海南番木瓜PRSV和PLDMV病毒发生情况及分子鉴定

对海南昌江、乐东、澄迈、文昌和三亚5个主要番木瓜产区的病毒病发生情况进行调查。对76份番木瓜疑似病毒样品进行检测,检测结果表明海南番木瓜病毒病主要有2种:由番木瓜环斑病毒(Papaya ring spot virus,PRSV)引起的番木瓜环斑病毒病和由番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf-distortion mosaic virus,PLDMV)引起的番木瓜畸形花叶病毒病。其中,番木瓜环斑病毒病最为常见,检出率达77.63%,是影响海南地区番木瓜产业健康发展的主要病毒病;畸形花叶病毒病发生率很低,仅检出2例番木瓜畸形花叶病毒病样品。以PRSV病毒基因组P1和Hc-Pro作为靶标基因进行分子克隆、测序,结果表明海南地区PRSV病毒可明显分为2个株系:HNPRSV-1株系和HN-PRSV-2株系。此外,基于CP基因的系统进化树分析结果表明在海南新发现的PLDMV病毒可能源于台湾和日本。本研究可为开展番木瓜花叶病的防控和创制抗花叶病毒番木瓜新种质提供数据参考。

花粉管通道法介导PRSV-CP基因dsRNA转化番木瓜

以番木瓜‘蔬罗Ⅰ号’植株为受体材料,采用花粉管通道技术将番木瓜环斑病毒外壳蛋白(PRSV-CP)基因3′-端同源序列dsRNA转入番木瓜子房中。用PCR方法对T0代种子进行了分子检测,获得53株转基因番木瓜,转化率达到8.9%;对获得的T0代转基因番木瓜进行了田间抗病性鉴定,结果表明,转基因番木瓜植株对番木瓜环斑病毒(PRSV)表现为不同程度的抗性,可以推迟发病。

转PRSV复制酶基因T_2代番木瓜植株的抗病性测定

转PRSV复制酶基因的番木瓜植株,其自交及杂交二代植株经PCR检测和Southern blot杂交的结果表明:目的基因整合在番木瓜的染色体上.人工接种PRSV的Ys、Vb、Sm株系于分子检测阳性的7～8叶期植株,转基因植株均表现高抗.在定植田间的9个月中,转基因植株无一发病,而对照则全部发病.

西瓜PRSV-W和ZYMV-CH抗性的遗传与连锁分析

番木瓜环斑病毒西瓜株系(PRSV-W)和小西葫芦黄化花叶病毒中国株系(ZYMV-CH)是危害我国西瓜的主要病害。以抗病毒病西瓜野生种质P.I.595203与感病普通西瓜自交系98R为亲本,采用单粒遗传方式得到109个F3代株系。分别对亲本、F1及F3代109个株系群体进行了苗期抗PRSV-W和ZYMV-CH接种鉴定,通过F3代群体的抗感分离情况来推测F2代单株的基因型,并分别对PRSV-W与ZYMV-CH抗性遗传及其这2个抗性基因的连锁关系进行分析。研究结果发现P.I.595203对PRSV-W的抗性是由单隐性基因控制,同时可能存在微效修饰基因,将此基因暂定名为prs-W;同时进一步证实了西瓜对ZYMV-CH的抗性由单隐性基因zym-CH控制,zym-CH和prs-W2个抗性基因在遗传上存在一定连锁关系,其遗传距离是27cM。

混合感染番木瓜PRSV/PLDMV株系基因组全长cDNA的克隆和实时荧光定量PCR分析

番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)与番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV)存在混合感染的现象,近年来混合感染发病率逐年递增,是一种新的威胁番木瓜种植业的病毒病害。运用RT-PCR和RACE方法从混合感染样品中克隆获得2种病毒基因组全长c DNA,分别命名为PRSV-LM和PLDMV-LM,Gen Bank登录号分别为KT633943和KT633944,基因组序列大小分别为10 325、10 153 nt(不包括3′端的poly A)。序列分析表明:PRSV-LM与单独感染样品中的PRSV海南分离物HN(Gen Bank登录号:EF183499)的核苷酸序列和氨基酸序列相似性最高,为94%;PLDMV-LM与单独感染样品中的PLDMV海南分离物Hainan-DF(Gen Bank登录号:JX974555)核苷酸和氨基酸序列相似性最高,分别高达99%和97%。进化树分析显示,PRSV-LM和PLDMV-LM分别与单独感染样品的PRSV和PLDMV海南分离物有共同的进化起源。进一步利用实时荧光定量PCR对混合感染样品的PRSV与PLDMV病毒积累量进行分析,结果表明,混合感染样品中PLDMV病毒积累量大约是PRSV含量的100倍。研究结果为进一步探究PRSV/PLDMV混合感染发病机制奠定基础。

低对比温度下PRSV方程的新温度函数关联式

通过回归C1～C16 16种饱和烷烃的饱和蒸气压值,提出了低对比温度下PRSV方程的新温度函数关联式.新关联式只与温度和偏心因子有关,不需要物质的特征参数,是一种普遍化形式.通过对53种未参加回归的不饱和烃与极性物质饱和蒸气压的计算表明,新温度函数关联式较原PRSV温度函数在低对比温度下计算精度有明显提高.通过计算C1～C16饱和烷烃的饱和液体密度表明,改进的温度函数保持了PR和PRSV方程预测饱和液体密度的精度.

UNIFAC模型与PRSV方程相结合预测二元及三元系统汽液相平衡

采用Ｗｏｎｇ和Ｓａｎｄｌｅｒ混合规则，将ＰＲＳＶ立方型状态方程与ＵＮＩＦＡＣ活度系数模型相结合，给出一种预测混合物相平衡热力学性质的方法，并用５４个二元体系和９个三元体系的实验数据做了检验，结果表明，该法可以较好地预测二元及三元体系的汽液相平衡。

PRSV CP-VPg嵌合型ihpRNA干扰载体转化番木瓜的抗性分析

利用p CAMBIA3300载体为背景,构建PRSV CP-VPg嵌合型植物表达干扰载体p Cambia-hp RNA-CV,通过花粉管通道法将PRSV CP-VPg嵌合型植物表达载体遗传转化番木瓜,并将获得的转化番木瓜种子依次进行除草剂(PPT)筛选、PCR检测。结果表明:获得转基因番木瓜植株5株,且RT-PCR实验证明了目标片段在转基因株系中得到表达。采用人工摩擦接种法对转基因番木瓜株系进行攻毒实验,结果显示转基因番木瓜植株对PRSV病毒表现出抗病特性,说明hp RNA-CV成功的干扰了病毒基因的复制。该研究结果为番木瓜抗PRSV育种提供了一种有效的研究手段。

PRSV NIa-pro、NIa-vpg、NIb酵母双杂交诱饵表达载体的构建及自激活检测

用PCR技术获得NIa-pro、NIa-vpg、NIb基因片段,将这些基因分别克隆到pBD-GAL4载体中,构建酵母双杂交系统的诱饵载体pBD-GAL4-NIa-pro、pBD-GAL4-NIa-vpg和pBD-GAL4-NIb。测序正确后,将重组质粒导入YRG-2酵母菌株,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用。结果表明,获得了正确的NIa-pro、NIa-vpg、NIb基因片段,并成功克隆到pBD-GAL4诱饵载体中,且转化有诱饵载体的YRG-2在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,说明表达产物对酵母细胞无毒性,对报告基因也无自激活作用,为下一步利用酵母双杂交系统检测与NIa-pro、NIa-vpg、NIb蛋白相互作用的蛋白奠定基础。

PRSV-CP基因小hpRNA植物表达载体的构建

将获自海南(prsv-cp hno1～4)、云南(prsv-cp yunnan)和广西(prsv-cp guangxi)的番木瓜环斑病毒株系外壳蛋白(PRSV-CP)基因序列与DQ340771、X97251(来自中国台湾的PRSV株系)以及AY162218、AY231130、DQ374153、S46722、X97251(分别来自泰国、墨西哥、巴西、美国的PRSV株系)等外壳蛋白(CP)基因序列进行比对,在CP基因高保守区设计靶向目标序列进行亚克隆,获得长度为50bp的DNA片段,并通过一步套叠PCR把50bp正向片段和反向片段与拟南芥内含子拼接,成功构建了小hpRNA结构的植物表达载体,为进一步培育安全性好、抗谱广的番木瓜转基因新种质奠定了基础。

PRSV-CP正义、反义RNA植物表达载体的构建

利用基因工程方法构建了RNA介导的正义、反义植物表达载体,并通过电激法导入农杆菌中.经PCR和酶切鉴定证实,成功构建了PRSV-CP正义、反义RNA植物表达载体及其相应的农杆菌工程菌株.这为后续转基因研究及番木瓜抗PRSV分子育种奠定了基础.

接种PRSV番木瓜种苗胞质酵母双杂交cDNA文库的构建与分析

利用Trizol法提取接种PRSV 4 d的番木瓜种苗总RNA,分离纯化mRNA,反转录合成双链cDNA,双链cDNA末端经Pfu-DNA聚合酶补平,与EcoR I接头连接,XhoI酶切消化产生粘端。用Sepharose CL-2B柱分离纯化去除小分子cDNA片段,再与pMyr酵母表达载体连接,转化受体菌XL10-Gold,构建了接种PRSV番木瓜种苗胞质酵母双杂交cDNA文库。所获得的原始文库的克隆总数为1.8×106cfu,重组率为100%,文库滴度为2.6×109cfu/mL。对随机选取的34个克隆进行PCR鉴定,结果表明插入片段长度均大于0.5 kb且集中在1 kb左右。文库质量鉴定结果表明,该文库具有较好的库容量、较高的重组率以及较大的插入片段。

番木瓜抗PRSV突变体的抗病性遗传分析

人工接种PRSV病毒Ys、Vb和Sm 3个株系,分析了番木瓜抗病突变体岭抗1号(LK-1)和美中红(MZH)的杂交后代的抗病性遗传特性,结果表明,F2代对PRSV Ys和Vb株系的抗病表现为由一对基因控制的质量性状遗传,感抗分离比例为3∶1,BC1代感抗分离比例为1∶1,抗病为隐性,感病为显性,表明岭抗1号具对PRSV株系专化性的隐性抗病基因,将该隐性抗病基因暂命名为rys基因。

番木瓜抗病突变抗PRSV基因的RAPD标记分析

利用随机扩增多态性DNA(Randomly amplified polymorphic DNA,RAPD)分子标记和集团分离分析法(Bulked segregation analysis,BSA)分析技术,对番木瓜(Carica papaya L.)F_2代分离群体和抗番木瓜环斑型花叶病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)突变体LK-1的抗PRSV基因进行连锁分析,从250个随机引物中筛选出了与抗PRSV基因相连锁的3个RAPD标记,连锁分析表明,S1366、S7058和S7125与抗PRSV基因(rys)的遗传距离分别为1.9 cM、2.4 cM和12.2 cM,其中S1366和S7058两个标记在抗PRSV基因的一侧,S7125在另一侧。

PRSV对番木瓜叶片防御酶活性的影响

对不同抗性番木瓜(Carica papayaL.)品种人工接种番木瓜环斑型花叶病毒病(Papaya ringspot virus,PRSV)Ys株系,分析其抗病性与叶片中POD、PPO及SOD等防御酶活性及POD同工酶变化的关系.结果表明,接种PRSV-Ys后,抗病突变体“岭抗1号”(暂名)的POD和PPO活性先升后降,上升幅度明显高于感病品种穗中红,后期POD和PPO活性则低于穗中红;SOD活性在初期升高,后期则恢复到正常水平.“岭抗1号”叶片POD同工酶增加1条谱带Rf 0.745.POD同工酶组成型表达及酶活性的变化与抗病相关,可作为评价抗病性的生理生化指标.

致冷剂的PRSV状态方程纯物质参数

由实验蒸汽压数据确定了１１个常用致冷剂和新致冷剂的ＰＲＳＶ状态方程纯物质参数ｋ１。

禾生素、病毒必克和病毒A对番木瓜体内PRSV-CP基因表达的抑制作用

为了解禾生素、病毒必克和病毒A对番木瓜植株体内PRSV基因表达的影响,以组织培养的日升番木瓜为研究对象,以β-actin基因为内参基因,应用RT-PCR技术对番木瓜体内的PRSV-CP基因进行半定量分析,建立一个特异、稳定的RT-PCR半定量检测体系,研究了禾生素、病毒必克和病毒A处理对番木瓜体内PRSV基因表达量的影响。初步说明,0.2%的禾生素及4.0g/L和1.0g/L的病毒必克显著抑制了番木瓜体内PRSV-CP基因的表达,而病毒A及其它浓度的禾生素和病毒必克对番木瓜体内的PRSV-CP基因的增殖没有抑制作用。

番木瓜抗PRSV育种研究进展与展望

综述了番木瓜抗PRSV性状遗传、分子标记辅助选择和抗PRSV育种等方面的研究进展,并对番木瓜抗PRSV育种存在的问题和前景进行了展望。

番木瓜环斑型花叶病毒(PRSV)的为害特征及分子生物学

综述了番木瓜环斑型花叶病毒病(PRSV)主要为害特征、分子生物学特性及检测技术的相关研究进展。

MicroRNA用于创制抗PRSV番木瓜新种质的展望

微小RNA(microRNA,miRNA)是真核生物体内调控基因表达的一类非常重要的小分子RNA,在植物逆境适应过程中发挥着重要的作用。总结番木瓜环斑病毒(papaya ring spot virus,PRSV)致病机理研究的最新进展,探讨miRNA在植物抗病毒中的研究进展和应用前景,提出研究番木瓜miRNA参与抗PRSV机制的途径,为开展番木瓜miRNA研究和创制抗PRSV番木瓜新种质提供理论参考。