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重组结核分枝杆菌ESAT6-PPE68融合蛋白的制备 被引量:2
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作者 李红霞 陈建平 +6 位作者 曾林子 刘刚 姚卫 杨筠 刘杨椅 王涛 田玉 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期131-135,共5页
目的构建结核分支杆菌esat6-ppe68融合基因及其原核表达载体,在大肠杆菌中表达融合蛋白ESAT6-PPE68。方法用基因拼接(GeneSOEing)法扩增esat6-ppe68融合基因,并将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒pGesat6-ppe68... 目的构建结核分支杆菌esat6-ppe68融合基因及其原核表达载体,在大肠杆菌中表达融合蛋白ESAT6-PPE68。方法用基因拼接(GeneSOEing)法扩增esat6-ppe68融合基因,并将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒pGesat6-ppe68。重组子经限制性内切酶分析、聚合酶链式反应及测序鉴定后转化宿主菌大肠杆菌BL21,IPTG(异丙基-β-D硫代半乳糖苷)诱导表达约69000带谷胱苷肽硫转移酶蛋白(GST)标签的rESAT6-PPE68融合蛋白,经谷胱苷肽-硫-转移酶融合蛋白纯化试剂盒得到纯化的融合蛋白,产物进行SDS-PAGE电泳、Western-blotting鉴定。结果重组质粒pGesat6-ppe68中目的基因测序结果与报道序列完全相同;在大肠杆菌中以可溶性非包涵体形式表达;表达量约占菌体总蛋白的40%,表达蛋白纯化后获得纯度为90%左右的重组蛋白;Westernblotting结果证实重组蛋白与确诊的结核病患者血清发生特异免疫反应。结论成功构建了原核表达载体pGesat6-ppe68,获得了rESAT6-PPE68融合蛋白,为rESAT6-PPE68融合蛋白在结核病诊断中的应用奠定了基础。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 esat6-ppe68融合基因 rESAT6-ppe68融合蛋白 原核表达
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结核分枝杆菌RD1区PPE68/GST融合蛋白表达质粒的构建及表达 被引量:3
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作者 曾林子 陈建平 +3 位作者 刘成君 李红霞 姚卫 杨志荣 《第四军医大学学报》 CAS 北大核心 2007年第1期59-61,共3页
目的:构建结核分枝杆菌PPE68/GST融合蛋白表达质粒,并在大肠杆菌JM109中诱导表达.方法:利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Rv3873基因,并将其定向克隆pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873并转化E.coliJM109,异丙基-β-D-硫代... 目的:构建结核分枝杆菌PPE68/GST融合蛋白表达质粒,并在大肠杆菌JM109中诱导表达.方法:利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Rv3873基因,并将其定向克隆pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873并转化E.coliJM109,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.采用GST蛋白纯化试剂盒进行重组融合蛋白纯化,SDS-PAGE和WesternBlot鉴定重组表达产物.结果:成功构建原核表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873并表达出约Mr63000大小的PPE68/GST融合蛋白,占总菌体的40%.WesternBlot检测该融合蛋白能和结核患者多价抗血清发生反应.结论:成功地构建了原核表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873,并在大肠杆菌得到表达. 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 RD1区 ppe68/GST融合蛋白 表达
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结核分枝杆菌PPE68基因真核表达质粒的构建及鉴定 被引量:3
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作者 靳志栋 何永林 +4 位作者 徐蕾 佘茜 张丹 张壮苗 杨春 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第8期907-910,共4页
目的:构建结核分枝杆菌(Mycobacteria tuberculosis,Mtb)PPE68基因的真核表达质粒,观察PPE68基因在小鼠巨噬细胞株RAW264.7中的表达。方法:将MtbPPE68基因克隆亚至真核表达质粒pBudCE4.1中,构建真核表达质粒pBudCE4.1-PPE68。以真核表... 目的:构建结核分枝杆菌(Mycobacteria tuberculosis,Mtb)PPE68基因的真核表达质粒,观察PPE68基因在小鼠巨噬细胞株RAW264.7中的表达。方法:将MtbPPE68基因克隆亚至真核表达质粒pBudCE4.1中,构建真核表达质粒pBudCE4.1-PPE68。以真核表达质粒pBudCE4.1-PPE68体外转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞,通过RT-PCR及Western blot法分别在转录水平及翻译水平检测PPE68基因的表达。结果:重组表达质粒经双酶切所切下的片段大小与理论值相符,测序结果与Gen-bank注录的PPE68基因序列一致。重组质粒瞬时转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7,用RT-PCR及Western blot法分别在转录水平及翻译水平检测PPE68基因的表达。结论:成功构建了PPE68基因的重组真核表达质粒pBudCE4.1-PPE68,并在小鼠巨噬细胞株RAW264.7中得到了成功表达。为对其免疫原性、免疫反应性及免疫保护作用的进一步研究奠定了基础。 展开更多
关键词 MTB ppe68 巨噬细胞
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pBudCE4.1/PPE68DNA疫苗诱导Balb/c小鼠产生Th1免疫应答 被引量:2
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作者 王静娴 徐蕾 +4 位作者 何永林 张壮苗 董志玲 冯鑫 杨春 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期208-211,216,共5页
目的构建结核分枝杆菌PPE68 DNA疫苗,并探讨其在小鼠体内诱导的Th1免疫应答。方法将结核分枝杆菌PPE68基因和复制子OriM基因亚克隆入真核表达质粒pBudCE4.1中构建穿梭质粒,并用其免疫Balb/c小鼠,于第3次免疫后2周处死小鼠,分别检测免疫... 目的构建结核分枝杆菌PPE68 DNA疫苗,并探讨其在小鼠体内诱导的Th1免疫应答。方法将结核分枝杆菌PPE68基因和复制子OriM基因亚克隆入真核表达质粒pBudCE4.1中构建穿梭质粒,并用其免疫Balb/c小鼠,于第3次免疫后2周处死小鼠,分别检测免疫小鼠血清IgG2a水平、IFN-γ和IL-12水平;特异性蛋白刺激后淋巴细胞增殖状态;小鼠肺、脾组织病理改变情况。结果 PPE68 DNA疫苗免疫小鼠后血清中的IgG2a水平、IFN-γ和IL-12均有意义的提高,脾淋巴细胞增殖显著。脾肺未见明显病理改变。结论 PPE68DNA疫苗可有效诱导小鼠Th1免疫应答,为进一步研究其抗MTB的免疫保护作用奠定了基础。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 ppe68 DNA 免疫应答
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结核分枝杆菌PPE68蛋白的表达、鉴定及抗血清的制备 被引量:2
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作者 佘茜 徐蕾 +3 位作者 何永林 靳志栋 张丹 杨春 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第9期803-806,共4页
目的在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌PPE68蛋白,鉴定并纯化重组rPPE68蛋白后免疫新西兰大白兔,制备兔抗PPE68多克隆抗体。方法将已经过鉴定的重组原核表达质粒pET32a(+)-PPE68转化至大肠杆菌BL21中,IPTG诱导大量表达PPE68蛋白。对表达蛋... 目的在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌PPE68蛋白,鉴定并纯化重组rPPE68蛋白后免疫新西兰大白兔,制备兔抗PPE68多克隆抗体。方法将已经过鉴定的重组原核表达质粒pET32a(+)-PPE68转化至大肠杆菌BL21中,IPTG诱导大量表达PPE68蛋白。对表达蛋白进行鉴定后利用亲和层析法进行纯化。以纯化后重组rPPE68为免疫抗原,与弗氏不完全佐剂等体积混合,采用皮下多点注射法免疫新西兰大白兔,于第3次免疫后的第7天采血。用凝集实验与Western-blot检测抗血清的特异性,并用双向免疫扩散法测定抗血清效价。结果在大肠杆菌中表达的目的产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量57 000处可见特异性条带,免疫印迹分析证实表达的目的蛋白可与结核分枝杆菌H37Rv株感染小鼠的血清发生反应。纯化的rPPE68蛋白免疫新西兰大白兔后,凝集反应与Western-blot证实了抗血清的特异性,双向免疫扩散法测得血清效价为1∶16。结论已成功表达结核分枝杆菌PPE68蛋白,制备了特异性兔抗PPE68多克隆抗体,对结核病的早期诊断提供了一种新的思路。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 ppe68 原核表达 抗血清
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与结核分枝杆菌PE25/PPE41和PE35/PPE68相互作用的宿主蛋白的筛选 被引量:1
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作者 李田田 陈利苹 刘思国 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第6期504-507,共4页
为筛选与结核分枝杆菌(MTB)的PE25/PPE41和PE35/PPE68两对异源二聚体相互作用的宿主蛋白,本研究以这两对异源二聚体为诱饵蛋白筛选与其相互作用的宿主蛋白。首先将PCR扩增的PE25/PPE41或PE35/PPE68基因串联克隆于改造的pc DNA3.1(+)中(... 为筛选与结核分枝杆菌(MTB)的PE25/PPE41和PE35/PPE68两对异源二聚体相互作用的宿主蛋白,本研究以这两对异源二聚体为诱饵蛋白筛选与其相互作用的宿主蛋白。首先将PCR扩增的PE25/PPE41或PE35/PPE68基因串联克隆于改造的pc DNA3.1(+)中(在5'端引入了以编码烟草蚀纹病毒蛋白酶切位点的序列连接的ZZ和Flag标签序列),构建诱饵重组质粒pcDNA-PE25-PPE41和pc DNA-PE35-PPE68。分别将构建的诱饵重组质粒转染293T细胞后提取细胞总蛋白,经ZZ和Flag标签蛋白两步串联亲和层析钓取宿主蛋白,SDS-PAGE电泳分离后切取差异蛋白胶条进行质谱分析,结果显示,PE25/PPE41鉴定到15个差异蛋白,PE35/PPE68鉴定到29个差异蛋白,并分别挑选了与PE25/PPE41和PE35/PPE68相互作用的3个和7个差异蛋白,为进一步验证与PE25/PPE41和PE35/PPE68直接作用的宿主蛋白及研究其生物学功能奠定了基础。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 PE25/PPE41 PE35/ppe68 宿主互作蛋白 串联亲和纯化
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Ipr1/PPE68穿梭质粒构建及诱导BALB/c小鼠免疫应答的探讨
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作者 张壮苗 杨春 +5 位作者 靳志栋 何永林 徐蕾 王静娴 董志玲 李岱容 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期429-432,共4页
目的构建Ipr1/PPE68共表达穿梭质粒pBIPO(pBud-Ipr1-PPE68-OriM),探讨其诱导BALB/C小鼠的免疫应答特征。方法将Ipr1基因和PPE68编码序列以及结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)的复制子OriM分别插入质粒pBudCE4.1的多克隆位... 目的构建Ipr1/PPE68共表达穿梭质粒pBIPO(pBud-Ipr1-PPE68-OriM),探讨其诱导BALB/C小鼠的免疫应答特征。方法将Ipr1基因和PPE68编码序列以及结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)的复制子OriM分别插入质粒pBudCE4.1的多克隆位点,构建共表达穿梭质粒pBIPO,经酶切测序及Western blotting鉴定后,用其免疫BALB/c小鼠,于末次免疫后2w处死小鼠,ELISA法分别检测小鼠血清中lgG2a、IL-12及IFN-γ的水平,流式细胞仪检测CD4+和CD8+T细胞数量,MTT法检测特异性脾淋巴细胞增殖,同时观察肺脾组织病理学变化。结果酶切测序鉴定PPE68和Ipr1基因序列与理论值相符,Western-blotting鉴定PPE68和Ipr1蛋白表达成功。质粒pBIPO免疫后小鼠血清中的lgG2a、IFN-γ及IL-12水平与CD4+和CD8+T细胞表达均呈现出有意义的提高,脾淋巴细胞增殖与BCG组相比差异无统计学意义,肺脾组织未见病理学改变。结论成功构建DNA疫苗(pBIPO),该疫苗能够有效诱导BALB/c小鼠的细胞免疫应答,为进一步研究其抗MTB的免疫保护作用奠定基础。 展开更多
关键词 MTB Ipr1 ppe68 DNA疫苗 免疫应答
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Ipr1/PPE68重组BCG诱导BALB/C小鼠免疫应答的探讨
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作者 张壮苗 杨春 +4 位作者 徐蕾 何永林 王静娴 董志玲 杨静 《四川动物》 CSCD 北大核心 2013年第4期595-600,共6页
目的构建Ipr1/PPE68重组卡介苗(Recombinant BCG,rBCG),探讨其诱导BALB/C小鼠免疫应答的效果。方法将Ipr1和PPE68基因及结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)复制子OriM分别插入pBudCE4.1的多克隆位点,构建共表达穿梭质粒pBIPO... 目的构建Ipr1/PPE68重组卡介苗(Recombinant BCG,rBCG),探讨其诱导BALB/C小鼠免疫应答的效果。方法将Ipr1和PPE68基因及结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)复制子OriM分别插入pBudCE4.1的多克隆位点,构建共表达穿梭质粒pBIPO,将其电转入BCG,构建Ipr1/PPE68-rBCG并将rBCG免疫BALB/C小鼠,检测小鼠血清中IgG2a、IL-12、IFN-γ及IL-4的水平、特异性脾淋巴细胞增殖和CD4+和CD8+T细胞数量,同时观察脾、肺荷菌量及脾、肺组织病理学变化。结果酶切测序及菌落PCR鉴定Ipr1和PPE68以及OriM基因序列与理论值相符,Western-blotting结果显示Ipr1和PPE68蛋白成功表达。Ipr1/PPE68-rBCG免疫小鼠后,血清中的IgG2a和IL-12水平及脾淋巴细胞增殖情况明显高于对照组,但与BCG组相比没有显著意义;IFN-γ水平显著低于BCG组,与对照组相比无显著性差异;各组别IL-4的水平差异均不明显。脾、肺荷菌实验未见菌落生长,肺、脾组织未见病理学改变。结论成功构建Ipr1/PPE68-rBCG,该重组BCG能诱导BALB/C小鼠的细胞免疫应答。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 Ipr1/ppe68重组BCG 免疫应答
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结核分枝杆菌免疫相关蛋白PPE68的表达及免疫原性的研究
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作者 王晓琳 鲍朗 +3 位作者 朱庆平 龙洋 张会东 钟琪 《四川生理科学杂志》 2005年第2期49-51,共3页
目的:克隆、表达结核分枝杆菌PPE家族蛋白PPE68的编码基因Rv3873,并初步探索PPE68诱导Balb/c小鼠脾淋巴细胞的增殖活性,为进一步研究PPE68的免疫功能提供实验依据。方法:以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,PCR扩增Rv3873基因编码序列,定... 目的:克隆、表达结核分枝杆菌PPE家族蛋白PPE68的编码基因Rv3873,并初步探索PPE68诱导Balb/c小鼠脾淋巴细胞的增殖活性,为进一步研究PPE68的免疫功能提供实验依据。方法:以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,PCR扩增Rv3873基因编码序列,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pET32a(+),获得重组表达质粒,转化大肠杆菌后用IPTG进行诱导表达,纯化表达产物,通过XTT比色法检测重组蛋白PPE68诱导脾淋巴细胞的增殖活性。结果:重组质粒pETRv3873构建成功,57kDa的His-PPE68融合蛋白在大肠杆菌中稳定表达,并具有刺激Balb/c小鼠脾淋巴细胞增殖的功能。结论:PPE68蛋白具有较强的免疫原性,其免疫学功能具有进一步研究的价值。 展开更多
关键词 ppe68 免疫相关蛋白 免疫原性 结核分枝杆菌
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Evolution of PE35 and PPE68 Gene Families in Mycobacterium: Roles of Horizontal Gene Transfer and Evolutionary Constraints
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作者 Ashay Bavishi Lin Lin +1 位作者 Madhusudan Choudhary Todd P. Primm 《Journal of Tuberculosis Research》 2014年第4期181-198,共18页
Mycobacterium is a genus of bacteria with over a hundred non-pathogenic and pathogenic species, best recognized for certain members known to cause diseases such as tuberculosis and leprosy. Two novel protein families ... Mycobacterium is a genus of bacteria with over a hundred non-pathogenic and pathogenic species, best recognized for certain members known to cause diseases such as tuberculosis and leprosy. Two novel protein families important in the pathogenesis of Mycobacterium species are the PE and PPE families. These two protein families affect the antigenic profiles, disturbing host immunity. To better understand the origin and evolution of these gene families and the differences in their composition between pathogenic and non-pathogenic strains, several bioinformatic analyses were conducted both among Mycobacterium and closely related species that contain PE35 and PPE68 gene homologs. The methods included protein homology searches (BLASTP), horizontal gene transfer analysis (IslandViewer), phylogenetic analysis, gene cluster analysis and structural and functional constraints. Results revealed that PE and PPE gene homologs were not only limited to Mycobacterium, but also existed in three other non-mycobacterial genera, Rhodococcus, Tsukamurella and Segniliparus, and were possibly initially acquired from non-mycobacterial microorganisms by multiple horizontal gene transfers. Results also demonstrated that PE and PPE genes were more diverse and more rapidly evolving in pathogenic Mycobacterium as compared with non-pathogenic Mycobacterium and other non-mycobacterial species. These findings possibly shed light on the diverse functions and origins of the PE/PPE proteins among these organisms. 展开更多
关键词 PE35 ppe68 HORIZONTAL GENE TRANSFER MYCOBACTERIUM
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PPE68/Ipr1真核共表达质粒的构建及鉴定 被引量:3
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作者 靳志栋 张丹 +4 位作者 何永林 徐蕾 佘茜 张壮苗 杨春 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2011年第4期410-413,共4页
目的构建结核分枝杆菌PPE68基因和小鼠胞内病原体抗性基因1(Intracellular pathogen resistance 1,Ipr1)的真核共表达质粒,并在小鼠巨噬细胞RAW264.7中表达。方法将结核分枝杆菌PPE68基因和小鼠Ipr1基因分别亚克隆至含多启动子的共表达... 目的构建结核分枝杆菌PPE68基因和小鼠胞内病原体抗性基因1(Intracellular pathogen resistance 1,Ipr1)的真核共表达质粒,并在小鼠巨噬细胞RAW264.7中表达。方法将结核分枝杆菌PPE68基因和小鼠Ipr1基因分别亚克隆至含多启动子的共表达载体pBudCE4.1中,构建真核共表达质粒pBud68-Ipr1,转染RAW264.7细胞,通过RT-PCR及Western blot法检测PPE68和Ipr1基因的转录和表达。结果重组表达质粒pBud68-Ipr1经PCR、双酶切及测序证实,插入的PPE68和Ipr1基因片段序列正确;质粒转染RAW264.7细胞后,PPE68和Ipr1基因进行了转录和表达,基因编码产物相对分子质量分别为37 000和50 000。结论已成功构建了真核共表达质粒pBud68-Ipr1,并在RAW264.7细胞中获得表达,为PPE68/Ipr1重组BCG的构建及其免疫保护作用的进一步研究奠定了基础。 展开更多
关键词 结核病 ppe68 胞内病原体抗性基因1 巨噬细胞
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结核分枝杆菌PPE68蛋白的原核表达及纯化 被引量:2
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作者 佘茜 徐蕾 +3 位作者 何永林 靳志栋 张丹 杨春 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2010年第12期1295-1298,共4页
目的构建结核分枝杆菌PPE68基因的原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR法扩增PPE68基因,将其克隆至pET-32a(+)载体中,构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-PPE68,转化至大肠杆菌BL21(D... 目的构建结核分枝杆菌PPE68基因的原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR法扩增PPE68基因,将其克隆至pET-32a(+)载体中,构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-PPE68,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后,进行纯化。结果重组表达质粒pET-32a(+)-PPE68经PCR及双酶切鉴定构建正确,测序结果与GenBank中登录的PPE68基因序列一致。表达的Trx-PPE68融合蛋白相对分子质量约为57000,表达量约占菌体总蛋白的41%,可与结核分枝杆菌免疫小鼠血清发生特异性反应。纯化的重组蛋白纯度约为93%。结论已成功构建了结核分枝杆菌PPE68基因重组原核表达质粒pET-32a(+)-PPE68,原核表达并纯化了重组蛋白,为PPE68作为结核病特异性诊断抗原的开发及重组BCG疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 ppe68 原核细胞 基因表达 纯化
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一种新型的表达PPE68蛋白的重组耻垢分枝杆菌载体疫苗的构建及鉴定 被引量:1
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作者 项杰 张冠慧 +3 位作者 王艳萍 徐涛 席淑红 樊毅 《武汉大学学报(医学版)》 CAS 北大核心 2011年第3期324-328,共5页
目的:构建一种新型的、含结核分枝杆菌(M.S)抗原PPE68的耻垢分枝杆菌载体疫苗。方法:以结核分枝杆菌标准株H37Rv的基因组为模板,PCR方法获得Rv3873基因,然后通过克隆构建获得真核表达质粒pVAX-1-Rv3873,最后通过电转化的方法将pVAX-1-Rv... 目的:构建一种新型的、含结核分枝杆菌(M.S)抗原PPE68的耻垢分枝杆菌载体疫苗。方法:以结核分枝杆菌标准株H37Rv的基因组为模板,PCR方法获得Rv3873基因,然后通过克隆构建获得真核表达质粒pVAX-1-Rv3873,最后通过电转化的方法将pVAX-1-Rv3873真核表达质粒转化至耻垢分枝杆菌的感受态细胞中获得重组的耻垢分枝杆菌载体疫苗rM.S-PPE68。结果:成功构建了含结核分枝杆菌抗原PPE68的耻垢分枝杆菌载体疫苗。结论:该疫苗的构建为结核病的预防,尤其在高免疫保护作用的疫苗开发方面,提供了新的研究策略。 展开更多
关键词 结核病 疫苗 耻垢分枝杆菌 ppe68
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结核分枝杆菌重组蛋白CFP-10-ESAT-6-PPE68的表达、纯化与多克隆抗体的制备 被引量:1
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作者 张俊荣 徐佳楠 +2 位作者 陈琦伟 陈达丽 陈建平 《热带医学杂志》 CAS 2014年第1期46-51,共6页
目的构建重组质粒pET32a(+)-cfp-10-esat-6-ppe68,得到重组结核分枝杆菌CFP-10-ESAT-6-PPE68蛋白及兔抗结核分枝杆菌CFP-10-ESAT-6-PPE68蛋白的多克隆抗体,为下一步应用于临床结核病的检测奠定基础。方法将结核分枝杆菌cfp-10-esat-6-pp... 目的构建重组质粒pET32a(+)-cfp-10-esat-6-ppe68,得到重组结核分枝杆菌CFP-10-ESAT-6-PPE68蛋白及兔抗结核分枝杆菌CFP-10-ESAT-6-PPE68蛋白的多克隆抗体,为下一步应用于临床结核病的检测奠定基础。方法将结核分枝杆菌cfp-10-esat-6-ppe68基因转入质粒pET32a,将经PCR、酶切、序列测定鉴定为阳性的质粒转入大肠杆菌DE3,IPTG诱导表达重组蛋白,经亲和层析法纯化重组蛋白后用凝血酶切除载体蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体并进行纯化。结果成功构建重组质粒表达体系pET32a(+)-cfp-10-esat-6-ppe68,制得去除载体蛋白的高纯度重组蛋白CFP-10-ESAT-6-PPE68,并成功得到高纯度抗结核分枝杆菌CFP-10-ESAT-6-PPE68蛋白的抗体。结论成功表达结核重组蛋白并制得高纯度多克隆抗体。 展开更多
关键词 CFP-10-ESAT-6-ppe68 重组蛋白 多克隆抗体 结核分枝杆菌
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PPE68基因重组卡介苗的构建及其免疫原性
15
作者 王静娴 徐蕾 +4 位作者 何永林 张壮苗 董志玲 冯鑫 杨春 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2012年第6期665-668,675,共5页
目的构建携带结核分枝杆菌PPE68基因的重组卡介苗(BCG),并检测其诱导小鼠的免疫应答情况。方法将带有分枝杆菌复制子OriM的穿梭质粒pBudCE4.1/PPE68/OriM电转化入BCG中,PCR鉴定重组BCG。用鉴定正确的PPE68/OriM重组BCG免疫BALB/c小鼠,每... 目的构建携带结核分枝杆菌PPE68基因的重组卡介苗(BCG),并检测其诱导小鼠的免疫应答情况。方法将带有分枝杆菌复制子OriM的穿梭质粒pBudCE4.1/PPE68/OriM电转化入BCG中,PCR鉴定重组BCG。用鉴定正确的PPE68/OriM重组BCG免疫BALB/c小鼠,每2周免疫1次,共3次,末次免疫后2周采血,分离血清,检测血清中IgG2a、IFNγ和IL-12水平;取脾、肺,分离脾淋巴细胞,检测经特异性蛋白刺激后淋巴细胞的增殖水平;进行脾CD4+和CD8+T淋巴细胞计数,计算CD4+/CD8+比值;检测脾、肺荷菌量并观察组织病理变化。结果 PPE68/OriM重组BCG经PCR鉴定构建正确;其免疫小鼠后,可诱导小鼠血清中IgG2a、IFNγ和IL-12水平显著增加(P<0.05),脾淋巴细胞增殖显著(P<0.05),CD4+和CD8+T细胞百分比增加,CD4+/CD8+T细胞比值降低,脾、肺均无菌落生长且未见明显病理改变。结论成功构建了PPE68基因重组BCG,其免疫BALB/c小鼠能明显提高小鼠的Th1型免疫效应,有利于机体抗结核菌感染。 展开更多
关键词 ppe68基因 结核分枝杆菌 卡介苗 免疫应答
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重组CFP10-PPE68融合蛋白检测结核分枝杆菌感染的初步应用 被引量:2
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作者 董志玲 杨春 +5 位作者 徐蕾 何永林 冯鑫 王静娴 张壮苗 杨晓燕 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2013年第7期979-982,990,共5页
目的以结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)RD1区特异性培养滤液蛋白10(culture filtrate pro-tein10,CFP10)与戊糖-5-磷酸-3-差异构象酶68(pentose-5-phosphate-3-epimerase68,PPE68)的融合蛋白CFP10-PPE68作为包被抗原,建... 目的以结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)RD1区特异性培养滤液蛋白10(culture filtrate pro-tein10,CFP10)与戊糖-5-磷酸-3-差异构象酶68(pentose-5-phosphate-3-epimerase68,PPE68)的融合蛋白CFP10-PPE68作为包被抗原,建立检测结核病患者血清中MTB抗体的间接ELISA法。方法采用亲和层析法纯化重组CFP10-PPE68、CFP10和PPE68蛋白;分别以3种蛋白作为包被抗原,建立检测结核病患者血清中MTB特异性抗体的间接ELISA法;采用方阵滴定法对建立的间接ELISA法的条件进行优化;并以临床诊断为金标准,对间接ELISA法的特异性、敏感性和准确性进行验证。结果纯化的重组CFP10-PPE68融合蛋白纯度约为70%。分别以重组CFP10-PPE68、CFP10和PPE68蛋白作为包被抗原的最佳包被浓度分别为2、4、4μg/ml,血清最佳稀释度均为1∶1 000,酶标二抗最佳稀释度均为1∶5 000。3种蛋白对肺外结核的诊断效果均优于肺结核,且重组CFP10-PPE68融合蛋白检测肺外结核的特异性、敏感性及准确性均最佳;3种蛋白诊断结核病的特异性较高,而敏感性相对较低。结论以重组CFP10-PPE68融合蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA法诊断MTB感染具有较高的敏感性和特异性,特别是对难以诊断的肺外结核病的诊断有一定的参考价值。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 培养滤液蛋白10 戊糖-5-磷酸-3-差异构象酶 融合蛋白 酶联免疫吸附测定
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结核分枝杆菌CFP10-PPE68融合基因原核表达质粒的构建及表达 被引量:1
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作者 董志玲 何永林 +5 位作者 徐蕾 王静娴 张壮苗 杨静 冯鑫 杨春 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2012年第4期469-472,共4页
目的构建结核分枝杆菌CFP10-PPE68融合基因原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,采用PCR法分别扩增CFP10和PPE68基因,基因拼接法扩增CFP10-PPE68融合基因,克隆至pET-32a(+)载体,构建重... 目的构建结核分枝杆菌CFP10-PPE68融合基因原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,采用PCR法分别扩增CFP10和PPE68基因,基因拼接法扩增CFP10-PPE68融合基因,克隆至pET-32a(+)载体,构建重组表达质粒pET-32a(+)-CFP10-PPE68,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒pET-32a(+)-CFP10-PPE68经双酶切和测序证明构建正确;表达的融合蛋白相对分子质量为68 630,表达量为菌体总蛋白的41.8%,主要以可溶性形式存在,且可与PPE68 rBCG免疫兔血清发生特异性反应。结论成功构建了结核分枝杆菌CFP10-PPE68融合基因原核表达质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了融合蛋白,为其在结核病血清学诊断中的应用奠定了基础。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 培养滤液蛋白10 戊糖-5-磷酸.3-差向异构酶68 融合基因 原核细胞 基因表达
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结核分枝杆菌rv3873基因原核表达载体的构建、表达和纯化
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作者 陈曦 张宗德 +7 位作者 古淑香 贾红彦 刘忠泉 邢爱英 李自慧 杜博平 黄海荣 马玙 《结核病与胸部肿瘤》 2007年第1期6-12,共7页
目的构建结核分枝杆菌(M.tb)rv3873基因原核表达载体并进行表达。方法用PCR扩增MTB rv3873基因,并克隆入pGEM-T Easy质粒。测序正确后,再亚克隆入pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):rv3873重组体。结果以重组体分别转化DH5α和B... 目的构建结核分枝杆菌(M.tb)rv3873基因原核表达载体并进行表达。方法用PCR扩增MTB rv3873基因,并克隆入pGEM-T Easy质粒。测序正确后,再亚克隆入pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):rv3873重组体。结果以重组体分别转化DH5α和BL21(DE3)菌后,经0.4mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,pET30a(+):rv3873表达出分子量为47000左右的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示,IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高。表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中,表达量占全菌蛋白质的50%,Western blot证实其具有良好的抗原性。经Ni—NTA柱纯化,获得纯度为90%的重组蛋白。结论成功地构建原核表达载体pET30a(+):rv3873,并获得PPE68重组蛋白,为辅助诊断结核菌的感染奠定了基础。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 rv3873基因 ppe68重组蛋白
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锌离子依赖的金属蛋白酶-1体内抑制分枝杆菌的抗原处理
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作者 吴宣艳 李鹏 +3 位作者 卢楠 方陈城 杨春 何永林 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第9期1180-1186,共7页
目的:在小鼠体内观察卡介苗的锌离子依赖的金属蛋白酶-1(Zinc metalloprotease-1,Zmp1)对结核分枝杆菌抗原PPE68处理的影响。方法:6~8周龄BALB/c小鼠随机分为5组,分别为p Bud CE4.1空质粒对照组(n=7)、表达PPE68抗原肽的p BudCE4.1-PPE... 目的:在小鼠体内观察卡介苗的锌离子依赖的金属蛋白酶-1(Zinc metalloprotease-1,Zmp1)对结核分枝杆菌抗原PPE68处理的影响。方法:6~8周龄BALB/c小鼠随机分为5组,分别为p Bud CE4.1空质粒对照组(n=7)、表达PPE68抗原肽的p BudCE4.1-PPE68p质粒组(n=9)、表达PPE68抗原的p Bud CE4.1-PPE68质粒组(n=9)、PPE68抗原和Zmp1共表达的p Bud CE4.1-PPE68-Zmp1质粒组(n=10)及PPE68抗原肽和Zmp1共表达的p Bud CE4.1-PPE68p-Zmp1质粒组(n=8)。各组质粒电转化减毒沙门菌株SL7207构建相应的重组沙门菌。以灌胃方式将各组沙门菌免疫小鼠3周。收集小鼠血液和肺肠灌洗液,采用ELISA法测定血清中IFN-γ、IL-12含量及肺与肠道s Ig A的含量;分离培养脾细胞,用CCK-8法检测脾淋巴细胞增殖情况。结果:与PPE68抗原组相比,PPE68和Zmp1共表达组的IFN-γ(117.29±16.86,P=0.034)、IL-12(40.46±7.11,P=0.0037)、淋巴细胞刺激指数SI(3.30±0.49,P=0.004)均降低;与PPE68抗原肽组相比,PPE68抗原肽和Zmp1共表达组相应因子含量下降不明显,IFN-γ(132.75±28.40,P=0.070)、IL-12(55.43±11.78,P=0.198)、SI(4.70±1.57,P=0.124)。结论:卡介苗的Zmp1影响结核分枝杆菌抗原PPE68的处理过程,这可能是影响BCG免疫效果的重要原因。 展开更多
关键词 卡介苗 ppe68 锌离子依赖的金属蛋白酶-1 抗原处理
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结核分枝杆菌三种特异性抗体ELISA检测方法的建立 被引量:1
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作者 牛钦王 李红霞 +2 位作者 曾林子 徐佳楠 陈建平 《热带医学杂志》 CAS 2010年第10期1163-1165,1186,共4页
目的 建立以结核分枝杆菌特异性蛋白ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68为包被抗原检测结核病人血清中特异性抗体的间接ELISA检测方法。方法 利用本室构建并纯化的结核分枝杆菌特异性抗原蛋白ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68,建立结核... 目的 建立以结核分枝杆菌特异性蛋白ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68为包被抗原检测结核病人血清中特异性抗体的间接ELISA检测方法。方法 利用本室构建并纯化的结核分枝杆菌特异性抗原蛋白ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68,建立结核分枝杆菌特异性抗体检测的间接ELISA检测方法:ESAT6-ELISA、CFP10-ESAT6-ELISA、ESAT6-PPE68-ELISA。并与PPD-ELISA同时检测220例结核病人血清、30例非结核呼吸疾病病人血清和50例健康人群血清,分别对三种方法的敏感性与特异性进行统计学分析。结果 ESAT6-ELISA的敏感性为25%,特异性为95%;CFP10-ESAT6-ELISA的敏感性为45%,特异性为93%;ESAT6-PPE68-ELISA的敏感性为48%,特异性为85%。结论 三种结核分枝杆菌特异性抗体检测方法的敏感性均低于PPD-ELISA,但三种结核分枝杆菌特异性抗体检测方法的特异性均高于PPD-ELISA,其中CFP10-ESAT6-ELISA检测的效果最佳,PPE68可作为结核特异性诊断的候选抗原。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 ESAT6 CFP10 ppe68 ELISA
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