尼罗罗非鱼PPARo的原核表达及其多抗制备和纯化

【目的】为研究尼罗罗非鱼过氧化物酶体增殖物激活受体δ(PPARδ)的表达情况,通过大肠杆菌表达系统表达PPARδ,纯化重组蛋白并获得多克隆抗体。【方法】对PPARδ进行生物信息学分析后设计特异性引物,扩增PPARδ,将其克隆至原核表达载体pET-B2m中,构建重组表达载体;重组质粒转入大肠杆菌B21并用IPTG进行诱导表达,用SDS-PAGE鉴定表达产物。用镍柱纯化重组蛋白后免疫日本大耳兔制备多克隆抗体,用间接ELISA技术检测抗体效价,Western Blot鉴定抗体的特异性。【结果】成功构建了原核表达载体pET-B2m-PPARδ,实现了重组蛋白的原核表达和纯化,重组蛋白以包涵体蛋白和可溶性蛋白2种形式存在,分子量约为90 kD;制备的多克隆抗体效价为1∶2048000,Western Blot检测结果表明该抗体能特异性识别尼罗罗非鱼PPARδ。【结论】成功实现了尼罗罗非鱼PPARδ重组蛋白的融合表达,在大肠杆菌中高效表达后纯化重组蛋白,免疫日本大耳兔获得了效价高、特异性强的多克隆抗体,为尼罗罗非鱼PPARδ的功能研究奠定了基础。

miR-518d在正常妊娠及妊娠期糖尿病患者胎盘及血清中的表达研究

目的:检测正常妊娠及妊娠期糖尿病患者胎盘及血清中microRNA518d(miR-518d)的表达,探讨其在妊娠期糖尿病发病及诊断中的作用。方法:选择无妊娠并发症和合并症的足月剖宫产分娩产妇20例及妊娠期糖尿病足月剖宫产分娩产妇20例。分别收集两组的新鲜胎盘组织及母体血清,用Taqman实时荧光定量PCR方法检测两组miRNAs的变化。结果:miR-518d在妊娠期糖尿病胎盘中的表达(4.35±0.88)显著高于对照组(1.04±0.73)(P<0.01),而其在妊娠期糖尿病血清中的表达水平(2.43±1.07)也明显高于对照组(0.96±0.88)(P<0.05),生物信息学预测过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)3′UTR区含有miR-518d的结合位点,且胎盘miR-518d表达水平和血清雌二醇水平呈正相关(R2=0.759,r=0.871)。结论:miR-518d可能通过调控PPARα基因参与妊娠期糖尿病的发病,有望成为妊娠期糖尿病的潜在诊断指标。