miR-27b/PPARγ2轴对小鼠胚胎成骨前体细胞增殖和成骨细胞分化的意义

背景:先前的研究证实了miR-27b在脂质水平的作用,可以控制多个对血脂异常有重要影响的基因,推测miR-27b可能通过靶向PPARγ2在骨质疏松症中发挥作用。目的:探讨miR-27b/PPARγ轴在地塞米松诱导小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1细胞建立骨质疏松症细胞模型中的影响及相关作用机制。方法:体外地塞米松诱导MC3T3-E1细胞后,通过Lipofectamine^(■)2000转染miR-27b模拟物、miR-27b抑制剂、NC-模拟物、NC-抑制剂、siPPARγ2、siNC,使用二甲基亚砜处理作为对照。细胞诱导培养后,检测细胞活性、碱性磷酸酶活性以确定细胞成骨、分化水平;实时荧光定量PCR法和Western blot法检测成骨分化基因miR-27B、PPARγ2、Runx2、骨形态发生蛋白2和骨钙素的mRNA及蛋白表达水平;生信分析预测miR-27b下游靶基因,并用双荧光素酶基因报告实验验证。结果与结论:①地塞米松处理显著降低了MC3T3-E1细胞的活力和miR-27b表达水平;与二甲基亚砜相比,地塞米松处理在24和48 h显著抑制MC3T3-E1细胞的活力并显著下调了miR-27b的表达水平;②miR-27b可直接调控PPARγ2;与相应的NC相比,miR-27b模拟物显著上调了miR-27b的表达水平,而miR-27b抑制剂显著下调了miR-27b的表达水平;与相应的NC相比,PPARγ2 mRNA和相应蛋白质表达被miR-27b模拟物抑制,并被miR-27b抑制剂显著增强;③miR-27b过表达减弱了地塞米松抑制MC3T3-E1细胞的增殖和成骨分化;与二甲基亚砜+NC-mimic组相比,地塞米松显著抑制成骨细胞分化;而地塞米松介导的抑制作用则被miR-27b模拟物所逆转,细胞碱性磷酸酶活性和骨形态发生蛋白2、Runx2和骨钙素蛋白表达水平部分恢复;④抑制miR-27b通过上调PPARγ2抑制MC3T3-E1细胞的增殖和成骨分化;miR-27b的敲除明显增加了PPARγ2的表达,并降低了细胞活力、成骨细胞分化、碱性磷酸酶活性以及骨形态发生蛋白2、Runx2和骨钙素的表达水平;PPARγ2可能是miR-27b的直接作用靶点。

三个猪种PPARγ2基因的多态性分析

PPARγ2基因在机体脂质代谢方面有重要作用。本实验以杜长大猪、晋汾白猪、新山西黑猪为研究对象,采用PCR-RFLP方法对PPARγ2基因Bsr1位点多态性进行研究。结果显示,PPARγ2基因Bsr1位点在杜长大猪中有BB、bb、Bb三种基因型,在晋汾白猪中有BB、Bb两种基因型,在新山西黑猪中只有BB一种基因型。应用PopGen32软件进行遗传学分析,结果表明PPARγ2基因Bsr1多态性位点在杜长大猪、晋汾白猪中均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。利用SAS 8.1进行基因型分布差异分析,显示PPARγ2基因Bsr1多态性位点在三个猪种群体中基因型分布差异极显著(P<0.01)。本实验为猪血常规指标研究及PPARγ2基因的多态性分布提供一些材料。

PPARγ2基因Pro12Ala多态性与上海地区2型糖尿病的相关性

目的 探讨过氧化物酶增殖体激活受体-γ2(PPARγ2)基因外显子2的Pro12Ala多态性与上海地区汉族人2型糖尿病及肥胖之间的关系。方法 应用聚合酶链式反应-直接测序技术,对178例2型糖尿病患者和183例正常对照者PPARγ2基因Pro12Ala多态性位点进行基因分型。结果 Pro12Ala多态性的基因型频率PP:PA:AA在2型糖尿病组和正常对照组中分别为92.7％:6.7％:0.6％和86.9％:12.6％:0.5％,P等位基因和A等位基因在2型糖尿病组和对照组的频率分布分别为96.1％、93.2％和3.9％、6.8％,两组间的基因型和等位基因频率均无显著性差异(P>0.05)。在正常人群中,Pro12Ala多态性的基因型和等位基因频率在体重指数<25kg/m2与>25kg/H2组间有显著性差异(P<0.05)。结论 PPARγ2基因Pro12Ala多态性可能与上海地区汉族人群肥胖的发生有一定相关性,但与2型糖尿病无明显关联。

PPARγ2 Pro12Ala基因多态性与我国胃癌关系的研究

目的:研究PPARγ2 Pro12Ala基因多态性在我国普通人群和胃癌患者中的分布,探讨我国汉人PPARγ2 Pro12Ala基因多态性、幽门螺杆菌(Hp)感染与胃癌的关系。方法:胃癌患者、健康志愿者各104例,两组人群在性别以及年龄均匹配。采用限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析PPARγ2 Pro12Ala基因多态性,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清抗Hp-IgG抗体。结果:胃癌人群Hp感染率明显高于对照人群(81.7%vs59.6%,2=12.27,P<0.01;OR=3.0,95%CI=1.6-5.7)。我国汉人普通人群PPARγ2 CC、CG和GG基因型频率分别为91.3%、8.7%、0,G等位基因频率为4.3%。胃癌患者中携带有PPARγ2 G等位基因者比率明显高于对照人群(19.2%vs8.7%,P<0.05;OR=2.5,95%CI=1.1-5.8),并使Hp感染后胃癌发生的危险性增加(P<0.01,OR=8.9,95%CI=2.2-35.7)。结论:PPARγ2 G等位基因与我国汉族人群胃癌的发生有关,增加Hp感染后胃癌发生的危险性。

PPARγ2表达促毛囊bulge细胞向皮脂腺定向分化的研究

目的探讨毛囊bulge细胞向皮脂腺细胞分化的机制。方法构建携带过氧化物酶体增殖体激活受体γ2(peroxisomeproliferatoractivationreceptorγ2,PPARγ2)基因的绿色荧光蛋白(GFAP)质粒,通过质脂体转染到体外分离培养毛囊bulge细胞中,以转染空质粒的毛囊bulge细胞为对照,观察细胞的分化情况,运用免疫细胞化学检测细胞PPARγ和上皮膜抗原(epithelialmembraneantigen,EMA)的表达,油红O染色观察细胞脂滴合成情况。结果荧光显微镜下观察到已转染质粒的细胞呈现绿色荧光,能稳定表达PPARγ2mRNA,该细胞分化3周左右,部分细胞胞浆内出现脂滴,PPARγ、EMA及油红O染色阳性,而对照组为阴性,细胞内未见脂滴。结论毛囊bulge细胞可以分化为皮脂腺细胞,PPARγ2基因在其中起着重要作用。

猪背最长肌PPARγ2基因Bsr1位点多态性与肉质关系的研究

采用RT-PCR、PCR-RFLP及测序技术,对山猪等背最长肌(LD)的品质及PPARγ2基因表达量和第一启动子Bsr1位点多态性进行研究.结果表明,LD上PPARγ2基因表达量较低,且与肌内脂肪(IMF)呈弱相关(R=0.22).对PPARγ2 Bsr1位点多态性研究发现,该位点可产生G/A突变,形成b、Bb和B型3种基因型.山猪LD PPARγ2 Bsr1位点包含3种基因型,二元杂交后b型比例下降,三元杂交会出现b型缺失.同时发现,长白和大约克LD b型不表达,长白猪仅有B型,而申农1号除B型外Bb型高表达,提示瘦肉猪定向选育过程中可能会使b型逐渐丢失或表达关闭,从而不利于脂肪细胞的增生.以PPARγ2基因型为主效因素与肉质性状拟合建立GLM模型,不同基因型间猪LD剪切力和IMF存在显著差异(P<0.05).b型的高表达有利于脂肪细胞分化和增生,故可维系较高的IMF和较好的肌肉嫩度,提示其可作为优质肉的目标基因.

PPARγ2诱导脂肪细胞分化相关基因的克隆及鉴定

目的分离和克隆小鼠过氧化物酶体增殖体激活受体γ2 (mPPARγ2 )诱导脂肪细胞分化的相关基因。方法在体外建立mPPARγ2诱导NIH3T3成纤维细胞分化成脂肪细胞模型基础上 ,采用mRNA差异显示技术分离、克隆PPARγ2诱导的脂肪细胞高表达或低表达的cDNA片段 ,再通过半定量RT—PCR证实。 结果经mRNA差异显示技术分离到 2 0条差异显示片段 ,进一步对差异显示片段进行PCR扩增、T/A亚克隆及测序分析 ,与GenBank基因数据库比较后 ,得到 8个已知基因 ,一条新基因序列 ,2个EST序列和 7个新的EST序列。半定量RT—PCR结果显示UNR基因在PPARγ2诱导的脂肪细胞中表达上调 ,而凋亡抑制因子 5 (API5 )的表达则下调。

PPARγ2基因Pro12Ala多态性与罗格列酮治疗2型糖尿病疗效的关系

目的观察PPARγ2基因Pro12Ala多态性与罗格列酮(RGZ)治疗2型糖尿病的疗效、血浆内脏脂肪素(visfatin)及瘦素(leptin)水平变化的关系。方法选择218例哈尔滨地区非血缘关系的T2DM患者,使用PCR-RFLP方法检测PPARγ2基因Pro12Ala多态性。应用RGZ(4 mg/d)治疗12周,分别测定治疗前后visfatin、leptin和相关临床指标,并计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。结果A等位基因频率为4.4%,其中PP型199例,PA型19例,未发现AA型。RGZ治疗后,PA型FPG、HbA1C较PP型明显下降(P<0.05),PA型HOMA-IR下降更显著(P<0.01);PA型和PP型治疗前后visfatin、leptin水平均明显下降(P<0.01)。结论PPARγ2基因为PA型者对RGZ的治疗反应优于PP型者。PPARγ2基因Pro12Ala多态性可能影响RGZ对T2DM患者的治疗效果。RGZ治疗效果可能与visfatin、leptin水平下降密切相关。

糖皮质激素诱导肾虚骨质疏松症大鼠骨组织中PPARγ2的mRNA及蛋白表达的影响

目的:研究糖皮质激素骨质疏松症大鼠骨组织中PPARγ2的mRNA和蛋白表达,揭示糖皮质激素骨质疏松症的发病机理,阐述纳米钙补肾中药的调节作用机制。方法:用糖皮质激素注射的方法复制骨质疏松症模型,用纳米钙及具有益肾填精、补钙壮骨作用的补肾中药高、低剂量对实验大鼠治疗8周,以骨疏康颗粒、盖天力钙片作为阳性对照组,正常大鼠和模型空白组为空白对照组。用PCR法、Western印迹法检测骨质疏松症大鼠骨组织中PPARγ2的mRNA和蛋白表达。结果:正常大鼠骨组织可以在基因、蛋白水平表达PPARγ2,而且在骨髓脂肪细胞分化中可能起到重要的作用,糖皮质激素对大鼠骨质疏松症的发生与骨组织中PPARγ2 mRNA和蛋白表达的变化有关,从而影响骨髓脂肪细胞形成。结论:纳米钙补肾中药通过调控大鼠骨组织中PPARγ2 mRNA和蛋白表达,抑制骨髓脂肪细胞的形成,从而对糖皮质激素性骨质疏松症有一定的防治作用。

PPARγ2基因外显子1多态性对猪胴体性状的影响

利用PCR-SSCP技术,对约克夏、杜洛克、长白猪、金华猪、碧湖猪和嵊县花猪共6个品种258头猪的PPARγ2基因外显子1进行多态性分析,并采用SPSS程序中GLM模型分析该位点与胴体性状的相关性。研究结果发现编码区175 bp处存在A175G单核苷酸多态。国内外猪种的基因型频率间存在较大差异,在国外种猪中,AA基因型频率较高,国内猪种中AG基因型频率较高。相关性分析结果表明,在长白猪群中,PPARγ2基因与肩部背膘厚、腰荐结合部背膘厚均存在极显著相关性(P<0.01),与6/7th肋背膘厚和眼肌面积均存在显著相关性(P<0.05)。在金华猪群内,PPARγ2基因与肩部背膘厚显著相关(P<0.05)。因此推测PPARγ2基因可能是影响猪胴体性状的潜在分子育种标记。

PPARγ2基因Pro12Ala多态性与老年人高血压合并脑梗死关系的探讨

目的探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(PPARγ2)基因Pro12Ala多态性与老年人高血压合并脑梗死及血脂的关系。方法随机选取湖北地区汉族老年人165例,其中正常对照组95例,高血压合并脑梗死组70例。正常非老年人125例。应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性技术,进行基因型检测,并用直接测序法加以证实。结果正常老年人PPARγ2基因Pro12Ala多态性的基因型及等位基因频率分布,与非老年人群相似(P>0.05)。PPARγ2基因Pro12Ala多态性与老年人高血压合并脑梗死的发病无关(P>0.05)。在老年脑梗死患者中,PA/AA基因型者的血清低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)水平〔(3.47±0.70)mmol/L〕,较PP型者〔(2.54±0.39)mmol/L〕显著升高(P<0.05)。该变异与血压、血糖、体重指数无关(均为P>0.05)。结论PPARγ2基因Pro12Ala多态性可能不是老年人高血压合并脑梗死发病的遗传学因素。但该变异参与脂质异常的调节,脑梗死患者中,PA/AA型者的血清LDLC水平,较PP型者显著升高。

在CoCl_2模拟低氧条件下HIF-1α直接调控PPARγ2的表达

目的探讨在Co Cl2模拟低氧条件下,低氧诱导因子1α(HIF-1α)对于过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(PPARγ2)是否具有调控作用。方法用real time PCR和Western blot检测Co Cl2模拟低氧条件下PPARγ2和低氧诱导因子1α(HIF-1α)mRNA及蛋白表达。用双荧光报告系统检测HIF-1α对于PPARγ调控的剂量依赖性,并通过染色质免疫共沉淀技术进一步验证。结果 Co Cl2模拟低氧条件下PPARγ2和HIF-1α的mRNA及蛋白表达水平均随着诱导时间的增加而增加。过表达HIF-1α导致PPARγ2表达上调(P<0.01),而抑制HIF-1α则导致PPARγ2表达下调(P<0.05)。HIF-1α对PPARγ2基因的表达具有正调控作用,通过结合于PPARγ2上游调控区特定的低氧应答元件(HRE)而调控其表达。结论 PPARγ2通过HIF-1α依赖的途径在Co Cl2模拟的低氧条件下发挥低氧适应作用。

五指山小型猪PPARγ2基因启动子多态性分析

目的对五指山小型猪PPARγ2基因启动子调控区域多态性进行分析。方法根据猪PPARγ2启动子调控区域2200 bp设计5对引物,对57头封闭群五指山小型猪的多态性进行检测,并用多种生物信息学软件对调控区域的启动子、转录因子结合位点、RNA二级结构、Cp G岛进行预测分析。结果筛选到9个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)位点,分别是:-1595T/C、-1534G/A、-1262C/A、-1220C/A、-1017A/G、-963A/G、-955G/A、-866A/G、-333G/A。SNPs都没有处在软件识别的启动子区域中,但-333G/A突变位于核心启动子(-656^-23 bp)区域。突变的SNP位点附近转录因子结合位点会发生改变,突变前后RNA二级结构最小自由能发生变化,其结构也发生显著变化。目标序列未找到Cp G岛。结论筛选到的五指山小型猪PPARγ2启动子调控区域SNPs可能对该基因的表达调控产生影响,为进一步研究其功能奠定基础。

“抗疏健骨颗粒”对去势骨质疏松模型大鼠肾组织PPARγ2 mRNA及蛋白表达水平的影响

目的：研究抗疏健骨颗粒对去势大鼠肾组织过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARγ2）m RNA及蛋白表达水平的影响。方法：采用随机区组设计,将50只4~5月龄的雌性SD大鼠分配至假手术组、模型组和抗疏健骨颗粒低、中、高剂量组,除假手术组外,其余各组大鼠采用＂切徐双侧卵巢法＂造模。各组给予不同剂量的抗疏健骨颗粒或生理盐水,每日1次,每周6次,共12周。12周后检测并分析各组大鼠骨密度、生化指标、肾组织PPARγ2 m RNA及蛋白表达水平。结果：抗疏健骨颗粒各剂量组、假手术组大鼠骨密度和血清磷（S-P）含量均明显高于模型组（P〈0.05）,血清碱性磷酸酶（ALP）、血清钙（S-Ca）含量和肾组织PPARγ2 m RNA灰度值均明显低于模型组（P〈0.05）;抗疏健骨颗粒各剂量组大鼠肾组织PPARγ2表达水平均明显低于假手术组（P〈0.05）,其中中剂量组表达水平明显低于低剂量组、高剂量组（P〈0.05）。结论 ：抗疏健骨颗粒可能参与调节骨髓间充质干细胞（BMSCs）向脂肪细胞或成骨细胞分化的方向,进而调节骨代谢平衡,从而对骨质疏松症起治疗作用。

镇肝熄风汤对自发性高血压大鼠PPARγ2 mRNA和蛋白表达的影响

目的:研究不同剂量的镇肝熄风汤对自发性高血压大鼠(SHR)脂肪组织PPARγ2蛋白和PPARγ2mRNA表达的影响。方法:24周龄自发性高血压大鼠(SHR),雄性,50只,模型组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、复方罗布麻组,每组10只,同源雄性WKY大鼠10只作为对照组,灌胃给药5周后,Western Blot方法测定脂肪组织PPARγ2蛋白表达,用Real-Time RT-PCR(Real-Time Quantitative RT-PCR)方法测定大鼠PPARγ2 mRNA基因表达。结果:各组与模型组比较,PPARγ2蛋白表达明显降低(P<0.01);各组与模型组比较,PPARγ2 mRNA表达明显降低(P<0.05);结论:镇肝熄风汤能减少脂肪组织PPARγ2蛋白表达和PPARγ2mRNA表达,从而减少成脂和保护心肌细胞功能。

吡格列酮对早期脂肪细胞分化中PPARγ2启动子转录活性的影响

目的探讨吡格列酮对脂肪细胞早期分化中PPARγ2启动子转录活性的影响及分子调控机制。方法荧光素酶双报告基因法分别检测吡格列酮对MID诱导的3T3-L1分化细胞中含全长、C/EBP串联重复串联重复串联重复串联重复串联重复串联重复串联重复串联重复序列及AP-1结合区的PPARγ2启动子转录活性的影响;染色体免疫共沉淀(Ch IP)法检测GILZ蛋白与PPARγ2启动子区DNA的结合。结果吡格列酮处理组各PPARγ2启动子区转录活性比对应的无吡格列酮对照组显著增加(P<0.05,P<0.01),C/EBP区的转录活性显著性高于AP-1区(P<0.01)。Ch IP检测显示,吡格列酮处理组GILZ蛋白结合的PPARγ2启动子DNA明显低于对照组(P<0.01)。结论吡格列酮可能降低GILZ蛋白与PPARγ2启动子DNA结合,增加PPARγ2启动子转录,从而增强脂肪细胞分化。C/EBP串联重复序列在吡格列酮增强PPARγ2启动子转录活性作用中起了主要作用。

抗疏健骨颗粒对去势骨质疏松模型大鼠骨组织PPARγ2表达的影响

目的：通过观察抗疏健骨颗粒对去势大鼠骨组织PPAγR2mRNA及蛋白表达水平的影响,为抗疏健骨颗粒应用于临床提供分子生物学依据。方法：采用随机区组设计,将50只4~5月龄的雌性SD大鼠分配至假手术组、模型组、小剂量、中剂量、大剂量抗疏健骨颗粒组,给药至12周后检测并分析骨组织PPAγR2mRNA及蛋白表达水平。结果：小剂量组、中剂量组、大剂量组、假手术组骨组织的PPARγ2mRNA灰度值均明显低于模型组（P〈0.05）;而小剂量组、中剂量组、大剂量组骨组织的PPARγ2表达水平均明显低于假手术组（P〈0.05）;中剂量组骨组织的PPARγ2表达水平均明显低于小剂量组、大剂量组（P〈0.05）。结论：抗疏健骨颗粒对骨组织PPARγ2表达具有一定的抑制作用,可能与抑制破骨细胞活性,调节BMSCs向脂肪细胞或成骨细胞分化的方向,进而影响骨髓成骨细胞和脂肪细胞的数目变化,对绝经后骨代谢异常具有积极的防治作用。

5种干预疗法对去卵巢骨质疏松大鼠骨髓脂肪细胞数目和PPARγ2蛋白表达水平的影响

采用去卵巢骨质疏松大鼠模型,观察跑台运动、全身垂直振动、金雀异黄酮、雌激素和氯化锂5种干预疗法对去卵巢骨质疏松大鼠骨髓脂肪细胞数目和过氧化物酶体增殖激活物受体γ2(PPARγ2)蛋白表达水平的影响。方法:将80只3月龄雌性SD大鼠按体重分层后随机分为假手术组和去卵巢组,去卵巢10周后,将去卵巢组大鼠按体重分层后又随机分为去卵巢组、雌激素组、金雀异黄酮组、氯化锂组、跑台运动组和全身垂直振动组。去卵巢第11周时,不同组别的大鼠开始进行不同干预处理。干预8周后,用HE染色法观察左胫骨组织形态学和骨髓脂肪细胞空泡数目的变化;用Western blotting检测右胫骨近端骨组织PPARγ2蛋白表达水平的变化。结果:经雌激素、金雀异黄酮、跑台运动和氯化锂干预后,去卵巢骨质疏松大鼠胫骨松质骨骨小梁数目显著增加,脂肪空泡数目和PPARγ2蛋白表达水平显著下降,而经全身垂直振动干预后,去卵巢骨质疏松大鼠胫骨松质骨骨小梁数目显著增加,脂肪空泡数量显著减少,但PPARγ2蛋白表达水平无显著变化。结论:雌激素、金雀异黄酮、跑台运动和氯化锂可能是通过下调去卵巢骨质疏松大鼠骨组织PPARγ2蛋白的表达水平而抑制去卵巢骨质疏松大鼠骨髓细胞向脂肪细胞的分化。

大河乌猪PPARγ2基因多态性分析

过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs)包含α、β、γ3种亚型,其中PPARγ亚型主要分布在脂肪组织中,在脂肪代谢和脂肪细胞分化中起着特别重要的作用。本研究利用PCR-单链构型多态性(PCR-SSCP)技术,检测了75头大河乌猪PPARγ2基因第2外显子区的遗传变异。结果表明,所检测的样本均为AA基因型,且未发现多态性。

PPARγ2基因多态性与脑梗死人群葡萄糖代谢异常的研究

目的探讨PPARγ2基因多态性与脑梗死人群葡萄糖代谢异常的关系。方法以rs1875796为遗传标记,应用多聚酶链-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测643例脑梗死患者(合并糖代谢异常组305例,糖代谢正常组338例)PPARγ基因型。结果女性糖代谢异常合并脑梗死组rs1875796的C等位基因频率明显高于单纯脑梗死组(χ2=9.147,P=0.002,OR=2.184,95%CI1.310～3.623),CC+CT基因型频率也明显高于单纯脑梗死组(χ2=6.548,P=0.010,OR=2.198,95%CI1.202～4.018),而男性糖代谢异常合并脑梗死组与单纯脑梗死组等位基因和基因型频率分布无显著差异。结论PPARγ基因与女性脑梗死人群葡萄糖代谢异常的发生相关。