2020—2022年闽粤赣地区PRRSV ORF5基因的分子流行病学调查

【目的】了解闽粤赣地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的分子流行动态,为该疫病的科学防控提供参考。【方法】采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对2020—2022年闽粤赣地区1475份临床猪组织和血清样品进行检测,对PRRSV阳性样品进行ORF5基因扩增和测序,并对ORF5基因的序列进行系统发育分析。【结果】2020、2021、2022年闽粤赣地区发病猪PRRSV的阳性率分别为24.23%(95/392)、27.69%(162/585)、18.07%(90/498),2020—2022年福建、广东、江西地区PRRSV的阳性率分别为23.20%(272/1172)、23.96%(52/217)、26.44%(23/87)。挑选来自不同猪场的86份阳性样品进行PCR扩增,成功获得62株PRRSV ORF5基因序列,并下载GenBank已发布的18株2020—2022年闽粤赣地区PRRSV的ORF5基因序列,与127株PRRSV国内外参考株ORF5基因序列构建系统发育树。系统发育树显示,80株闽粤赣PRRSV分离株均属美洲株。其中,40株分布在谱系1(NADC30-like株、NADC34-like株)上,12株分布在谱系3(GM2-like株、QYYZ-like株)上,7株分布在谱系5(VR2332-like株、BJ-4-like株)上,21株分布在谱系8(JXA1-like株、CH-1a-like株)上。对核苷酸和氨基酸序列的同源性进行分析,结果显示,80株PRRSV ORF5基因编码的核苷酸序列同源性为81.2%~100%,氨基酸序列同源性为78.6%~100%。33株PRRSV ORF5基因编码的GP5蛋白氨基酸序列在中和表位区第39氨基酸残基处存在变异。【结论】2020—2022年闽粤赣地区PRRSV流行株以谱系1为主(50.00%),并存在谱系1、3、5、8的混合流行。

PCV-2 ORF2和PRRSV ORF5基因的扩增与双基因真核表达载体的构建

根据GenBank中猪圆环病毒2型ORF2基因序列和猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因序列,分别设计一对引物,应用PCR和RT-PCR扩增出PCV-2 ORF2基因和PRRSV ORF5基因。将PCR产物ORF2经NheⅠ/EcoRⅠ双酶切回收后插入真核表达载体pIRES得到pIRES-ORF2,RT-PCR产物ORF5经NotⅠ/XbaⅠ双酶切回收后插入pIRES-ORF2构建重组质粒pIRES-ORF2/ORF5。对此质粒中的插入片段,进行PCR RT-PCR及双酶切鉴定,同时对插入序列进行测序分析,表明SD1株ORF2与国内多种毒株的同源性为99%,pIRES-ORF2ORF5转移载体ORF5基因的核苷酸推导氨基酸与北美洲原型(VR-2332株)氨基酸同源性为99%。此重组表达载体的成功构建,为进一步研究PCV-2 ORF2及PRRSV ORF5编码蛋白的生物学活性及研究猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒二联核酸疫苗奠定了基础。

表达PRRSV ORF5和PCV2 ORF2基因的重组鸡痘病毒的构建及鉴定

分别将猪圆环病毒2型的ORF2基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒的ORF5基因,插入到鸡痘病毒转移载体pUTA2-16-LacZ单一启动子和复合启动子下游,构建重组鸡痘病毒转移质粒pUTAL-ORF5-ORF2。将该重组质粒与鸡痘病毒282-E4株共转染鸡胚成纤维细胞,进行同源重组。通过3次溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)加压筛选,经RT-PCR、IFA和Western blot鉴定,表明重组鸡痘病毒中的目的基因在鸡胚成纤维细胞中得到表达,获得一株携带有目的基因ORF2和ORF5的重组鸡痘病毒rFPV-ORF2-ORF5。

2014-2017年山东省部分规模化猪场PRRSV ORF5基因的遗传演化分析

为了解山东省规模化猪场猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的流行情况及其分子特征,对2014-2017年其省内96个规模化养殖场的236份疑似PRRSV感染猪的肺脏、淋巴结、脾脏等病料进行RT-PCR检测,并对PRRSV阳性样品进行ORF5基因的克隆测序和遗传演化分析。共检测到阳性样品122份,阳性率51. 7%,测序获得122条ORF5基因序列。所检测PRRSV ORF5核苷酸序列同源性与氨基酸同源性分别是:78. 9%～99. 7%和73. 7%～99. 5%。遗传演化分析结果表明,山东地区主要存在4个Lineage的PRRSV毒株,以Lineage 1(NADC30-like)、Lineage 5(VR-2332)和Lineage 8(Hu N4)的毒株为主要流行株,其中Lineage 1检出率最高(46. 7%)。本研究在2014年检测到的Lineage 1毒株是国内首次报道,可能由美国引入,尚未在我国广泛流行。氨基酸比对分析表明,ORF5基因存在较大变异,但各Lineage毒株在ORF5基因的进化上具有保守性,均具有独特的氨基酸特性。通过对PRRSV ORF5遗传演化分析,表明山东地区PRRS的流行具有广泛的毒株变异特性,毒株的持续变异,增大了PRRS临床防控的难度,同时该研究为PRRS的防控提供一定的数据支持。

含CpG序列PRRSV ORF5基因真核质粒对猪体免疫作用研究

目的:为了增强猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)DNA疫苗免疫效力,以pVAX1为真核表达载体,以PRRSV ORF5基因为目的基因,构建了含有CpG和PRRSV ORF5的真核表达质粒CpG-pVAX1-ORF5,并在猪体进行了免疫试验。方法:检测猪PRRSV的特异性抗体滴度、IL-2水平以及淋巴细胞增殖反应(MTT法)水平,并做了攻毒保护试验。结果:试验结果表明本试验构建的含CpG基序真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5能诱导产生针对PRRSV的体液免疫与细胞免疫(显著的淋巴细胞增殖反应水平)。攻毒结果表明CpG-pVAX1-ORF5组能够有效地抵抗经鼻攻毒,可以保护猪轻微病毒血症,比对照组减少80%,也不表现临床症状,对肺的损害能提供部分保护。结论:CpG的加入可使免疫猪的病变减轻或消失。从而表明含有CpG-ODN能作为PRRSVDNA疫苗的有效佐剂。

PRRSV ORF5基因和CSFVE2基因重组真核表达质粒的构建及小鼠免疫试验

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)已知序列设计3对引物,采用RT-PCR方法扩增PRRSV ORF5基因和CSFV E2基因,目的基因依次插入真核表达载体pcDNA4.0,经PCR、酶切及测序分析,重组质粒构建成功,并命名为pcDNA4.0-ORF5-E2。重组质粒回收提纯后,以100μg/只剂量免疫小鼠,免疫3次。三免后10 d采血并制备血清,用间接ELISA检测小鼠血清中PRRSV及CSFV抗体效价。结果显示,所构建的重组质粒能够诱导小鼠产生PRRSV及CSFV抗体。

2022年鄂西地区PRRSV ORF5基因遗传进化分析

为掌握鄂西地区PRRSV的流行及遗传变异情况,对2022年采自该地区8个县(市、区)的疑似感染发病猪血液、肺脏组织等样品共672份,进行PRRSV实时荧光RT-PCR检测,并对部分阳性样品的ORF5基因序列进行遗传进化分析。结果显示:检出PRRSV阳性样品33份,阳性检出率为5%;通过进一步分型鉴定,23份为HP-PRRSV阳性,占69.7%,10份为类NADC30(NADC30-like PRRSV)阳性,占30.3%;采用DNAstar软件分析4份阳性样品的GP5蛋白氨基酸序列,显示存在多个氨基酸突变,在诱骗表位(27~30 aa)出现29G→29C,在中和表位,HP-PRRSV毒株出现39A→39T,类NADC30毒株出现38A→38T。结果表明,鄂西地区存在高致病性和类NADC30两种PRRSV毒株流行,其GP5蛋白氨基酸序列已发生了多个变异。结果提示,应持续加强PRRSV分子流行病学监测,选择与流行毒株匹配的疫苗进行免疫。

含CpG序列PRRSV ORF5基因真核质粒构建及其免疫原性的研究

【目的】提高猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因免疫的效果,构建含CpG基序和PRRSVORF5的真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5。【方法】经酶切鉴定和序列测定,将重组质粒转染COS-7细胞,经间接免疫荧光试验证实CpG-pVAX1-ORF5可表达PRRSVGP5蛋白。免疫SPF小鼠,检测鼠的特异性抗体滴度、脾T淋巴细胞亚群数量(CD4+和CD8+)以及淋巴细胞增殖反应(MTT法)水平。【结果】本试验构建的含CpG基序真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5能诱导小鼠产生针对PRRSV的体液免疫与细胞免疫。【结论】CpG-ODN可提高PRRSV基因疫苗的免疫效果。

含CpG序列PRRSV ORF5重组质粒在小鼠细胞中的免疫

为了提高猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因免疫的效果,将成功构建含CpG序列PRRSVORF5的真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5免疫SPF小鼠,检测小鼠的脾T淋巴细胞亚群数量(CD4+和CD8+)以及淋巴细胞增殖反应(MTT法)水平。结果表明,构建的含CpG序列真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5能诱导小鼠产生针对PRRSV的细胞免疫。

2014年华南地区PRRSV ORF5基因的遗传变异分析

为了研究华南地区PRRSV的遗传变异情况,本研究对2014年华南地区16份PRRSV阳性样品的ORF5基因进行了RT-PCR扩增、克隆和测序,并将其进行序列比对和遗传进化分析。结果表明：本研究检测的16株PRRSV ORF5基因的核苷酸同源性为82.8%-100%,与JXA1,CH-1a以及VR2332核苷酸同源性分别为84.4%-99.3%,85.9%-95.0%和83.6%-89.2%。遗传进化树分析显示,所获得16株毒株序列中有13株属于以JXA1为代表的变异株亚群,另外3株属于以GM2,QYYZ为代表的新分支亚群。GP5氨基酸位点分析发现新分支亚群存在较为广泛的变异,尤其在信号肽区,诱导表位,中和表位及高变区。

2019—2021年我国部分地区PRRSV ORF5基因遗传变异分析

为了解2019—2022年我国南方地区猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)ORF5基因遗传变异情况,自广东、广西、湖南、江西4个省份的种猪场和育肥场,采集疑似PRRSV感染样品进行RT-PCR检测,并对部分阳性样品进行病毒分离培养和ORF5基因测序。结果显示:PRRSV总检出率为26.12%,其中育肥场场检出率(86.36%)高于种猪场(52.00%);共成功分离到97株病毒并对其进行了ORF5测序分析,发现Sublineage 1.8占比最高(51.55%),其次为Lineage 5(15.46%),Sublineage 1.5、Lineage 8、Lineage 3占比依次为13.40%、10.31%和9.28%;类NADC34毒株在2021年有3个省份(广东、广西和湖南)被首次检出,且当年检出率达13.40%。GP5蛋白分析结果显示,分离株中第13和151位氨基酸以及中和表位变异较多。对其中1株毒株进行重组分析发现,该毒株以类NADC30毒株为主要亲本,其多处基因组与JXA1和IA2014毒株发生了重组。结果表明:我国南方地区PRRSV流行较为普遍,尤其是在育肥猪群中;流行毒株类型较为复杂,但类NADC30毒株是优势毒株;流行毒株毒力位点及中和表位突变较为普遍,且部分毒株出现了重组,这有可能会影响毒株致病性以及现有疫苗的免疫保护效果,需要继续加强监测和研究。

PRRSV BJ-4株ORF5基因的原核表达与重组蛋白的纯化

为成功表达猪繁殖与综合征病毒(PRRSV)结构蛋白GP5,通过PCR方法从重组质粒pGEM ORF5扩增得到缺失N端疏水序列的基因片段dORF5(deletingORF5)。将dORF5克隆至原核高效表达载体pGEX 4T 2,在E.coliBL21细胞中成功表达了重组蛋白GST dORF5,表达产物以包涵体的形式存在,表达量为20 8%。Western Blot结果表明重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。利用融合肽进行亲和层析得到高纯度的重组蛋白,为进一步研究PRRS病毒结构蛋白的结构和功能奠定了基础。

PRRSV NJ-a株ORF5基因A表位的修饰与糖基化位点的突变对其DNA疫苗免疫效力的影响

为了提高PRRSVORF5基因的免疫效力,对ORF5基因进行了改造,将CpG序列和通用型辅助性T淋巴细胞表位插入A表位与B表位之间,并对N33与N51位糖基化位点进行了点突变,获得改造的ORF5基因。在此基础上构建了由两个CMV启动子调控的共表达改造的ORF5(MORF5)与ORF6基因的真核表达质粒pcDNA-M5A-6A。经Western-blot与IFA验证真核质粒的体外表达后,免疫6周龄Balb/c小鼠,利用微量中和试验检测免疫后的中和抗体,利用MTT法检测免疫后淋巴细胞的增生情况,并与未改造ORF5基因真核表达质粒pcDNA-5A-6A、弱毒疫苗以及灭活疫苗的免疫效果进行比较。结果表明,pcDNA-M5A-6A不但能够刺激免疫小鼠在较短的时间内产生更高水平的中和抗体,而且可以诱导产生更强烈的T淋巴细胞增殖反应。所构建的共表达PRRSV改造的ORF5基因与ORF6基因的DNA疫苗pcDNA-M5A-6A,能够较好的诱发小鼠产生较高的特异性针对PRRSV的中和抗体和细胞免疫应答,为研究能够更好地防制PRRSV的新型疫苗提供了新的思路。

两株高致病性PRRSV河南分离株ORF5基因克隆及遗传变异分析

从河南信阳和新乡两地区猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征病料中分离出能引起Marc145细胞病变的病毒,命名为HN1和HN2。采用RT-PCR方法从分离的2株PRRSV中均分别扩增出ORF5基因,并将其克隆、测序。用DNAStar软件分析所测序列,并与北美洲型VR-2332株及国内分离株进行核苷酸和推导的氨基酸同源性比较,绘制系统进化树,结果表明,ORF 5核苷酸与北美洲型的同源性为81.2%～99.1%,与欧洲型Lv株的同源性分别为35.9%和35.3%,推导氨基酸与北美洲型的同源性为84.5%～99.5%,与欧洲型Lv株的同源性分别为46.0%和45.5%。证明新分离到的PRRSV毒株仍属北美洲型。与国内分离的高致病性PRRSV毒株JXA1、HUB1、JX0612、GDZC1、ZQ、SX-1、HB1、HEB1、Hnyz核苷酸同源性达96.5%～99.1%,氨基酸同源性为96.0%～99.5%。分析结果表明,所获得的2个毒株GP5蛋白氨基酸序列中的抗原表位已经发生变异。

高致病性PRRSV的分离及其Nsp2和ORF5基因的序列分析

从广东省不同地区疑似高致病性猪生殖与呼吸综合征病料中分离出能引起Marc-145细胞病变的病毒，经RT-PCR检测，确定分离物中存在美洲型猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），将此细胞病毒液命名为GDBl，用其感染回归5头40日龄健康仔猪，采集发病及死亡猪组织，重新用Marc-145细胞进行病毒分离，将再次分离到的病毒命名为GDB1F。对GDB1、GDBIF的Nsp2、ORF5基因序列进行测定分析。结果表明，单独感染猪2／2发病死亡，同居感染的3头猪全部发病，2头死亡；感染后2～4d所有感染猪均出现体温升高。死亡猪表现为严重的出血性、间质性肺炎，肢体远端皮表出血。序列分析结果表明，GDB1和GDB1F株的Nsp2基因与国内高致病性PRRSV分离株JXA1、HN2Nsp2、HNXT1、HNyz、HUB2、HUN1的同源性很高，达98．4％～99．0％。GDB1和GDB1F株的ORF5基因存在部分突变，没有缺失，与国内高致病性PRRSV分离株JXA1、HUB2、JX0612、GDZC1的同源性高达97．5％～99．8％。

基于PRRSV ORF5基因TaqMan qPCR检测方法的建立及遗传变异分析

为了快速、高效、准确地检出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),并进一步了解河北部分地区的流行毒株遗传变异情况,本研究根据PRRSV经典、高致病性和NADC30代表毒株ORF5基因保守序列设计特异性引物和探针,建立了一种通用型TaqMan qPCR检测方法以实现对猪场的全面筛查,并对筛查出的阳性样品ORF5基因扩增测序后进行遗传进化分析。结果显示:该方法与PRV、PCV2、PEDV、CSFV、TGEV、RV均无交叉反应,特异性强;对重组质粒pMD19T-PRRSV标准品的最低检测下限为2.19×10^(1)拷贝/μL,敏感性高;组内和组间变异系数均小于1%,重复性好;在临床样品检测中较普通PCR有更高的检出率;扩增出的5株PRRSV流行毒株均为美洲型毒株,5株PRRSV流行毒株之间核苷酸序列同源性为82.9%~99.8%,氨基酸序列同源性为82.1%~99.0%;氨基酸序列与国内外已报道的代表株相比在GP5抗原表位及高变区分别存在着不同的差异。结果表明:河北部分地区当前流行毒株复杂多样,优势毒株正从高致病性毒株逐步向NADC30类毒株过渡,提示持续监测PRRSV流行毒株变异动态的必要性,为PRRSV的防控、临床诊断及掌握遗传变异规律提供依据。

PRRSV兰州分离株ORF3和ORF5基因的克隆与序列分析及其杆状病毒表达载体的构建

根据GenBank中猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）中国代表株CH-1a的基因组序列，设计包含完整ORF3、ORF5基因序列的2对特异引物，利用RT-PCR技术扩增PRRSV兰州分离株（Lanzhou株）的ORF3和ORF5基因，并对其进行序列测定，同时与已发表的13株PRRSV进行同源性比较。将扩增的PRRSV Lanzhou株ORF3、ORF5基因分别克隆到杆状病毒表达载体pFastBacHTA上，将经酶切及测序鉴定的阳性重组质粒pFastBacHTA-ORF3、pFastBacHTA-ORF5分别转化到DH10Bac感受态细胞。结果显示，ORF3、ORF5基因长度分别为765bp、603bp，发现核苷酸的同源性分别为88.0％—99.2％、87.3％—99.0％，获得了重组转座子rBacmid-ORF3、rBacmid-ORF5。

PRRSV云南A06株ORF5和ORF7基因的克隆与序列分析

设计2对引物分别扩增PRRSV的ORF5和ORF7基因,对从云南某猪场分离到的毒株A06进行RT-PCR检测,得到2条特异性扩增带,克隆至pMD18-T载体并测序。将A06株的ORF5和ORF7基因及其推断氨基酸序列分别与PRRSV欧洲型代表株LV、美洲型代表株VR2332和7株中国分离的美洲型毒株相应基因进行核苷酸和氨基酸序列比对分析。结果显示,A06株属于美洲型,其ORF5和ORF7基因及推断氨基酸与我国2006年分离的4株HP-PRRSV代表株的相似性高达98%～99%,与欧洲型代表株LV的相似性只有56%～64%。分别构建了以上毒株ORF5和ORF7基因的亲缘关系图谱,反映了A06株ORF5和ORF7基因的进化位置,完成2个基因的遗传变异分析。

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)江苏分离株NJGC ORF5基因的克隆及遗传变异分析

为了分析江苏省流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的遗传变异特征,采用RT-PCR方法对江苏地区分离的PRRSV NJGC株的ORF5基因进行了克隆和测序,利用DNAstar软件与国内外代表性毒株进行了同源性分析与序列对比,并绘制了系统进化树。结果表明:NJGC株属于美洲型PRRSV,其ORF5基因与美洲型代表毒株VR-2332的同源性为90.5%,与中国的经典毒株CH-1a的同源性为92.5%,与中国高致病性PRRSV毒株的同源性在98.0%以上;进化树分析结果显示,NJGC株和高致病性PRRSV在同一进化分支,推测其属于高致病性PRRSV,且与2006年分离的SY0608有更近的亲缘关系,体现了PRRSV具有一定的地域性。同时,该基因编码蛋白的抗原表位和抗原性也发生了变化。依据序列推断PRRSV NJGC株属于具有明显地域性的高致病性PRRSV。

豫西地区PRRSV新近流行株ORF5基因变异及Nsp2基因特征分析

为研究豫西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)新近流行株ORF5基因的变异情况及Nsp2基因的结构特征,采用RT-PCR方法扩增了26份近期采自豫西地区猪场疑似PRRS猪肺脏样品中的ORF5全序列和Nsp2部分序列,并对其生物信息学和结构进行了分析。结果表明:成功扩增出的21株PRRSV流行株间ORF5全基因同源性为96.6%～100%,氨基酸同源性为97.5%～100%;与参考毒株JXA1、MLV、VR-2332和LV的核苷酸同源性分别为96.6%～98.9%、88.4%～89.2%、88.0%～89.5%和66.8%～67.3%;对阳性病料进行了部分Nsp2基因的扩增,测序结果显示,所有流行株的Nsp 2基因与已报道的美洲株VR-2332相比,不存在核苷酸的插入或突变,但存在2个位点共90个碱基的缺失;遗传衍化分析表明,流行毒株属于美洲型。研究结果揭示了豫西地区新近流行的PRRSV ORF5基因的变异情况及Nsp 2基因的特征,为该地区的PRRS防控工作提供了理论依据。