PRV-gE^-~PPV混合制剂的细胞感染及动物免疫实验

PPVS-1A毒株和PRV-gE-毒株按一定的比例混合,在ST和BHK-21细胞上,分别测定PPV TCID50和PRV TCID50;接种3-4月龄的PPV、PRV抗体阴性猪,定期采血,分别测定PPV、PRV抗体,结果表明:二者在细胞上无明显干扰现象,具有较好的相容性;免疫猪体,能产生良好的抗体反应,无明显的免疫干扰现象。

A nanobody-based blocking enzyme-linked immunosorbent assay for detecting antibodies against pseudorabies virus glycoprotein E

Pseudorabies(PR)is an acute infectious disease of pigs caused by the PR virus(PRV)and results in great economic losses to the pig industry worldwide.PRV glycoprotein E(gE)-based enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)has been used to distinguish gE-deleted vaccine-immunized pigs from wild-type virus-infected pigs to eradicate PR in some countries.Nanobody has the advantages of small size and easy genetic engineering and has been a promising diagnostic reagent.However,there were few reports about developing nanobody-based ELISA for detecting anti-PRV-gE antibodies.In the present study,the recombinant PRV-gE was expressed with a bacterial system and used to immunize the Bactrian camel.Then,two nanobodies against PRV-gE were screened from the immunized camel by phage display technique.Subsequently,two nanobody-HRP fusion proteins were expressed with HEK293T cells.The PRV-gE-Nb36-HRP fusion protein was selected as the probe for developing the blocking ELISA(bELISA)to detect anti-PRV-gE antibodies.Through optimizing the conditions of bELISA,the amount of coated antigen was 200 ng per well,and dilutions of the fusion protein and tested pig sera were separately 1:320 and 1:5.The cut-off value of bELISA was 24.20%,and the sensitivity and specificity were 96.43 and 92.63%,respectively.By detecting 233 clinical pig sera with the developed bELISA and a commercial kit,the results showed that the coincidence rate of two assays was 93.99%.Additionallly,epitope mapping showed that PRV-gE-Nb36 recognized a conserved conformational epitope in different reference PRV strains.Simple,great stability and low-cost nanobody-based bELISA for detecting anti-PRV-gE antibodies were developed.The bELISA could be used for monitoring and eradicating PR.

2019—2023年锦州地区大型猪场猪伪狂犬病监测数据调查与分析

为了解和掌握锦州地区大型规模化猪场猪伪狂犬病的感染及发病情况,结合2019—2023年近5年间的监测数据,开展对全市4家重点猪场的流调和监测分析工作。监测结果显示,近5年锦州地区抽检的4个大型猪场没有猪伪狂犬病原学阳性病例,在猪血清样品中猪伪狂犬野毒(PRV-gE)均未检测出PRV阳性数据,证明4个猪场没有PRV带毒及污染情况,感染风险极低。

河南省猪伪狂犬病病毒野毒感染血清学调查及gE基因遗传变异分析

【目的】调查河南省猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)野毒流行特征及遗传变异情况。【方法】用ELISA法检测2020-2021年从河南省766个不同养殖规模猪场采集的25411份血清样本的gE抗体水平;采用PCR法对从47个猪场疑似PRV感染猪群中收集的251份病料进行gE基因扩增,并将阳性病料样品接种ST细胞进行病毒分离、gE全基因测序和遗传进化分析。【结果】血清样品gE抗体总阳性率为18.42%,从2020年的20.32%降至2021年的16.69%,猪场阳性率为50.26%。随着猪场规模增大,猪场阳性率、血清样本阳性率呈下降趋势;商品代养殖场、屠宰场和种猪场的场阳性率、血清样本阳性率依次降低;豫东、豫西、豫南、豫北和豫中血清gE抗体阳性率分别为15.05%、23.48%、16.50%、16.69%和20.10%,1-3月阳性率最高,10-12月最低。组织病料样品中PRV阳性率为15.14%(38/251),从PRV阳性病料样品中共分离出9株PRV分离株。gE全基因序列遗传进化分析结果显示,分离株都属于GenotypeⅡ型,且猪群中既有PRV经典株也有PRV变异株。【结论】河南省猪场中仍然存在PRV感染,且同时存在PRV经典株和PRV变异株,本研究结果为河南省猪伪狂犬病的防控与净化提供参考依据。

猪伪狂犬病病毒gE蛋白原核表达及野毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

为了建立一种简单、快速的猪伪狂犬病病毒(PRV)野毒抗体检测方法,试验采用原核表达技术对PRV流行毒株的gE蛋白进行了原核表达,以表达的重组蛋白作为包被抗原建立了检测PRV野毒抗体的间接ELISA检测方法。结果表明:获得了以包涵体形式表达的重组gE蛋白,经Western blot鉴定表明重组gE蛋白具有良好的免疫学活性,以该蛋白作为包被抗原建立的检测PRV野毒抗体的间接ELISA方法检测PRV疫苗免疫血清、CSFV、PRRSV、PCV-2、PPV、PEDV、FMDV阳性血清均为阴性,检测PRV野毒阳性血清的最低检出效价为1∶10240,批内和批间重复性试验的变异系数分别为2.19%~3.33%和3.01%~4.40%,与国外商品化gE-ELISA试剂盒的符合率达98.72%,应用该ELISA检测河南省部分地区采集的1128份猪血清样品,PRV野毒抗体阳性率为8.07%。说明建立的PRV野毒抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和临床适用性,为PRV野毒抗体的流行病学监测和净化提供了技术支持。

安徽部分地区规模化猪场伪狂犬病血清流行病学调查

为了解安徽地区不同规模猪场猪伪狂犬野毒(PRV-gE)的感染情况,为防控猪伪狂犬病(PR)提供科学依据,本调查应用ELISA方法,对2012年8月~2015年12月来自224个不同规模猪场的11 855份血清样品进行PRV-gE抗体检测。结果显示,血清样品总阳性率为14.03%,2012年8月~2015年12月分别为2.76%、5.12%、11.61%、26.61%;育肥猪、哺乳仔猪、母猪、保育猪、后备母猪及公猪依次为31.02%、29.27%、27.46%、22.29%、22.22%、18.52%,皖北、皖南和江淮地区分别为28.59%、9.59%、6.49%。猪场总阳性率为41.96%,大型规模场、中等规模场、小型规模场及散养户分别为4.74%、17.00%、23.15%,皖北、皖南和江淮地区分别为48.48%、35.71%、38.53%。结果表明,安徽地区猪群中PRV感染逐年上升,皖北地区样品阳性率显著高于其他地区,其中小型规模场及散养户的感染尤为严重,育肥猪和种猪带毒是伪狂犬病持续存在的重要原因,养殖方式、疫苗免疫、生物安全等因素均对PR的流行产生影响。

闽西地区猪伪狂犬野毒株感染的血清学调查

美国IDEXX公司生产的PRV-gE（gE-ELISA）酶联免疫试剂盒,能对已免疫PR缺失gE的基因工程疫苗或未免疫的猪群,区分疫苗株和野毒株感染。2005～2007上半年,对闽西地区使用gE-基因缺失疫苗的规模化猪场母猪、仔猪和生长猪,不分健康状况,进行PR野毒株感染的血清学调查,结果显示2005年至2006年上半年,该地区母猪PR野毒感染阳性率较高,达41.5%和43.8%,2006年下半年至2007上半年,该地区母猪PR野毒感染阳性率有较大幅度的降低,且阴性猪场很多,阳性率分别是21.3%和13.3%。同时3年来对54个规模化猪场监测结果分析,各猪场阳性率差异很大,3年来猪场阳性率也呈大幅度下降,2007年上半年猪场阳性率仅为33.3%。对仔猪和生长猪的监测结果显示,阳性率比母猪大大降低,并且也呈下降的趋势。

猪伪狂犬病-猪细小病毒病二联苗的安全性与免疫力试验

PRV-gE--PPV弱毒疫苗接种后备母猪和怀孕母猪,临床上未见不良反应,并且怀孕母猪在预产期内顺利产下健康仔猪,表明PRV-gE--PPV弱毒疫苗具有良好的安全性。PRV-gE--PPV弱毒疫苗免疫后备母猪,2周后,PPV抗体100%(8/8)转为阳性,PRV抗体85.7%(7/8)转为阳性,能产生良好的抗体反应。在免疫接种后2个月、4.5个月进行强毒攻击,免疫猪未见不良反应,对照猪未见或出现轻微的不良反应。从免疫猪的鼻、肛分泌物和血浆中未分离到PPV,而从对照猪的鼻、肛分泌物和血浆中分离到PPV和PRV。表明PRV-gE--PPV弱毒疫苗能抵抗PPV、PRV的攻击,具有良好的免疫保护力。

猪伪狂犬病与猪圆环病毒病混合感染的PCR诊断

为了解猪场20日龄内的仔猪发病死亡的病因,对2头病猪的肺脏、淋巴结、脑等组织进行病原学诊断。对2头病猪的组织样进行PCV2-ORF2基因、PRV-gE基因的PCR扩增。结果表明样品均能扩增出PCV2-ORF2基因、PRV-gE基因的特异性条带,这与预期的片段大小相符,说明这2头仔猪的病因为猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂病病毒野毒(PRV-gE)混合感染。这为猪场疾病的诊断和治疗提供实践与理论依据,对分析猪场接种疫苗产生免疫抗体的效果进行评估,从而不断地制定并完善免疫程序。

2018年北疆地区猪伪狂犬病病毒gE、gB蛋白抗体ELISA检测及分析

为调查北疆地区猪群伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)野毒感染的情况,试验应用猪伪狂犬病病毒gB、gE抗体检测试剂盒,对北疆地区6个规模化养猪场共401份血样进行PRV-gB和PRV-gE两种蛋白的抗体检测。结果发现6个规模化养猪场的PRV-gB平均抗体阳性率为93.27%(374/401),D场的抗体阳性率最高,为100.00%,C场的抗体阳性率最低,为55.00%。6个规模化养猪场的PRV-gE平均抗体阳性率为45.14%(181/401),E场的阳性率最高,为86.23%,C养殖场的阳性率最低,为0。对不同日龄的猪群分析,PRV-gE蛋白的阳性率最高为公猪68.06%,最低为保育猪12.00%;PRV-gB蛋白的阳性率最高为肥育猪、公猪均为100%,最低为后备猪84.21%。试验表明,北疆地区猪群存在野毒感染,各猪场之间感染情况不一,不同类别猪群之间PRV-gE、PRV-gB蛋白抗体水平存在差异。

闽西南地区部分规模化猪场猪伪狂犬野毒感染的血清流行病学调查

为了掌握闽西南地区规模化猪场猪伪狂犬野毒感染状况和流行趋势,应用ELISA方法对2012-2014年闽西南地区的859个规模化猪场22324份血清进行PR野毒感染血清学调查。调查结果显示被调查的猪场血清样品总阳性率为21.8%,场阳性率为57.0%;母猪、公猪、哺乳小猪、保育猪、育肥猪及后备猪的血清样品总阳性率分别为22.0%、23.7%、16.7%、15.6%、19.2%和27.2%,不同阶段的猪群PRVgE抗体阳性率差异显著(P<0.01)。2012年-2014年猪场阳性率分别为46.7%、45.4%和57.0%,血清样品阳性率分别为20.5%、18.4%和25.4%;血清样品阳性率在30%以上的猪场比例逐年上升,分别为14.8%、19.9%和32.2%;不同地区猪场PR野毒感染情况不同。结果表明近年闽西南规模化猪场猪伪狂犬病野毒感染压力依然很大,猪伪狂犬病的控制与净化形势严峻。

伪狂犬病病毒gE基因在昆虫细胞中的高效表达

In order to develop a simple and safe test for the detection of vaccinated as well as wild type Pseudorabies virus (PRV) infected pigs,the modified gE gene of PRV Ea strain,obtained by cutting the 5’ UTR using PCR and DNA recombinant technique,was inserted into baculovirus expression vector pFastBac 1,resulting the trans-position plamid pFE1.75.After homologous recombination,recombinant baculovirus rvBacE1.75 was gained and high level expression of glycoprotein E (gE) was observed after the infection of rvBacE1.75 to Tn-5B1-4 cells.The expression product was 80～88kD and was specific to antisera against PRV Ea strain by Western-blotting.Purified recombinant proteins were used as an antigen in Latex Agglutination Test(gE-LAT) and the test was specific,sensitive,safe and simple.

伪狂犬病病毒gE基因主要抗原表位区的原核表达及其在疫苗接种和自然感染鉴别诊断中的应用

根据伪狂犬病病毒 (PRV)Min A株gE基因序列 ,利用PCR方法扩增了PRVgE基因不含信号肽、胞内区和跨膜区的主要抗原表位区 ,并克隆到原核表达载体pGEX 6p 1中 ,获得的重组质粒命名为pGEX tgE。经SDS PAGE电泳分析证实克隆的部分gE基因获得了表达 ,融合表达产物大小约为 6 3kD ,并在终浓度为 0 6mmol L的IPTG诱导下 ,3 5h其表达量达到高峰。通过改变诱导条件 ,有效抑制了包涵体形成 ,提高了重组蛋白的溶解性。Westernblot分析证实表达的重组gE蛋白具有抗原反应活性。将表达产物利用亲和层析法纯化后作为ELISA抗原 ,通过对其特异性、敏感性及工作条件的优化试验 ,和对 4 8份PRV阴性血清样品的检测结果的统计学分析 ,建立了猪伪狂犬病tgE ELISA鉴别诊断方法。通过对 4 0 0份送检血清样品的检测结果分析 ,表明其与PRV全病毒ELISA试验的符合率高达 95 %以上 ,与基于抗gE蛋白单抗竞争性ELISA的符合率达 94 %。

伪狂犬病病毒广西B、W株gE基因的扩增、克隆及序列分析

在已鉴定了的伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus,PRV)11种糖蛋白中,gE是其中十分重要的一种非必需糖蛋白,是伪狂犬病病毒重要的毒力基因,它在介导感染细胞的融合,病毒在细胞间的扩散,病毒粒子的释放等方面均起着十分重要的作用[1],尤其是在影响伪狂犬病病毒神经嗜性和毒力方面的作用.利用PRV gE基因缺失疫苗,结合血清学方法可以区分疫苗接种猪和野毒感染猪[2].

猪伪狂犬病毒的分离鉴定及其gE、TK全基因序列遗传变异分析

将分离到的8种PRV分离株的g E、TK基因与国内外的毒株进行核苷酸及氨基酸的序列同源性分析,结果发现,分离毒株的gE、TK基因与15株国内外已发表的代表毒株核苷酸及氨基酸的序列同源性分别为97.3%~99.9%、98.7%~99.9%;遗传进化分析结果表明,分离毒株与国内近年分离自不同省份的代表毒株亲缘关系较近,与国外分离的代表毒株亲缘关系较远;而对gE、TK基因氨基酸主要变异位点分析表明,gE和TK基因都有一些位点已经发生突变。结果表明猪PRV广东部分地区分离毒株已发生变异,为规模化猪场对猪伪狂犬病的净化以及疫苗的选择提供参考。

鉴别猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR诊断方法的建立和应用

为建立猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因缺失疫苗和野毒感染的快速鉴别诊断方法,本研究根据猪伪狂犬病野毒具有gD表面抗原基因和gE毒力基因,而基因缺失疫苗只有gD基因无gE基因的特性,针对gD/gE基因的5′端核苷酸序列自行设计引物,建立鉴别PRVgE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR诊断方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的检测方法对临床疑似样品进行了检测。结果表明,成功建立了鉴别PRV gE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR诊断方法,该方法灵敏度高,最低检出限为100拷贝/μL;重复性好;特异性强,可特异性地扩增出PRV细胞毒中的gD和gE基因及gE基因缺失疫苗毒中的gD基因,但对PK-15细胞和猪流行性腹泻病毒等其他8种病原扩增不出任何条带;自835份临床疑似PRV感染病料中共检测出PRVgD和gE基因双阳性样品即野毒感染阳性样品267份,PRVgD基因单阳性样品28份,选取该方法检测出的26份PRV野毒感染阳性样品用于病原分离培养,两种方法的符合率为96.1%。说明本试验建立的二重PCR鉴别诊断方法快速、灵敏、特异,对于临床上疫苗毒和野毒感染的快速鉴别诊断具有重要意义。

2017-2019年河南省猪伪狂犬病监测

为了解近年来河南省猪伪狂犬病(PR)流行情况,2017—2019年对河南省种猪场、商品代猪场、散养户和屠宰场,共1454场次的44059份猪血清进行了猪伪狂犬病病毒(PRV)gE抗体检测,对种猪场、商品代猪场、屠宰场和无害化处理厂,共807个场次的12824份猪组织样品进行了病原学检测,并对检测结果进行了时间、空间和群间分布分析。结果显示:2017—2019年河南省PRV gE抗体个体阳性率为27.89%,场群阳性率为53.51%;病原个体阳性率为2.47%,场群阳性率为11.65%。2017年和2019年的PRV感染率较为接近,2018年较高;冬春季节和夏季PRV感染率较高(P<0.05);豫西、豫北和豫中地区PRV感染率明显高于豫东和豫南地区(P<0.05);屠宰场和商品代猪场PRV感染率明显高于种猪场和散养户(P<0.05)。结果表明,河南省猪群PR流行具有一定的季节、区域和场群分布特点,可依据其流行特点,分区域、按场点,以种猪场为中心,分类指导、梯度推进全省PR净化工作。

福建省龙岩市规模化猪场伪狂犬野毒感染的血清学调查

为了掌握龙岩市规模化猪场猪伪狂犬野毒感染状况和流行趋势,应用IDEXX的PRV-gE抗体试剂盒,对2007～2009年龙岩市新罗区、连城、上杭、武平、永定、漳平、长汀的规模化猪场进行PR野毒感染血清学调查。结果表明:2007～2009年PRV野毒抗体样品阳性率分别为19.2、17.2、18.0%,猪场阳性率分别为54、65、64.6%,三年来的样品阳性率和猪场阳性率没有明显的变化,依然存在感染压力。PR野毒感染随季节的变化有一定的规律性,在每年1月到2月期间,猪PR野毒抗体阳性率都会大幅上升,夏秋两季PR感染率在一年中总体较高。种猪群是所有调查猪群中PR野毒抗体阳性率中最高的,是猪场伪狂犬野毒的主要来源,饲养密度大的区域PR野毒抗体阳性率较高。本次调查结果对指导规模化猪场猪伪狂犬病的控制与净化具有重要的现实意义。

伪狂犬病病毒Fa株gE基因在大肠杆菌中的表达及gE-ELISA鉴别诊断方法的建立

试验以pPGE DNA为模板,用1对分别含有EcoRⅠ和Bam HⅠ酶切位点的伪狂犬病病毒gE基因特异性引物,扩增出约1.7kb的含完整gE基因的DNA片段;目的片段经EcoRⅠ和Bam HⅠ双酶切后,插入原核表达载体pBV220得到重组表达质粒pBVgE,并转化大肠杆菌DH5α;对温敏诱导表达所获产物进行SDS-PAGE、Western-Blot和琼脂双扩散检测。结果表明,gE糖蛋白得到了高效表达,表达产物约占总蛋白的17%。为了鉴别伪狂犬病疫苗免疫猪和自然感染猪,用表达纯化的gE蛋白为抗原,建立了GE-ELISA方法。选定的反应条件包括GE抗原包被浓度为6.6mg/L,血清最适稀释度为1∶40。测试结果:与PRV、HCV、PRRSV、JEV、SA215阳性血清呈阴性反应,而与PRV标准阳性血清呈阳性反应。这一结果表明该法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于猪伪狂犬病的临床诊断,尤其疫苗免疫猪和自然感染猪的鉴别。

伪狂犬病毒GDSH株的分离鉴定及gE基因的序列分析

从广东四会某猪场分离到一株疑为猪伪狂犬病病毒(PRV)的病毒,病毒在猪肾细胞上出现细胞变圆、拉网、融合等典型病变,并具有细胞泛嗜性特点。在MDCK细胞上测得其TCID50值为10-8/0.1mL,能被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和。将0.1mL病毒液接种小鼠后发生奇痒并麻痹致死,接种猪3天后发病,7天死亡,从攻毒病死猪的脑组织病理切片上观察到典型的病毒性脑膜脑炎及血管套现象。通过PCR扩增到PRVgD基因,由此进一步证明所分离病毒为猪伪狂犬病毒,并命名为GDSH株。根据GenBank中发表的序列,设计一对扩增PRVgE基因的特异性引物,建立可以区分PRV野毒株与疫苗株的PCR诊断方法。以此方法对病毒的细胞培养液进行检测,结果证实所分毒株为PRV野毒株,经克隆测序后与GenBank收录的其它PRVgE基因序列进行比较,发现所测毒株的核苷酸序列与其它PRV毒株的同源性介于98.3%～99.9%之间,其中与PRVEa株的亲缘关系最近为99.9%。