转Aβ诱导的tau蛋白过度磷酸化,从而对记忆、认知障碍起到积极的调节作用。