转宿主粘虫颗粒体病毒(PuGV-Ps)增效蛋白基因的克隆表达及活性

以东方粘虫为转宿主增殖的颗粒体病毒(PuGV Ps)DNA为模板通过PCR反应扩增出一条2.7 kb的特异性基因片段,纯化的PCR产物克隆到载体质粒pET 15b中,构建重组质粒pET 15b En,重组质粒外源基因测序证明PCR扩增产物是粘虫颗粒体病毒转宿主病毒PuGV Ps增效蛋白的全长基因。与原始美洲粘虫颗粒体病毒(PuGV)增效蛋白基因的序列比较,两者同源性达99.59%。11个突变碱基中有7个集中在5′端下游500 bp,而3′端上游500 bp仅1个碱基发生突变。PuGV Ps增效蛋白基因重组质粒pET 15b En转化到大肠杆菌中构建重组菌,在IPTG诱导下表达了108 kD的表达产物,Ni2+柱纯化证明表达产物是目标增效蛋白。LB培养液中加入0.2%的葡萄糖后有利于增效蛋白基因的表达。生物测定结果表明,粗提的表达产物具有增效活性,可以提高Btδ内毒素对棉铃虫、甜菜夜蛾的敏感性。

Alzheimer病患者APP及PS1基因的表达水平

为了检测Alzheimer病(Alzheimer’s disease,AD)患者外周血中淀粉样前体蛋白(Amyloid Precursor Protein,APP)基因及早老素1(Presenilin 1,PS1)基因的表达情况,进而探讨APP及PS1基因的表达与AD的相关性,采用SYBRGreenⅠ的方法对45例AD患者、25例血管性痴呆(vascular dementia,VD)患者及60名正常对照组样本的mRNA进行绝对定量,检测得到APP基因及PS1基因在对照组中的表达水平分别为0.026±0.005 amol/μg cDNA和0.026±0.004 amol/μg cDNA;在AD患者组中的表达量分别为0.044±0.006 amol/μg cDNA和0.051±0.011amol/μg cDNA;,在VD患者组中的表达水平分别为0.072±0.013 amol/μg cDNA和0.039±0.005 amol/μg cDNA。经显著性检验,AD患者组APP基因的表达水平上调,t=2.639,P<0.01;PS1基因的表达水平同样呈上调趋势,t=2.173,P<0.05,差异均具有统计学意义。VD患者组APP基因的表达水平上调,t=3.028,P<0.01;PS1基因的表达水平也同样呈上调趋势,t=2.012,P<0.05,均有显著性差异。因此,APP及PS1基因的表达水平的增高并不一定与AD发生特异性关联,而可能与多种导致痴呆的脑部病变发生关联。

番茄ps-2雄性不育系01222的育性观察

对从保加利亚引入并选出的含有番茄ps - 2基因的雄性不育新品系 0 12 2 2进行了杂交制种试验。结果表明 ,该不育品系虽然会发生自交 ,但座果率极低 ,其中正常果率只占 2 9% ,其余均为僵果。通过开花后 1～ 3d人工去雄授粉和蕾期去雄杂交制种试验比较说明 ,即使 3d后的处理杂交种子纯度仍可达 99%以上 ,符合国际种子质量标准 ,但是杂交座果率、单果种子含量却随开花天数的增加而降低 ,以蕾期和开花后 1d处理最佳。表明该不育系是一个很有应用价值的新材料。

APPswe/PS△E9双转基因小鼠脑组织miRNA的表达

目的观察APPswe/PS△E9双转基因小鼠与正常小鼠脑组织内miRNA的差异表达,探索miRNA在阿尔茨海默病中的可能作用。方法采用6月龄APPswe/PS△E9双转基因小鼠作为实验组,同月龄、同种系野生型小鼠C57作为对照组,基因芯片检测两组小鼠脑组织miRNA表达;比较两组小鼠miRNA的差异表达。结果与对照组比较,实验组中表达上/下调2倍以上的miRNA有miRNA-135a、miRNA-135a-2*、miRNA-298、miRNA-466b-3p、miR-669-3p、miR-142-5p、miR-144、miR-466f-3p、miR-466g、miR-200a、miR-200b、miR-96等12种,但有统计学意义(P<0.05)的均是下调的5种miRNA:miRNA-135a、miRNA-135a-2*、miRNA-298、miRNA-466b-3p和miR-669-3p。结论 miRNA-135a、miRNA-135a-2*、miRNA-298、miRNA-466b-3p和miR-669-3p可能是在APPswe/PS△E9双转基因小鼠发病中有意义的miRNA。

阿尔采末病淀粉样前体蛋白(APP)和早老素-1(PS-1)双重基因稳定转染细胞系的建立

目的 构建APP751和PS 1(M14 6L)双重基因稳定转染的中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞系 ,以用于 β 分泌酶或γ 分泌酶抑制剂的研究和相关药物的筛选。方法 从人胎盘基因文库中用多聚酶链反应 (PCR)方法扩增野生型和突变型PS 1(M14 6L)基因 ,并重组克隆到PCI neo质粒 ,用脂质体 (Lipo fectAmine)法将野生型和突变型 (M14 6L)PS 1转染至含APP751表达基因的CHO细胞 ,选择培养液筛选能稳定表达目的基因的CHO细胞株。用免疫沉淀和ELISA测定分析细胞表达产物。结果 建立了数株能表达Aβ和PS 1的CHO细胞。在转染细胞株中高表达的SP 1为全长 4 5kd的PS 1蛋白 ;野生型PS 1和突变型PS 1(M14 6L)以及单纯APP751转染的CHO细胞株均可分泌Aβ多肽 ,且突变型PS 1(M14 6L)转染的细胞株分泌到条件培养液中的Aβ1～ 42 比其它细胞株增加了近两倍。结论 突变型PS 1(M14 6L)的高表达可促使Aβ1～ 42 的分泌增加。我们建立的PS 1和APP双重基因稳定转染的CHO细胞株模型 ,可用于 β 分泌酶或γ

PS_2基因在乳腺癌中表达的临床意义

目的 探讨雌激素调节蛋白PS2 在乳腺癌中的表达及其临床意义。方法 应用免疫组化S P法 ,对 4 8例人乳腺浸润性导管癌中PS2 进行检测 ,分析其与ER ,PR以及预后的关系。结果 PS2 与ER呈显著正相关。在ER(+)PR(+)的病人中 ,PS2 阳性率达 6 7 9% ,而在ER(- )PR(- )的病人中PS2 阳性率仅为 12 5 % ,二者相比有显著性差异 (P <0 .0 1)。PS2 阳性表达与病人长生存期呈正相关 ,与腋窝淋巴结转移无相关性。结论 在预测乳腺癌抗雌激素治疗的效果时 ,PS2 要优于ER ,PR。同时PS2 阳性的乳腺癌患者预后较好 ,PS2

早老素1基因突变所致早发型阿尔茨海默病4例临床报道

目的:报道4例经过脑脊液阿尔茨海默病(alzheimer's disease,AD)标志物和基因检测确诊的PS-1基因杂合突变的早发型AD患者临床表现和病情进展速度的差异。方法:4例早发型痴呆患者通过痴呆家族史调查、神经心理学评估、神经系统查体、头颅MRI、脑脊液AD标志物和全外显子测序检测。结果:此4例患者脑脊液AD标志物检测结果均符合ATN诊断框架,并且均经过基因全外显子测序确认为PS-1基因杂合突变,病例1为携带PS-1杂合突变位点(c.1186G>A),病例2和病例3携带PS-1基因同一杂合突变位点(c.791C>T),病例2同时携带额颞叶痴呆致病基因GRN基因杂合突变位点(c.329G>A),病例4携带PS-1基因杂合突变位点(c.265G>C),其中病例1、病例3和病例4均有痴呆家族史,病例2无痴呆家族史,病例2和病例3发病年龄相同,但是病例2的病情进展速度明显快于病例3,病例4的发病年龄为38岁,明显早于其家族其他成员痴呆发病年龄(50岁),病例4在儿童时期有脑震荡病史。结论:PS-1基因突变所致早发型AD并非皆有痴呆家族史,从头突变并不少见,不同PS-1基因突变位点导致AD发病年龄不同,同一PS-1基因杂合突变导致AD发病年龄相同,但是后天因素包括教育程度、工作的复杂程度和脑外伤等也会对PS-1基因突变所致早发型AD的临床表现和进展速度产生显著影响。

绿色荧光蛋白和潮霉素抗性双标记载体转化草酸青霉菌P8的研究

草酸青霉菌P8(Penicillium oxalicum)溶磷菌株具有较强的溶解多种无机难溶磷的能力和促进作物生长的作用。为研究P8在作物根际的定殖状况,用携带加强型绿色荧光蛋白和潮霉素抗性的双标记载体转化溶磷青霉菌P8的原生质体,筛选出稳定、高效表达GFP并对潮霉素产生抗性的转化菌株,Southern杂交分析结果显示,外源质粒DNA是以非同源重组方式整合到转化菌株基因组染色体上。试验证明转化菌株的形态学特征和溶磷能力与野生型菌株无明显差别。

中国(辽宁地区)汉族腮腺唾液中带快蛋白带慢蛋白和变异体蛋白型分布的研究

本文以浓缩的唾液为样本,用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法,调查了338名辽宁地区汉族人群的PmF、PmS和Ps型的分布。其基因频率为Ps^10.391、Ps^20.064、Ps°.545;PmF^+0.47、PmF^-0.53;PmS^+0.412、PmS^-0.588。按Hardy-Weinberg法则进行吻合度检验,Ps系统的观察值与期望值高度一致(0.975<P<0.990)。三个系统的总鉴别机率和总非父排除率分别为0.86和19.54％,是一项很有意义的遗传标记系统。

聚苯乙烯微塑料对污水中胞外耐药基因的影响及其机制

微塑料(MPs)和抗生素耐药基因(ARGs)是共存于污水处理厂中的典型新污染物.MPs已被证明能够改变污泥中ARGs的分布模式,但其对污水中胞外ARGs(fe ARGs)的影响及机制仍不清楚.采用荧光定量PCR技术探究了典型MPs(聚苯乙烯PS)暴露60 d后污水中fe ARGs(包括tet C、tet O、sul1和sul2)的动态变化特征及机制.结果表明,四环素类fe ARGs绝对丰度在nm级和mm级PS暴露下分别降低了28.4%~76.0%和35.2%~96.2%,在μm级PS暴露下变化了-55.4%~122.4%.PS对磺胺类sul1的促进效果呈nm级>μm级>mm级趋势,且ρ(PS)为50 mg·L^(-1)对sul1丰度扰动幅度更大.磺胺类sul2的相对丰度在μm级和mm级PS暴露后分别削减了25.4%~42.6%和46.1%~90.3%,在nm级PS暴露后增加了1.9~3.9倍;ρ(PS)为50 mg·L^(-1)对sul2的削减作用高于ρ(PS)为0.5 mg·L^(-1).Pearson相关性分析显示,PS暴露下fe ARGs相对丰度与细胞膜通透性和典型可移动遗传元件(int I1)丰度成正相关,与活性氧水平成负相关.研究结果阐明了PS对污水中fe ARGs的影响及其机制,可为污水中MPs与ARGs复合污染的防治提供科学依据.

磷硫代siRNA的YAP基因沉默活性研究

为了探究RNA聚合酶酶促合成非对映体纯PS-siRNA(pPS-siRNA)的基因沉默活性,本研究针对潜在的癌症治疗靶点Yes相关蛋白(YAP),通过qPCR、Western blot等方法研究了其对YAP基因的沉默效果和对HeLa细胞的细胞毒性.结果表明,与未修饰的siRNA(PO-siRNA)相比,pPS-siRNA可以更好地下调YAP基因表达(效率提高约30%),而没有明显的细胞毒性.此外,MTT细胞增殖实验与流式细胞术的结果表明,经pPS-siRNA敲降YAP后,HeLa细胞的增殖受到了抑制.说明pPS-siRNA在基因治疗方面具有优越性以及YAP作为肿瘤治疗靶点的潜力.

番茄ps-2基因的SSR及CAPS标记开发

含有ps-2雄性不育基因的番茄材料可通过自交获得100%的雄性不育后代,从而方便地应用于番茄杂交制种。以优良的加工番茄品系92155为父本,以来自保加利亚含有ps-2基因的不育材料CMC1ps2为母本,构建了123个F2代分离群体,育性表型分离比例完全符合孟德尔遗传规律,为隐性单基因。根据番茄形态和分子标记整合遗传连锁图谱,选取相应的SSR、RFLP及COS标记,分别筛选了5对SSR引物、13对由RFLP探针序列转化来的CAPS引物及1对COSⅡ引物。经连锁遗传分析,获得了与ps-2基因紧密连锁的1个SSR标记(SSR450)和1个CAPS标记(命名为TG123),它们与ps-2基因的连锁遗传距离分别是4.9cM和11.6cM,位于该基因两侧,均为共显性标记。这两个标记的获得可直接用于标记辅助育种和杂种纯度鉴定,加速番茄雄性不育的转育与利用。

陆地棉光合系统Ⅱ GhPsbS基因的克隆及其表达分析

以拟南芥光合系统Ⅱ PsbS蛋白序列为探针,采用电子克隆与同源克隆结合的方法得到陆地棉光合系统Ⅱ PsbS基因的cDNA序列(GenBank No.ANS53414),进行序列分析,并对其在不同处理下的表达水平进行研究。结果表明:该基因开放阅读框全长837 bp,编码278个氨基酸,蛋白分子量大小为22 kD,为疏水性蛋白,含有两个典型的捕光叶绿素a/b结合蛋白功能域,属于典型的叶绿素a/b结合蛋白家族中的成员。qRT-PCR分析表明,强光、弱光、干旱、高盐、低温胁迫处理后,该基因的表达量整体均呈下降趋势,推测该基因不仅能响应不同光照处理,还能够响应干旱、高盐和低温胁迫,尤其受弱光、高盐和干旱胁迫的诱导表达较为明显。该研究为进一步了解GhPsbS基因对陆地棉高光效育种及抗逆机制的研究提供帮助。

新疆维族肺血栓栓塞症患者的PS-K196E多态性探讨

目的探讨蛋白S基因1(protein S1,PROS1)赖氨酸196谷氨酸的(PS-Lys196 Glu即PS-K196E,单字母命名法K-Lys,E-Glu)多态性与新疆地区维族人群肺血栓栓塞症(pulmonary thromboembolism,PTE)发生的相关性。方法采用病例—对照研究,病例组为经放射性肺通气/灌注显像和(或)螺旋CT肺动脉造影检查,并结合临床资料确诊的PTE患者100例,对照组为来自同一地区,性别、年龄匹配的健康对照100例。用酶联免疫吸附试验法测定PS活性(PS:A)。Massarray技术平台进行芯片点制及质谱检测PS-K196E的多态性。结果 PTE组和对照组的PS抗原活性分别是53.84%和90.50%,K196E突变杂合子携带者的PS活性降低到70.29%,纯合子携带者的PS活性降低到49.85%,差异具有统计学意义;病例组和对照组AG基因型的频率分别是55%和40%,对照组GG基因型的频率是35%和22%,差异有统计学意义(χ2=17.666,P<0.05);AG和GG基因型与AA基因型的比值比分别是0.191和0.161(OR=0.191,95%CI 0.085～0.429;OR=0.165,95%CI 0.069～0.398);病例组和对照组的等位基因是G频率的62.5%和42%,差异有统计学意义(χ2=16.844,P<0.05)。结论 PS-K196E突变的杂合子和纯合子的蛋白S的活性均降低,尤其是后者更明显,PS-K196E多态性与新疆地区维族人肺栓塞的发生可能有关。

拟除虫菊酯降解酶基因APs实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究建立了一种能够快速、灵敏地检测来源于铜绿假单胞菌GF31中拟除虫菊酯降解酶基因APs的SYBR GreenⅠ相对实时荧光定量PCR方法。通过克隆构建APs目的基因及16S rRNA内参基因重组质粒,分别制备了质粒标准品SgI-pET30a、PA-pET30a、Pep-pET30a以及16S r RNA-p ET30a;绘制标准曲线,建立了实时荧光定量PCR体系。结果显示,在质粒标准品浓度为0.001~10 ng范围内,实时定量PCR标准曲线的线性关系良好,APs和16S r RNA的标准曲线R^2〉0.99,扩增效率=95%~105%;熔解曲线呈单峰,特异性良好;扩增曲线呈S型,CT值在各梯度间均匀变化、重复性好;将建立的相对实时荧光定量PCR方法应用于检测工程菌及野生菌APs基因的m RNA表达水平,2^（-△△Ct）法计算得工程菌SgI、PA及Pep的表达量分别为野生菌的1 898、1 314和956倍。

高粱bmr和光周期敏感基因遗传分析及初步定位

通过田间和实验室相结合把低木质素、高消化率基因bmr和光周期敏感基因PS聚合到饲草高粱中,以提高饲草高粱的产量和品质。以含PS基因的EBA-3和含bmr基因的Tx623B配制杂交组合,构建了F2代分离群体。根据表型分离比例分析,光敏和褐色中脉可能分别受两对彼此独立的非等位基因控制,并且基因之间存在着互作。光敏基因之间存在互补作用,褐色中脉基因之间存在抑制作用。根据高粱的遗传连锁图谱,选取相应的SSR标记。经连锁遗传分析,找到了2个SSR标记,Xtxp7与bmr基因连锁,Xtxp20与PS基因连锁。由于Xtxp7位于连锁群B,Xtxp20位于连锁群G,据此认为高粱有一个bmr基因位于B染色体上和有一个PS基因位于G染色体上。这两个标记的获得可用于标记辅助育种,加速杂交种的转育与利用。此外,对影响开花时间的QTLs和主效基因在高粱和水稻上可能一致进行了讨论。

槐耳清膏对人肺腺癌细胞H1299化疗敏感性的影响

[目的]探讨槐耳清膏对p53基因表达缺失的人肺癌细胞系H1299(p53-null)体外生长化疗敏感性的影响。[方法]应用MTT法、流式细胞仪及克隆形成试验,检测槐耳清膏对H1299生长的影响及对化疗药物(DDP和ADM)敏感性的变化。[结果]槐耳清膏能使H1299细胞体外生长速度明显减慢,其抑制生长的作用具有剂量依赖性。MTT实验提示槐耳清膏使顺铂和阿霉素的IC50值分别减少了4倍和45倍,槐耳清膏(1.0g/L)联合原本没有明显抑制和杀伤作用的化疗药物(1.25μmol/L的顺铂或0.25μmol/L的阿霉素)使H1299细胞生长明显受到抑制。流式细胞术显示槐耳清膏使顺铂诱导的细胞凋亡率从12.8%升高到33.5%(P<0.01),阿霉素诱导的细胞凋亡率从22.7%升高到51.0%(P<0.01)。克隆形成实验显示槐耳清膏能明显降低化疗后细胞的克隆形成数(P<0.01),对顺铂和阿霉素的化疗增效倍数分别为1.9和1.6倍。[结论]槐耳清膏可以抑制人肺腺癌细胞H1299体外生长并提高其对阿霉素、顺铂等化疗药的敏感性,且这种作用不依赖于p53基因。