菠菜PSY基因家族的鉴定与表达分析

八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase,PSY)是植物类胡萝卜素合成途径中的第一个限速酶,对植物的生长发育具有重要作用。为了解菠菜(Spinacia oleracea L.)中PSY基因家族功能,本研究通过生物信息学方法对菠菜PSY基因家族成员的数目、结构、启动子元件、氨基酸特性和基因进化等进行鉴定分析,并利用实时荧光定量PCR技术(RT-qPCR)分析其在菠菜组织中及响应红蓝光比例变化的表达模式,同时测定R1B3(红光∶蓝光=1∶3)和R3B1(红光∶蓝光=3∶1)处理后菠菜总类胡萝卜素含量,进行SoPSYs基因表达量与总类胡萝卜素含量变化的相关性分析。结果显示,菠菜共有4个PSY基因,含有SQS_PSY保守结构域,SoPSY蛋白为亲水性蛋白。菠菜PSY1、PSY2和苋科的甜菜进化关系较近,PSY3、PSY4与番茄PSY3有较近的亲缘关系。菠菜PSY基因启动子序列上存在多种光响应和植物激素相关元件。SoPSY基因具有组织表达特异性,SoPSY1、SoPSY2、SoPSY3仅在叶片中表达,SoPSY4主要在根中表达。菠菜类胡萝卜素含量在R1B3和R3B1处理后均下降。不同基因型菠菜中,各SoPSY基因响应红蓝光比例变化的表达模式具有差异性,其中SoPSY1的表达在栽培类型菠菜中无显著变化,SoPSY2的表达模式在两种类型菠菜中相反,SoPSY3在野生型与栽培型菠菜中表达模式一致,且这3个基因的相对表达水平与总类胡萝卜素含量变化密切相关。本研究为深入了解PSY基因在菠菜中的生物学功能,以及响应红蓝光比例变化的调控机理奠定了基础。

八氢番茄红素合成酶基因(PSY)对大豆的遗传转化

以三个大豆品种的无菌苗子叶节为受体,以 PSY为目的基因,应用根癌农杆菌介导法对大豆进行了遗传转化,经子叶节丛生芽诱导、茎伸长培养、生根培养和潮霉素选择培养,获得了完整的抗性再生苗,经PCR和PCR-Southern分析鉴定,初步证明外源基因 PSY已整合到大豆的基因组中,并对影响遗传转化的因子进行了研究。

甘薯块根总RNA提取与psy基因保守序列的克隆

甘薯块根富含的次生物质严重干扰了总RNA的提取.本试验采用 4种方法对甘薯块根总RNA进行提取,筛选出 1种最佳的改进方法,排除了甘薯块根中淀粉、多糖、多酚以及纤维等次生物质的干扰,提取到了高质量的甘薯块根总RNA.所提取的RNA得率较高,完整性好,纯度高,以其逆转录的cDNA为模板,克隆出了甘薯psy基因 422bp的保守序列.

反义PSY基因植物表达载体的构建及其对中国水仙的转化

实验从中国水仙花瓣中分离得到该基因的572bp的片段,将该片段反向连接到pCAMBIA1301双元载体质粒上,得到CaMV35S组成型启动子的表达载体pCAM35S-PSY,用“冻融法”将pCAM35S-PSY质粒转入农杆菌LBA4404和EHA105两个菌株中。PCR扩增和酶切鉴定结果表明,所构建的反义表达载体pCAM35S-PSY是正确的并已经成功导入农杆菌中。随后,按照业已建立的遗传转化体系对中国水仙进行了遗传转化,得到了转基因抗性芽。

枇杷果实总RNA的提取及八氢番茄红素合成酶基因(PSY)片段的克隆

【目的】为从枇杷果实中提取高质量的RNA,【方法】以枇杷果实为材料,对6种总RNA提取方法进行分析和比较。【结果】结果表明,在裂解前先用70%丙酮和80%乙醇分别对枇杷果皮和果肉进行预处理,再结合CTAB-LiCl法,得到的总RNA质量较好,OD260/OD280在1.8～2.2,OD260/OD230超过2.0,得率分别为幼果果皮56.78μg.g-1,幼果果肉40.62μg.g-1,成熟果果皮40.86μg.g-1,成熟果果肉9.24μg.g-1;并根据其他植物的八氢番茄红素合成酶基因(PSY)保守区设计引物,用以上方法提取的RNA为模板进行RT-PCR,得到453 bp的基因片段,其推导的氨基酸序列与其他植物的同源性高达95%,推测该片段为PSY基因。【结论】先用70%丙酮和80%乙醇分别对枇杷果皮和果肉进行预处理,再结合CTAB-LiCl法,得到的RNA质量好,可用于后续的分子生物学研究。

小麦黄色素合成途径中Psy基因的克隆及分子特性

对普通小麦(Ttiticum aestivum)黄色素(YP)合成途径中的首要限速酶——八氢番茄红素合成酶(Psy)基因进行克隆和测序,并和玉米Psy基因进行序列比对。结果表明,在高和低YP含量小麦品种中均扩增出一条长1192bp的Psy基因片段,该片段包含一条可编码78个氨基酸的小麦Psy基因的外显子,与玉米Psy基因第4外显子的核苷酸序列同源率为80.74,同源区域内有47个SNPs,但仅11个SNPs导致氨基酸编码序列的改变,二者氨基酸序列的同源率达85.89,推测Psy基因在不同物种中的表达具有较高的保守性。BLAST聚类分析表明,禾谷类植物Psy基因的分类与物种的亲缘关系存在明显的相关性,小麦Psy基因在系统进化中比禾谷类其他植物更为高级。

基因枪对大豆进行PSY基因的转化研究

以3个大豆品种的体细胞胚为受体,以PSY为目的基因,应用基因枪法对大豆进行了遗传转化,实验结果表明:不同大豆基因型的体细胞胚对抗性选择标记(Hyg)的敏感性存在极显著差异;高渗处理的培养基加入0.4mol/L甘露醇有利于PSY基因的导入;对已获得10株抗性再生苗,经PCR和PCR-Southern分析鉴定,有4株为阳性,初步证明外源基因PSY已整合到大豆的基因组中。

新疆小麦品种黄色素含量基因(Psy-A1)等位变异的分子检测

为了给新疆小麦品种面粉色泽改良提供理论依据,利用黄色素含量基因(Psy-A1)的功能标记YP7A检测了247份新疆小麦品种(包括农家品种、国内外引进品种和20世纪60年代以来的自育品种)Psy-A1等位基因Psy-A1a(高黄色素含量)和Psy-A1b(低黄色素含量)的分布情况,探讨了Psy-A1等位基因与面粉黄色素含量和黄度b*值的关系。结果表明,新疆小麦品种中Psy-A1a和Psy-A1b基因型的频率分别为91.9%和8.1%,以高黄色素含量的Psy-A1a基因型为主。新疆小麦农家品种、引进品种和自育品种Psy-A1a基因型的分布频率分别为100%、81.3%和95.3%,外来品种的引进和利用对降低新疆小麦品种黄色素含量起到了积极作用。新疆小麦品种面粉黄色素含量和黄度b*值普遍偏高,冬小麦品种面粉黄色素含量及黄度b*值高于春小麦品种。分析表明Psy-A1a和Psy-A1b两种基因型的面粉黄色素含量和黄度b*值平均值间的差异达到极显著水平。总之,新疆小麦品种面粉色泽改良应该以培育低黄色素含量的Psy-A1b基因型为重点,同时可以直接利用黄色素含量基因(Psy-A1)的功能标记YP7A来提高育种效率。

应用CRISPR/Cas9体系对番茄PSY 1基因的定点编辑

基于NCBI数据库提供的番茄八氢番茄红素合成酶基因(PSY 1)全长,并根据基因序列中PAM(proto adjacent motif)的位置设计特异性sg RNA,构建CRISPR/Cas9 Level 1、Level 2载体;将设计好的载体转化农杆菌,继而转染番茄子叶,利用PCR产物测序法检测sg RNA在番茄基因组中的敲除效率。结果表明,36个转基因植株中有22个PSY 1基因目标区出现不同数目的碱基缺失、增加或互换,初步估计基因敲除效率为61%。本试验在番茄中初步建立了CRISPR/Cas9介导的基因敲除技术,该技术能够稳定的在番茄中实现基因敲除。

普通小麦D染色体组上psy基因位点的分子证据

为检测普通小麦D染色体组是否存在psy基因,以扩增普通小麦(2X=AABBDD=42)psy基因的相同引物psy02和psy06在节节麦(2X=DD=14)中进行PCR反应。结果表明,引物psy02在节节麦基因组DNA中的扩增产物长206 bp,与普通小麦中扩增的196 bp序列同源率为93.0%,对应的第2外显子区域内仅有1 SNP;引物psy06在节节麦基因组DNA中的PCR产物长305 bp,与普通小麦中扩增的302 bp序列同源率达95.77%,对应的第6外显子区域内无SNP,说明在小麦D染色体组中存在psy基因,且psy基因部分外显子序列在D染色体组的进化过程中相对保守。

万寿菊八氢番茄红素合成酶基因的克隆与表达分析

八氢番茄红素合成酶(PSY)是植物类胡萝卜素生物合成途径中的主要限速酶,催化番茄红素的合成。万寿菊(Tagetes erecta L.)花中富含类胡萝卜素,提示其合成途径催化酶基因可能具有较高活性。文章利用转录组数据克隆获得编码万寿菊PSY的基因TePSY,连接于克隆载体pEASY-Blunt。测序结果显示,TePSY全长读码框为1272 bp,编码相对分子质量约48 kDa的亲水性蛋白;进化分析表明,PSY基因在植物中保守存在,TePSY与同科植物向日葵同源基因相似性最高;实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)显示,TePSY在万寿菊花组织中表达,丰度先升高,至成熟时降低。将TePSY用于构建植物表达载体pBTEX-TePSY,进一步利用农杆菌介导法在烟草叶片中瞬时表达,并进行蛋白印迹(western blot,WB)检测,结果表明,在植物体内表达预期大小TePSY蛋白产物,可用于后续TePSY功能分析。

西双版纳黄瓜Cs-Psy1基因的序列特征与表达分析

西双版纳黄瓜是我国特有的果肉橙黄色的黄瓜变种资源,不同种质间的β-胡萝卜素含量差异明显。PSY是胡萝卜素生物合成途径中的第1个限速酶。本文以西双版纳黄瓜为试材,分别克隆西双版纳黄瓜八氢番茄红素合成酶(Cs-PSY1)的DNA和c DNA序列,结果显示,DNA长2797 bp,包含5个内含子和6个外显子,c DNA序列长1385 bp,编码421个氨基酸。Psy1推测的氨基酸序列包含该家族的2个特征序列,保守性很高。该蛋白为不稳定蛋白,无明显疏水区,未预测到跨膜结构;系统进化分析结果显示,西双版纳黄瓜的Cs-PSY1蛋白与甜瓜的同源性较高;与栽培黄瓜深度测序材料"9930"和"GY14"的序列进行比较分析,结合115份黄瓜重测序结果,共发现5个SNP,其中2个位于起始密码子上游27 bp处和971 bp处,3个位于内含子区域。其中SNP4在重测序的19份西双版纳黄瓜中的突变率为100%,在96份栽培黄瓜中的特异性为5.3%。转录因子结合位点预测结果显示,在普通栽培黄瓜该位点处存在一个CTAG motif,在西双版纳黄瓜中该位点突变后则不存在该motif。利用实时荧光定量PCR技术分析Cs-Psy1的表达量变化趋势,结果表明,在黄瓜不同果实发育时期,该基因的表达量均呈现先上升后下降的趋势,在西双版纳黄瓜中表达量变化的差异明显,在授粉后50 d达到最大值,是果实发育初期表达量的8倍多,是同时期普通黄瓜的4倍多,而普通黄瓜表达量的总体变化相对平缓。西双版纳黄瓜果实内果皮的表达水平明显高于中果皮,最高相差约5倍,普通黄瓜差异不明显。从上述研究结果推测Psy1基因可能影响西双版纳黄瓜的β-胡萝卜素积累。

茶树PSY基因的比较基因组学及在黄化种中的表达

八氢番茄红素合成酶(PSY)是类胡萝卜素合成途径上的第一个限速酶,本研究旨在探索PSY基因的序列特征及其在黄化茶树新梢中的表达模式.在茶树品种‘黄棪’基因组中鉴定到3个PSY基因,分别命名为CsPSY1、CsPSY2、CsPSY3;从‘铁观音’基因组中鉴定到2个PSY基因,分别命名为TGY-PSY1、TGY-PSY2;从‘舒茶早’基因组中鉴定到4个PSY基因,分别命名为CSS-PSY1、CSS-PSY2、CSS-PSY3、CSS-PSY4.利用生物信息学和实时荧光定量PCR技术对其进行分析,结果表明,茶树PSY基因编码的蛋白序列长度为645~1506 bp,氨基酸个数为214~501,其中,CsPSY1、TGY-PSY1和CSS-PSY1编码的蛋白序列长度均为1269 bp,氨基酸个数均为422.亚细胞定位预测结果显示,CsPSY3和CSS-PSY2分别定位于细胞膜和线粒体上,其他茶树PSY基因均定位在叶绿体上.CsPSY1、CsPSY2和CsPSY3编码的蛋白分别有2、1、0个无序化区域以及41、27、19个磷酸化位点.无规则卷曲和α-螺旋是PSY蛋白的主要组成部分.CsPSY1编码的蛋白与柿子、木瓜、葡萄等具有较高的同源性.启动子区域分析结果显示,茶树PSY基因存在大量与植物光响应、生长作用、激素、胁迫等响应相关的顺式作用元件.实时荧光定量PCR检测结果显示:PSY基因在‘黄金芽’中有较高的表达量;CsPSY1在福黄1号中的表达量较高,是‘福安大白茶’的37.56倍;CsPSY2在福黄2号中的表达量较高,是‘福云6号’的141.43倍.研究表明,PSY基因在茶树黄化种中的表达量显著上调,推测PSY基因可能是茶树黄化种中类胡萝卜素合成的重要调控因子.

中国小麦品种黄色素含量基因等位变异分子检测及其分布规律研究

【目的】八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase,Psy)基因是影响小麦黄色素含量的关键基因,利用分子标记检测中国冬小麦品种(系)Psy-A1基因的等位变异及其与黄色素含量的关系,进一步验证Psy-A1基因分子标记的有效性。【方法】利用7A染色体上Psy-A1基因的分子标记YP7A检测该基因在中国217份冬小麦品种(系)中的等位变异,分析不同等位变异与黄色素含量的相关性及变化趋势。【结果】Psy-A1基因标记YP7A为共显性标记,在高、低黄色素含量的小麦材料中分别扩增出194bp和231bp片段,相应的等位基因为Psy-A1a和Psy-A1b(GenBank编号分别为EF600063和EF600064)。在217份冬小麦品种(系)中,含有等位基因Psy-A1a和Psy-A1b的品种(系)分别占62.2%和37.8%,二者黄色素含量平均值差异达到极显著水平(P<0.01)。其中,北方冬麦区、黄淮冬麦区、长江中下游冬麦区及西南冬麦区Psy-A1a等位基因的分布频率分别为75.0%、72.0%、25.9%和33.3%。【结论】分子标记YP7A可以作为小麦品种黄色素含量选择的辅助工具。

草莓八氢番茄红素合成酶基因的克隆及其表达特性

【目的】分离和克隆草莓果实八氢番茄红素合成酶基因psy,分析其序列特征,了解其在不同组织部位的表达情况。【方法】采用RT-PCR和RACE技术从草莓果实中克隆草莓类胡萝卜素合成途径中关键基因psy,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定氨基酸序列进行分析,并用半定量PCR法研究psy基因在不同组织中的表达。【结果】分离到psy基因,GenBank登录号为FJ784889。该cDNA全长1 458 bp,具有1个1 194 bp的完整开放阅读框(ORF),编码398个氨基酸。序列分析表明,psy编码的氨基酸序列与其它植物的PSY蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,草莓PSY与胡萝卜和玉米的PSY蛋白亲缘关系比较近。原核表达结果表明psy基因在大肠杆菌中获得高效表达。利用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析发现,psy基因在草莓的花、叶片和果实中均有表达。表达量为花>红果>粉红果>白果>青果>老叶>新叶。【结论】从草莓中克隆到类胡萝卜素生物合成的关键酶基因psy,该基因可能参与调控类胡萝卜素的合成。

俄引及黑龙江春小麦黄色素含量相关基因分析

为了将俄引小麦资源的优良基因快速用于我国春小麦品种的改良,利用与黄色素含量相关的八氢番茄红素合酶(Psy)基因STS分子标记,对250份俄罗斯引进和125份黑龙江主栽过的春小麦品种进行了研究分析,利用7A和7B染色体上的标记进行鉴定。结果显示,俄引小麦有242个品种(96.8%)扩增出高黄色素含量基因Psy-A1a;8个品种(3.2%)扩增出低黄色素含量基因Psy-A1b;黑龙江小麦有73个品种(58.4%)扩增出Psy-A1a基因,52个品种(41.6%)扩增出Psy-A1b基因。俄引小麦有187个品种(74.8%)扩增出高黄色素含量的Psy-B1a等位基因,63个品种(25.2%)扩增出低黄色素含量的Psy-B1b等位基因,15个品种(6.0%)扩增出高黄色素含量的Psy-B1c等位基因,40个品种(16.0%)扩增出Psy-B1d等位基因;而黑龙江小麦有40个品种(32.0%)扩增出Psy-B1a等位基因,85个品种(68.0%)扩增出Psy-B1b等位基因,5个品种(4.0%)扩增出Psy-B1c等位基因,24个品种(19.2%)扩增出Psy-B1d等位基因,所有供试小麦品种中都不存在Psy-B1e等位基因。2个位点不同等位基因组合共有12种,俄罗斯小麦品种中存在10种组合,黑龙江小麦品种中存在11种。其中,就双低含量等位基因组合Psy-A1b/Psy-B1b而言,黑龙江小麦品种较俄罗斯高28.4个百分点。

西瓜八氢番茄红素合成酶基因全长的克隆与表达分析

通过RT-PCR和RACE技术从西瓜果实中克隆八氢番茄红素合成酶(PSY)基因的cDNA全长,用生物信息学方法对其cDNA序列及推测氨基酸序列进行分析,并用实时荧光定量PCR技术研究PSY在不同瓤色西瓜果实发育过程中的表达情况.结果表明,PSY基因cDNA全长1 561 bp(GenBank登录号为KC166870),其开放阅读框为1 266 bp,编码421个氨基酸.该基因及其推导的氨基酸序列与同为葫芦科的其他植物的PSY及氨基酸序列的同源性分别为87%和91%以上;序列分析显示,PSY氨基酸序列N末端存在转运肽信号序列.不同瓤色西瓜果实发育过程中PSY的表达存在明显差异,红瓤果实中的表达量最高,这表明PSY可能与红瓤果实中积累较多的类胡萝卜素有关;PSY的表达量均高于PSY-A,推测PSY基因主要负责果实中类胡萝卜素的合成.

中国水仙花色相关基因的克隆与分析

【目的】克隆并初步分析与中国水仙花色发育相关的八氢番茄红素合成酶(PSY)、八氢番茄红素脱氢酶(PDS)和番茄红素β-环化酶(LycB)等3个酶基因序列及结构,了解其花色形成的分子机制,为进一步研究中国水仙类胡萝卜素代谢基因工程奠定基础。【方法】以中国水仙花瓣的mRNA为模板,采用RT-PCR技术扩增PSY、PDS和LycB等3个关键酶基因的保守序列,并进行序列结构分析。【结果】分离得到的中国水仙PSY、PDS和LycB的保守序列长度分别为343、500和486bp,分别编码112、166、161个氨基酸。基因比对结果表明,推导氨基酸序列与已知其他不同植物均具有较高同源性,分别为76.5%～96.1%、69.8%～98.3%和77.3%～95.5%,且包含PSY、PDS和LycB酶的相关功能结构域,初步证明为目标基因,不同物种间的PSY、PDS和LycB基因具有相当高的保守性。编码蛋白预测结果发现,PSY、PDS和LycB虽然有部分疏水区域,但是不存在明显的跨膜结构域。【结论】研究结果为进一步了解中国水仙花色相关酶基因的调控功能及花瓣着色机理奠定分子基础。

陕西省地方小麦品种黄色素含量基因的遗传分析

面粉及其制成品的色泽是衡量小麦品质的重要指标之一。八氢番茄红素合成酶(Phytoene synthase,Psy)基因是影响小麦黄色素含量的关键基因,利用分子标记检测98份陕西省地方小麦品种(系)Psy-A1与Psy-B1基因的等位变异及其分布,进一步验证Psy-A1与Psy-B1基因分子标记的有效性。利用黄色素含量基因(Psy-A1、Psy-B1)的功能标记YP7A和YP7B检测了98份陕西省1980年以来自育和引进的小麦品种(系)Psy-A1等位基因Psy-A1a(片段长度为194bp,高黄色素含量)、Psy-A1b(片段长度为231bp,低黄色素含量)和Psy-B1等位基因Psy-B1a(片段长度为151bp,中黄色素含量)、Psy-B1b(片段长度为156bp,低黄色素含量)、Psy-B1c(片段长度为428bp,高黄色素含量)与Psy-B1d(片段长度为884bp,不确定与黄色素含量的关系)的分布情况,并探讨了Psy-A1、Psy-B1等位基因在品种间的遗传关系。结果表明,陕西省主栽小麦品种(系)中Psy-A1a和Psy-A1b基因型的频率分别为39.8%和60.2%,以低黄色素含量的Psy-A1b基因型为主;Psy-B1a、Psy-B1b、Psy-B1c与Psy-B1d四种基因型的分布频率分别是24.5%,67.4%,7.1%和1.0%。对属于黄淮冬麦区之陕西汾渭河谷副区的小麦品种(系)Psy-A1a、Psy-A1b、Psy-B1a、Psy-B1b、Psy-B1c和Psy-B1d基因型的分布频率分别为45.7%、54.3%,17.4%,71.7%,10.9%和0%;对属于西南冬麦区之陕南鄂西丘陵副区的小麦品种(系)Psy-A1a、Psy-A1b、Psy-B1a、Psy-B1b、Psy-B1c和Psy-B1d基因型的分布频率则分别为32.7%,67.3%,30.8%,63.5%,3.9%和1.9%,说明不同副麦区的小麦品种(系)基因型差异明显,同时可以直接利用黄色素含量基因(Psy-A1和Psy-B1)的功能标记YP7A和YP7B来提高小麦育种效率。

新疆小麦黄色素含量基因等位变异的分子检测及其分布

为了明确新疆小麦材料Psy-A1和Psy-B1位点控制籽粒黄色素含量基因的组成和分布以及与黄色素含量的关系,利用7A和7B染色体上Psy-A1和Psy-B1基因的分子标记YP7A和YP7B,对326份新疆冬、春小麦材料中的等位变异进行检测。结果表明,在Psy-A1位点,含有等位基因Psy-A1a和Psy-A1b的品种(系)分别占83.74%和16.26%,两种基因型黄色素含量平均值的差异达到极显著水平(P<0.01);在Psy-B1位点,含有等位基因Psy-B1a和Psy-B1b的品种(系)分别占83.44%和16.56%,但两种基因型黄色素含量平均值的差异不显著(P>0.05)。不同变异组合类型的分布比例表现不同,Psy-A1a/Psy-B1a所占比例最高,为69.63%;其次是Psy-A1a/Psy-B1b组合类型,为14.11%;Psy-A1b/Psy-B1a组合类型为13.8%;Psy-A1b/Psy-B1b所占比例最低,为2.45%,没有扩增出Psy-B1c和Psy-B1d基因位点。总体来看,新疆小麦高黄色素含量的等位变异类型所占比例较高,冬、春小麦黄色素含量基因型存在一定差异;YP7A可以作为一个稳定、高效的功能标记用于分子标记辅助选择,而YP7B标记则不能独立作为黄色素含量辅助选择的实用性标记。