突变型PSMB5通过下调非小细胞肺癌抗原加工呈递功能介导抗PD-1免疫治疗耐药

目的探讨突变型编码蛋白酶体B5亚基的基因(proteasome subunit beta 5,PSMB5)介导非小细胞肺癌抗程序性死亡受体1(programmed death 1,PD-1)免疫治疗继发耐药的作用及机制。方法对6例接受免疫治疗的继发PSMB5 p.A79T或p.M104I突变的非小细胞肺癌患者治疗前及耐药后肿瘤组织进行RNA测序,对比基因表达差异。利用I-Mutant 2.0评估PSMB5突变对蛋白稳定性的影响。对抗PD-1免疫治疗前后的肿瘤组织通过免疫组化检测CD8表达水平。流式分选患者免疫治疗期间的PD-1+CD8+T细胞,并进行T细胞受体(T cell receptor,TCR)测序,结合外周血游离细胞DNA(cell free DNA,cfDNA)测序结果进行克隆进化分析。利用肿瘤细胞与T细胞共培养体系,明确突变型PSMB5对T细胞应答的影响。结果PSMB5 p.A79T或p.M104I突变可导致蛋白稳定性降低,基因信号通路富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)提示突变型PSMB5相比免疫治疗前野生型PSMB5抗原呈递能力下降,同时微环境中细胞溶解评分也低于基线水平。免疫组化结果指出,突变型PSMB5肿瘤组织中CD8表达较野生型显著减少。通过外周血cfDNA及TCR动态监测及克隆分析,随着PSMB5克隆的出现,PD-1+CD8+TCR并未呈现出相应的丰度变化,提示未发生有效免疫应答。在突变型/野生型PSMB5肿瘤细胞与T细胞共培养的过程中,突变型PSMB5未能刺激T细胞的扩增,同时流式细胞术检测突变型PSMB54-1BB CD8 T细胞的比例明显低于野生型。结论突变型PSMB5可能下调肿瘤细胞抗原加工呈递功能,介导T细胞的应答障碍从而导致免疫治疗继发耐药。

蛋白酶体β5亚单位过表达对氧化环境下人晶状体上皮细胞的影响

【目的】探讨蛋白酶体β5亚单位(PSMB5)基因过表达对氧化条件下晶状体上皮细胞的影响。【方法】构建重组质粒pcDNA3.1-PSMB5并将其转染入人晶状体上皮细胞株SRA01/04中,形成稳定表达,同时设pcDNA3.1空载体为对照组。RT-PCR法及Western blot法分别检测PSMB5基因及蛋白的表达情况。H2O2分别作用PSMB5转染细胞及空载体转染细胞,MTT法检测细胞增殖能力的变化。【结果】转染后用G418筛选3周后,获得PSMB5转染及空载体转染的G418抗性的细胞克隆。转染PSMB5基因的细胞PSMB5mRNA表达强度明显增高,而空载体转染细胞与未转染细胞无显著差异;转染PSMB5基因的细胞的PSMB5蛋白表达也显著高于空载体转染细胞。低浓度H2O2作用后,转染PSMB5基因的细胞增殖能力高于空载体转染细胞。【结论】低浓度氧化环境下蛋白酶体β5亚单位PSMB5过表达能对人晶状体上皮细胞具有保护作用。

酵母双杂交筛选与RSA14-44相互作用的蛋白

构建了包含RSA14-44cDNA的pAS2-1-14诱饵质粒,并进行了人睾丸cDNA文库的酵母双杂交筛选,获得了一条编码人20S蛋白酶体蛋白PSMB5的cDNA片段;用所获得的序列编码该蛋白3’端编码框内全部氨基酸(191个氨基酸);首次证明RSA14-44与PSMB5在酵母细胞中存在相互作用。

人蛋白酶体β亚基4型(PSMB4)与BcL-2家族中促凋亡蛋白分子Bim的相互作用

目的:探讨人蛋白酶体β亚基4型(PSMB4)与Bcl-2家族中的促凋亡蛋白分子Bim之间的相互作用。方法:借助PlexA-bimL技术从人胎脑文库筛选PSMB4,借助显微共聚焦技术探讨PSMB4与Bim相互作用的亚细胞定位,应用免疫共沉淀技术探讨PSMB4与Bim的相互作用。结果:PSMB4与Bim存在于同一细胞中,PSMB4和Bim在空间上存在相互作用。结论:PSMB4和Bim有可能存在空间位置上的共定位;PSMB4在细胞内能够与Bim发生相互作用。

牛生长激素基因向“缩骨鲫”受精卵转移的初步研究

用显微注射方法,将带有小鼠重金属结合蛋白基因启动子的牛生长激素基因导入“缩骨鲫”受精卵。分析了外源基因在受体胚胎发育过程中的行为及在仔鱼体内的整合。初步结果显示了外源基因对受体的加速生长效应。

PSMB5基因G322A突变及硼替佐米耐药的JurkatB细胞与其亲本细胞蛋白质表达谱的差异研究

本研究旨在探讨具有PSMB5基因G322A突变且对蛋白酶体抑制剂硼替佐米耐药的T淋巴母细胞淋巴瘤/白血病细胞系JurkatB与亲本Jurkat细胞的细胞生物学特性和蛋白质表达的差异,确认JurkatB5(硼替佐米筛选终浓度500 nmol/L)及JurkatB8(筛选终浓度800 nmol/L)细胞对硼替佐米的耐药性和对常规化疗药物的敏感性。采用台盼蓝拒染活细胞计数绘制生长曲线,应用软琼脂培养法观察细胞集落形成率,用流式细胞术行细胞周期分析,实时荧光定量RT-PCR检测多药耐药相关基因MDR1、LRP、MRPmRNA表达,采用含有720个蛋白抗体的SpringB io抗体芯片检测细胞株间蛋白质表达差异。结果表明,JurkatB5和JurkatB8细胞与亲本Jurkat细胞相比,对硼替佐米48小时耐药倍数分别为33.52,39.04。48小时化疗药物杀伤实验表明,JurkatB5和JurkatB8细胞对柔红霉素、阿霉素、长春新碱、依托泊甙均无交叉耐药,耐药细胞株与亲本Jurkat细胞的增殖、集落形成和细胞周期分布差异无统计学意义(p>0.05)。JurkatB5细胞与Jurkat细胞MDR1、LRP、MRP基因mRNA表达无显著差异(p>0.05)。蛋白芯片杂交信号扫描共有264个可分析表达点,252个蛋白在3个细胞株中表达无明显差异(2倍以内),其中包括与多药耐药相关的15个蛋白。在JurkatB5或JurkatB8中较Jurkat细胞表达升高或降低2倍以上的蛋白共12个(细胞分裂周期蛋白34、细胞分裂周期蛋白37、CD34 II型蛋白、基质金属蛋白酶-2、细胞黏合素、高尔基体复合物、内皮蛋白、组蛋白去乙酰化酶1、穿孔蛋白、促乳蛋白、维甲酸受体β、整合蛋白β1),但未发现在JurkatB5和JurkatB8中较Jurkat细胞中表达同时升高或降低2倍以上的蛋白。结论:具有PSMB5基因G322A突变且对硼替佐米耐药的细胞株JurkatB与亲本Jurkat细胞相比较其常规细胞生物学特性无显著改变,无多药耐药表型及多药耐药相关基因的过表达。突变细胞株中大部分已知与耐药有关的蛋白与肿瘤细胞生长、增殖、凋亡、恶性程度、侵袭性相关蛋白表达与亲本细胞中的表达相比较均无显著差异。

PSMB7基因与阿尔茨海默病的相关性研究

目的探讨蛋白酶体亚基-B7(PSMB7)基因多态性、载脂蛋白E(ApoE)基因多态性和阿尔茨海默病(AD)的相关性。方法 376例日本AD患者(324例迟发型和52例早发型AD)和378例非痴呆对照组中,用TaqMan-PCR法检测PSMB7基因rs7871785(+561G/A)、rs3780199(+26651C/T)及APOE基因的单核苷酸多态性,并分析与AD的相关性。结果 PSMB7基因rs7871785 A/A纯合子频率在早发型AD中明显高于对照组(0.75 vs 0.60,P=0.037),而rs3780199 C/C纯合子频率在AD中明显高于对照组(0.23 vs 0.15,P=0.009)。在非APOE-ε4携带者中,AD患者rs3780199 C/C纯合子频率明显高于对照组(0.23 vs 0.16,P=0.005)。结论 PSMB7基因rs7871785多态位点A/A纯合子与早发型AD存在相关性,而rs3780199C/C纯合子独立于APOE-ε4基因与迟发型AD存在相关性。

PSMB5基因过表达促人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化

目的:明确20S蛋白酶体β白亚单位(PSMB5)在人骨髓间充质干细胞(h BMSCs)向神经元样细胞定向分化过程中的作用。方法:构建PSMB5与绿荧光蛋白(GFP)融合表达慢病毒载体感染h BMSCs,依照感染病毒不同将细胞分为PSMB5组和GFP对照组,并利用RT-PCR和荧光分光光度法验证感染效率和蛋白酶体活性。将PSMB5组和GFP对照组h BMSCs经β-巯基乙醇(β-ME)预诱导24 h,再用视黄酸(RA)诱导3 d,最后用生长因子(GF)持续培养3 d,免疫荧光染色检测GFP组和PSMB5组早期神经元标志物Tujl的阳性率。同时,将诱导后的h BMSCs注入小鼠大脑皮层,4周后收集脑片,免疫荧光染色观察GFP组和PSMB5组Tuj1阳性细胞存活数量。结果:PSMB5基因过表达能够显著上调蛋白酶体活性。经体外诱导分化后PSMB5组Tuj1阳性率达31%±8%,较GFP组22%±7%明显升高(P<0.01)。脑内注射4周后,PSMB5组Tuj1阳性细胞数达20.0±8.6,较GFP组10.7±7.8明显升高(P<0.01)。结论:PSMB5基因过表达能够提高h BMSCs蛋白酶体活性,有助于促使h BMSCs向神经元样细胞分化。

PSMB8在人绒毛膜滋养层细胞中对细胞凋亡和自噬的影响

目的初步探讨蛋白酶体亚基PSMB8(proteasome subunit beta 8)对人绒毛膜滋养层细胞(HTR-8/Svneo)凋亡及自噬的影响。方法将HTR-8细胞分为转染组和对照组,采用瞬时转染的方法分别将PSMB8 siRNA-1、PSMB8 siRNA-2转入转染组中,将NC siRNA转入对照组中。转染48h后用qRT-PCR进行干涉效率验证,CCK-8检测细胞增殖情况,TUNEL和流式细胞术分析细胞凋亡情况,免疫荧光染色检测细胞内caspase-3(cleaved)和LC3蛋白的表达,qRT-PCR检测细胞中自噬相关基因mRNA表达水平。结果qRT-PCR结果显示,PSMB8 siRNA-1组干扰效果较好。与对照组比较,PSMB8 siRNA-1组细胞增殖能力减弱,HTR-8细胞中TUNEL(15.05±2.62 vs 33.40±2.44,P=0.000)和caspase-3(cleaved)(21.70±5.87 vs 53.29±10.29,P<0.01)阳性率增加。流式结果显示,与对照组比较,PSMB8 siRNA-1组存活细胞比例减少(89.10±0.78 vs 77.00±1.68,P=0.000),早期凋亡和晚期凋亡细胞比例增加(9.09±0.65 vs 10.71±0.61,P<0.05),坏死细胞比例也增加(2.49±0.73 vs 12.49±2.02,P<0.01)。与对照组比较,PSMB8 siRNA-1组LC3蛋白阳性细胞率增加(19.02±3.78 vs 31.90±4.87,P<0.05),各自噬相关基因mRNA相对表达水平均上调。结论在HTR-8细胞中沉默PSMB8基因表达可以诱导细胞凋亡并且激活自噬。

PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响

【目的】探究蛋白酶体β5亚基(proteasome subunit beta type-5, PSMB5)对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响,为进一步研究蛋白酶体亚基PSMB5在细胞分化和肌肉发育过程中的调控作用提供依据。【方法】利用牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型,模拟牛骨骼肌生长发育过程,首先检测牛骨骼肌卫星细胞分化前后PSMB5的表达变化,采用qRT-PCR法检测PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后基因表达水平的差异,采用Western blotting法检测PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后蛋白表达水平的差异。然后设计合成PSMB5的小干扰RNAsi-RNA-PSMB5 (si-PSMB5),构建PSMB5过表达质粒载体pcDNA3.1-PSMB5(pcDNA-PSMB5),采用(Lipofectamine)3000转染试剂将si-PSMB5和pcDNA-PSMB5转染牛骨骼肌卫星细胞,qRT-PCR法及Western blotting法检测转染效果。最后采用EdU染色的方法检测干扰和过表达PSMB5对牛骨骼肌卫星增殖的影响;进一步对牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,光学显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞肌管形成状态,Western blotting检测分化标志因子肌球蛋白重链(MyHC)蛋白水平的表达变化,分析干扰和过表达PSMB5对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的影响,综合分析PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响。【结果】PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后表达水平存在显著差异,牛骨骼肌卫星细胞诱导分化后PSMB5的mRNA和蛋白表达量均显著高于增殖期(P<0.05)。干扰或过表达PSMB5后,牛骨骼肌卫星细胞EdU阳性细胞率与对照组相比,差异均不显著(P>0.05)。干扰PSMB5的表达后,细胞分化形成的肌管数量明显少于对照组,分化标志因子MyHC的蛋白表达水平显著低于对照组(P<0.05);而过表达PSMB5后,细胞分化形成的肌管数量明显多于对照组,分化标志因子MyHC的蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.05)。【结论】PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞的增殖没有明显影响,但对牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程具有显著的调控作用。干扰PSMB5表达可以抑制牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化进程,而过表达PSMB5可以促进牛骨骼肌卫星细胞体外成肌分化进程。探明PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的具体调控作用,为进一步开展PSMB5在牛成肌分化中的调控机制研究奠定了基础。

Circ⁃OGDH调节miR⁃127⁃3p/PSMB5轴对口腔鳞状细胞癌增殖、迁移和侵袭的影响

目的:探讨环状RNA酮戊二酸脱氢酶(circular oxoglutarate dehydrogenase,Circ⁃OGDH)调节miR⁃127⁃3p/蛋白酶体β5亚基(proteasome subunit beta type⁃5,PSMB5)轴对口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)增殖、迁移和侵袭的影响。方法:qRT⁃PCR与Western Blotting测定人口腔上皮细胞及人OSCC细胞系CAL⁃27、HN6、Bca885中Circ⁃OGDH、miR⁃127⁃3p及PSMB5表达。体外培养CAL⁃27细胞并分组转染后测定细胞Circ⁃OG⁃DH、miR⁃127⁃3p及PSMB5表达;Ki67免疫荧光及TUNEL染色检测细胞增殖、凋亡,细胞划痕及Transwell侵袭实验检测细胞迁移、侵袭;Western Blotting检测细胞凋亡(Bcl⁃2、Bax)及上皮间充质转化相关蛋白(Vimentin、E⁃cadherin)表达。于裸鼠皮下接种分组转染后的CAL⁃27细胞构建其移植瘤模型,测定裸鼠肿瘤体积与质量,瘤组织中Ki67阳性表达,TUNEL染色检测细胞凋亡情况。双荧光素酶报告基因实验验证CAL⁃27细胞Circ⁃OGDH对miR⁃127⁃3p、miR⁃127⁃3p对PSMB5的靶向调控作用。结果:与人口腔上皮细胞相比,CAL⁃27、HN6、Bca885细胞Circ⁃OGDH、PSMB5 mRNA及蛋白表达均升高,miR⁃127⁃3p表达均降低(P<0.05)。与对照组相比,Circ⁃OGDH敲低组、miR⁃127⁃3p过表达组细胞和瘤组织中PSMB5 mRNA及蛋白表达、细胞增殖率、迁移率、侵袭数目、瘤体积及质量、Ki67阳性表达、细胞和瘤组织中Bcl⁃2与Vimentin蛋白表达降低,miR⁃127⁃3p表达、凋亡率、Bax与E⁃cadherin蛋白表达升高(P<0.05);与Circ⁃OGDH敲低组相比,Circ⁃OGDH敲低+miR⁃127⁃3p敲低组细胞和瘤组织中PSMB5 mRNA及蛋白表达、细胞增殖率、迁移率、侵袭数目、瘤体积及质量、Ki67阳性表达、细胞和瘤组织中Bcl⁃2与Vimentin蛋白表达升高,miR⁃127⁃3p表达、凋亡率、Bax与E⁃cadherin蛋白表达降低(P<0.05)。Circ⁃OGDH可靶向下调CAL⁃27细胞miR⁃127⁃3p表达,miR⁃127⁃3p可靶向下调其PSMB5表达。结论:敲低Circ⁃OGDH可通过上调miR⁃127⁃3p而降低PSMB5表达,进而减弱OSCC细胞增殖、迁移、侵袭能力,抑制其在裸鼠体内生长,并促使其凋亡。

云南地区汉族人群PSMB8、PSMB9及TAP2基因多态性与类风湿关节炎的关联研究

目的研究云南汉族人群中PSMB8、PSMB9及TAP2基因多态性与类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）的相关性。方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法对177例RA患者及288名健康对照PSMB8基因的rs2071543、rs55745125、rs138635403位点和PSMB9基因的rs17587多态性位点进行基因分型，应用多聚酶链反应扩增阻碍系统法对TAP2基因的rs2228396多态性位点进行基因分型。计算基因型及等位基因频率。采用EpiInfo7软件计算上述多态位点在RA组及正常对照组之间的比值比（OR值）。结果rs138635403及rs17587位点的等位基因及基因型频率在RA组和对照组间差异有统计学意义（P〈0．05），其中RA组rs17587的GG基因型频率（0．672）高于对照组（0．524）（OR=1．862，95％CI：1．261～2．749）。结论云南汉族人群PSMB9基因的rs17587位点多态性与RA存在关联。

人蛋白酶体亚基PSMB1的重组表达、纯化及在蛋白酶体抑制剂体外筛选中的应用

蛋白酶体是真核细胞中的一类多亚基蛋白酶复合物,它在胞内蛋白质降解的泛素-蛋白酶体通路中起关键作用。重组表达蛋白酶体的活性亚基可以用于在体外筛选、寻找具有蛋白酶体抑制剂作用的化合物。将人蛋白酶体催化亚基(PSMB1)cDNA的编码区(全长726 bp)克隆至原核表达载体pET28a(+),构建重组质粒pET28a-PSMB1,转化大肠杆菌BL21(DE3),通过1 mmol/L IPTG,20℃过夜诱导,获得相对分子量约为27 kDa的重组蛋白,采用IMAC亲和层析柱纯化重组蛋白,纯化后的重组蛋白纯度超过95%。重组蛋白酶解后经NanoLC-MS/MS鉴定表明所表达的融合蛋白氨基酸序列完全正确。在体外BIAcore分析中,重组蛋白表现出对不同化合物的选择性结合能力,其中与蛋白酶体抑制剂雷公藤红素的结合较强,10μmol/L的雷公藤红素与重组蛋白的结合达到27 RU,并且具有良好的浓度依赖型。本研究建立了表达、纯化人蛋白酶体催化亚基PSMB1的方法,并应用于具有蛋白酶体抑制活性化合物的体外筛选。

PSMB4亚基蛋白在脑胶质瘤中表达的相关研究

目的 探讨26S蛋白酶体的PSMB4亚基（PSMB4）在正常脑组织与胶质瘤组织中表达的差异性及其与脑胶质瘤恶性程度的相关性。方法 选取厦门大学附属第一医院神经外科自2008年1月至2012年2月问手术切除并经病理证实的人脑胶质瘤液氮冻存标本75例，其中星形细胞瘤Ⅰ级21例，星形细胞瘤Ⅱ级21例，星形细胞瘤Ⅲ级27例，胶质母细胞瘤Ⅳ级6例。另取5例因脑创伤行内减压术患者的正常脑组织液氮冻存标本，免疫组织化学染色检测标本中PSMB4的表达。结果 PSMB4在正常脑组织中呈阴性表达，而在胶质瘤组织中呈阳性或强阳性表达。统计分析显示胶质瘤组PSMB4蛋白的表达明显高于正常脑组织组，差异有统计学意义（P〈0．05），不同级别胶质瘤PSMB4表达的分布差异无统计学意义（P〉0．05）。结论 脑胶质瘤组织PSMB4蛋白的表达高于正常脑组织，但与脑胶质瘤的恶性程度无明显相关性。

云南汉族女性类风湿关节炎及系统性红斑狼疮中β型蛋白酶体亚单位的基因多态性

目的 研究PSMB8、PSMB9基因单核苷酸多态性（SNP）与云南地区汉族女性RA及SLE的相关性.方法 应用PCR-限制性片段长度多态性方法（RFLP）对209例RA患者、178例SLE女性患者及216名健康女性对照PSMB8基因的rs2071543位点和PSMB9基因的rs17587位点进行基因分型.使用SHEsis软件计算各位点基因型及等位基因频率,计算2个SNPs间的连锁强度并进行单倍型分析.组间差异比较用χ2检验.结果 rs17587的基因型GG的频率在RA组（0.646）和SLE组（0.635）中均高于对照组（0.533）,差异有统计学意义（χ2=5.652,P=0.017;χ2=4.199,P=0.040）.rs2071543-rs17587构建的单倍型中C-A型的频率RA组（0.201）低于对照组（0.264）,差异有统计学意义（χ2=4.495,P=0.034）.结论 云南地区汉族女性中PSMB9基因的rs17587多态性可能与RA及SLE存在相关.

蛋白酶体β5过表达对人晶状体上皮细胞抗氧化能力的影响

目的:研究蛋白酶体β5(PSMB5)过表达对人晶状体上皮细胞抗氧化能力的影响。方法:实验研究。构建重组质粒pcDNA3.1-PSMB5,将其转染入人晶状体上皮细胞株SRA01/04中,形成稳定表达(作为实验组),设pcDNA3.1空载体作为对照组。将2组细胞置于40 μmol/L H 2O 2环境下,Hoechst 33342荧光染色观察2组细胞核形态的变化;流式细胞仪检测2组细胞凋亡率的变化。数据采用独立样本 t检验。 结果:40 μmol/L H 2O 2环境下,Hoechst 33342荧光染色可见,与实验组相比,对照组的细胞核明显皱缩、变形;流式细胞仪检测发现,实验组和对照组的细胞凋亡指数分别为(9.3±0.9)%和(15.7±1.9)%,均高于处理前的(5.9±0.8)%和(7.1±1.1)%,对照组凋亡指数比实验组的凋亡指数更高( t=3.742, P=0.008)。 结论:PSMB5基因过表达能有效提高人晶状体上皮细胞的抗氧化能力。

siRNA下调20S蛋白酶体β5亚基抑制立氏立克次体细胞内增殖

【目的】探究宿主20S蛋白酶体β5亚基(proteasome 20S subunit beta 5,PSMB5)对革兰氏阴性专性胞内寄生菌立氏立克次体胞内生长繁殖的影响。【方法】利用小干扰RNA转染Vero和THP-1宿主细胞,设置未转染细胞为空白对照组、无义小干扰RNA转染组为阴性对照组、PSMB5特异性小干扰RNA转染组为实验组,采用SYBR定量PCR和蛋白印迹法评价宿主细胞PSMB5变化水平;随后利用立氏立克次体以感染复数为0.1感染转染后细胞系,采用光镜观察、荧光显微镜观察和PCR定量方法检测细菌胞内繁殖变化水平。【结果】与si-NC阴性对照和空白对照相比,si-PSMB5能够显著降低宿主细胞PSMB5 mRNA转录水平和蛋白表水平;在随后立氏立克次体感染过程中,能够降低立氏立克次体的胞内细菌载量。【结论】下调宿主PSMB5基因表达能够抑制立氏立克次体胞内生长繁殖。

稳定表达PSMB9-eGFP-His蛋白的THP-1细胞系建立及免疫蛋白酶体活性检测

泛素/蛋白酶体系统(ubiquitin/proteasome system,UPS)在调控细胞内蛋白质稳态过程中发挥重要功能,UPS中蛋白酶体的催化活性受β1(PSMB6)、β2(PSMB7)和β5(PSMB5)亚基调控,在干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、炎症反应、氧化应激等条件诱导下,β1、β2和β5可被相应的β1i(PSMB9)、β2i(PSMB10)和β5i(PSMB8)替换,组装形成免疫蛋白酶体(immunoproteasome)。与标准蛋白酶体相比,免疫蛋白酶体具有更强的免疫调节作用,如加工递呈MHCⅠ抗原、调节促炎细胞因子的产生及T细胞分化、增殖等。免疫蛋白酶体的异常聚集会导致帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化等神经退行性疾病的发生。为探究PSMB9在细菌感染后发挥的功能,本研究通过构建过表达PSMB9-eGFP-His的慢病毒质粒,利用三质粒系统转染HEK293T包装慢病毒,嘌呤霉素筛选,获得稳定表达PSMB9融合蛋白的人髓系白血病单核细胞THP-1细胞系,利用蛋白免疫印迹(Western blotting,WB)及荧光显微镜验证了PSMB9融合蛋白的表达,通过实时荧光定量PCR(quantitative PCR,q PCR)计算了稳转细胞系中PSMB9-eGFP基因的拷贝数。免疫荧光结果发现eGFP-His不会影响PSMB9的亚细胞定位,镍柱亲和纯化实验证实PSMB9融合蛋白可组装至20S免疫蛋白酶体中,且具有底物切割活性。上述结果证明PSMB9-eGFP基因成功整合入THP-1细胞基因组并稳定表达,可用于探究PSMB9亚基在活细胞模型中不同感染条件及疾病进程中的细胞定位、动态表达和活性的变化,并为其他2个免疫蛋白酶体亚基PSMB8和PSMB10的稳转细胞系构建提供了参考。