鸡J亚型白血病病毒荧光定量PT-PCR检测方法的建立

运用实时荧光定量PCR技术,针对鸡J亚型白血病的gp85基因设计特异性引物,建立了一种快速准确诊断鸡J亚型白血病病毒(ALV-J)的荧光定量PT-PCR方法。通过重复性、特异性和灵敏度等验证表明,该方法适用于ALV-J的临床检测,为ALV-J引起的鸡肿瘤性疾病的快速诊断及采取相应的治疗措施提供了重要的技术支撑。

逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测轮状病毒

为了给轮状病毒感染的诊断和流行病学研究提供更为敏感和可靠的手段，选取Ａ组轮状病毒ＶＰ７基因上的２段高度保守序列作为引物，在优化逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）条件的基础上，建立了检测轮状病毒的ＲＴ－ＰＣＲ方法。通过对比试验，确定了ＰＣＲ的最优模式：９４℃变性１ｍｉｎ→５５℃退火１ｍｉｎ→７２℃延伸２ｍｉｎ，３０个循环后再在７２℃下延伸１０ｍｉｎ。用此模式进行了ＲＴ－ＰＣＲ的特异性和敏感性试验。检测的６株轮状病毒分离株（牛ＨＮ－７、ＢＲＶ００７、ＢＲＶ０１４、ＢＲＶ６５５５、猪Ｌｉ９９、Ｎａｎ８６）及２株参考株（牛ＮＣＤＶ、猴ＳＡ１１），都能扩增出唯一的３４２ｂｐ的目的条带；对猪流行性腹泻病毒（ＰＥＤＶ）及传染性胃肠炎病毒（ＴＧＥＶ）感染猪的粪样、正常ＭＡ１０４细胞检测结果均呈阴性；检测的敏感度可达１ｐｇ水平。对４０份猪、牛、兔的腹泻粪样检测，３０份呈阳性，而用作平行对照的夹心ＥＬＩＳＡ法检测，有２５份呈阳性，两者符合率为８７．５％。两法检测不符的５份粪样的ＰＣＲ扩增产物，用地高辛标记探针进行了斑点杂交，结果均呈阳性，表明ＲＴ－ＰＣＲ法比ＥＬＩＳＡ法敏感性高。

IFN-γ治疗结核的动物实验研究

目的 探讨 IFN- γ对结核的治疗作用。方法 在建立小鼠结核模型的基础上 ,给予小鼠 IFN- γ腹腔内注射 ,采用 RT- PCR法观察小鼠肺组织 IFN-γ的表达 ,病理切片及肺组织内结核菌培养的对比。结果 给予 IFN-γ注射的小鼠病理组织像上也可见结核肉芽肿样病变 ,但对照组织病理切片上可见在渗出病变的基础上 ,出现灶性坏死。两组病变对比出现明显的差异。肺内细菌数也呈现明显的对比。IFN- γ的 m RNA表达 ,实验组较对照组明显减少。结论 IFN-γ是一个有效的增强宿主抵御结核分支杆菌感染的免疫调节细胞因子。

Fas/FasL mRNA在小细胞肺癌石蜡包埋组织中的表达及其临床意义

目的探讨Fas、FasLmRNA在小细胞肺癌石蜡包埋组织中的表达情况及其临床意义。方法应用RT-PCR方法检测Fas、FasLmRNA在46例小细胞肺癌和相应的癌旁正常肺组织中的表达情况。结果46例小细胞肺癌中FasmRNA阳性表达率为47.8%,明显低于在正常肺组织中的表达率(80.0%)P<0.05,FasLmRNA阳性表达率为58.7%,明显高于在正常肺组织中的表达率(35%)P<0.05,FasLmRNA在淋巴结转移和TNM分期中的表达差异有统计学意义,FasLmRNA表达阳性组患者累计生存率明显低于阴性组患者。结论FasmRNA低表达可能对SCLC发展起促进作用;FasLmRNA高表达可能与SCLC转移和预后相关。

前列腺癌细胞中NSBP1基因表达上调

明确用mRNA差异显示技术 (mRNA DD)筛选出的前列腺癌相关基因NSBP1(NucleosomalBindingProtein 1)在前列腺癌细胞系的表达情况。在GenBankNR数据库中对筛选出的 5条差异表达序列标签 (EST)进行同源性分析 ,其中 1条与已知基因NSBP1高度同源 (97% )。半定量RT PCR结果显示在LNCaP、DU14 5及PC 3前列腺癌细胞系中NSBP1mRNA的表达水平分别高于正常前列腺组织 2 5倍、3 4倍和 3 6倍 ,与Northern杂交分析结果趋势一致。7例前列腺癌组织的RT PCR结果也体现了相同的表达趋势 ,NSBP1表达较配对正常前列腺组织增高 ,差异有统计学意义。以上结果表明NSBP1基因在前列腺癌细胞系和组织中的表达均明显高于正常前列腺组织 ,NSBP 1表达上调可能参与了前列腺癌的发生发展过程。

THANK基因的克隆和序列分析

目的克隆THANK基因全长及胞 外区片段并测序。方法采用RT-PCR技术,从人白血 病细胞系HL-60细胞总RNA中扩增人THANK cDNA,并定向克隆于pMD-18 T载体,转 染大肠杆菌、抽提质粒后,用ABI PRISM^TM 377XL DNA自动测序仪测序。结果RT-PCR扩增出一个858bp的DNA片段,限制性内 切酶图谱分析和测序结果显示:该858bp片段为编码人THANK的cDNA,与公布的人THANK 基因序列一致。结论本实验成功地克隆了人THANK基 因,为进一步表达人THANK基因并研究其功能,开发与临床应用奠定了基础。

MMP-2、MMP-9在子宫肌瘤组织中的表达及意义

目的探讨基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9在子宫肌瘤组织中的表达及意义。方法收集30例子宫肌瘤患者的术后子宫肌瘤组织及其周围的正常子宫组织标本,分别应用明胶酶谱法、Western blot技术和PTPCR法检测标本中的MMP-2、MMP-9蛋白及其mRNA表达,并比较各检测指标在两种组织中的变化。结果在子宫肌瘤组织中MMP-2蛋白及其mRNA表达量均明显高于正常子宫组织(P均<0.05),而在两种组织中MMP-9蛋白及其mRNA表达量比较均无统计学差异(P均>0.05)。结论 MMP-2蛋白在子宫肌瘤组织中呈高表达,参与了子宫肌瘤的发生和发展。

传染性法氏囊病病毒中国强毒株A节段cDNA基因的克隆和序列分析

以来自哈尔滨传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ） 强毒株（Ｈａｒｂｉｎ 毒株，Ｈ） 的基因组ＲＮＡ为模板，用反转录聚合酶链反应（ＲＴ－ ＰＣＲ） 的方法得到了其Ａ 节段的全长ｃＤＮＡ 片段，分５＇端（１ ６５９ｂｐ） 和３＇端（１ ４４４ｂｐ） 上下两段分别克隆到ｐＧＥＭＢ○Ｒ － Ｔ 载体上，测定了其核苷酸顺序，在长为３ １０１ ｂｐ 中含有两个阅读框ＯＲＦＡ１ 和ＯＲＦＡ２ ，分别编码１ ０１２ 个氨基酸的前体蛋白（ＶＰ２ － ４ －３） 和１４５ 个氨基酸的ＶＰ５，ＯＲＦＡ１ 和ＯＲＦＡ２ 有部分的重叠。将核苷酸序列及推测出的氨基酸序列与已报道的ＩＢＤＶ 血清Ⅰ型和Ⅱ型毒株的相应序列进行了比较，结果表明：Ｈ 毒株与其它血清Ⅰ型毒株之间，在核苷酸水平上存在２５ｂｐ － ２６７ｂｐ 的差异；在氨基酸水平上存在１７ ～４０ 个氨基酸的差异。在ＶＰ２ － ４ － ３ 内比较显示，Ｈ 毒株与Ｐ２ 、Ｃｕ－ １ 之间氨基酸的差异最小为１ ．７％ ，Ｈ 毒株与ＵＫ６６１ 之间氨基酸的差异最大为３ ．９ ％ 。变异主要发生在ＶＰ２ 的可变区（２０６ － ３５０ 位氨基酸） ，在Ｈ 毒株所特有的１２ 个氨基酸当中，该区就占５ 个，代表１ ．７６ ％ 的变异。ＶＰ４、ＶＰ３

中国猪瘟兔化弱毒兔脾组织毒部分基因序列分析

利用反转录（ＲＴ）及套式ＰＣＲ（ＮＰＣＲ）方法，获得了中国猪瘟兔化弱毒（ＨＣＬＶ）兔脾组织毒５１１０个碱基（２２４０～７３５０）的扩增片段，包括其结构蛋白基因ｇｐ５５和非结构蛋白基因ｐ５４及ｐ８０，将其克隆于测序载体中，通过测序确定了这些基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列。

恙螨体内肾综合征出血热病毒基因的套式PCR检测

目的：检测恙螨体内微量肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）基因。方法：选择ＨＦＲＳＶ膜蛋白（ＭＰ）基因的保守区核苷酸序列合成两对引物，采用异硫氰酸胍一步抽提ＲＮＡ，建立了反转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测鼠体恙螨及游离恙螨体内ＨＦＲＳＶ－ＲＮＡ的方法，扩增产物经凝胶电泳及点印迹杂交证实具有特异性。结果：ＨＦＲＳＶ抗原阳性鼠体恙螨５０只组、１０只组、游离恙螨５０只组，经ＲＴ－ＰＣＲ检测为阳性；ＨＦＲＳＶ抗原阳性鼠体恙螨５只组，ＨＦＲＳＶ抗原阴性鼠体恙螨５０只、１０只和５只组，游离螨１０只和５只组均未见明显扩增带。进一步用ＮｅｓｔｅｄＲＴ－ＰＣＲ检测，在ＲＴ－ＰＣＲ未检测出ＨＦＲＳＶ－ＲＮＡ各组中均检测有ＨＦＲＳＶ－ＲＮＡ，最低检出为５只螨组。并用核酸分子杂交技术进一步证实了上述结果。结论：ＮｅｓｔｅｄＲＴ－ＰＣＲ具有高特异、高敏感的特点，可用于检测恙螨体内微量ＨＦＲＳＶ－ＲＮＡ，从分子生物学角度为恙螨作为ＨＦＲＳＶ的传播媒介提供了直接证据。

新型冠状病毒不同核酸检测方法在临床应用中的评价

目的探讨和评价新型冠状病毒(SARS-CoV-2)不同核酸检测方法在临床工作中的应用。方法对2020年2月中旬送检的76例咽拭子标本及5例痰标本同时分别用一步RT-PCR法及NASBA(nuclear acid sequence-based amplification)恒温扩增芯片法进行2019-nCoV核酸检测。结果81例患者中确诊COVID-19的有51例,实时荧光一步RT-PCR法检测阳性21例(25.93%),NASBA恒温扩增芯片法检测阳性11例(13.58%)。实时荧光一步RT-PCR法在诊断COVID-19中灵敏度(0.412)高于NASBA恒温扩增芯片法(0.216),阴性预测值(0.500)高于恒温扩增法(0.429),诊断准确性(YI=0.412)高于恒温扩增芯片法(YI=0.216),两种方法的特异性和阳性预测值均为100%。两种方法单次检测的假阴性率分别为58.82%和78.43%。结论新型冠状病毒(SARS-CoV-2)不同核酸检测方法之间灵敏度差异较大,应用前要对检测方法和试剂盒进行性能评价,两种核酸检测法的特异性和阳性预测值均很高,但单次核酸检测结果假阴性率较高,临床诊断时应综合考虑。

应用反转录 - 聚合酶链技术快速检测猪瘟病毒RNA的研究

依据猪瘟病毒（ＣＳＦＶ）５′端非编码区保守序列设计一对ＰＣＲ引物，建立了检测ＣＳＦＶ的反转录聚合酶链（ＲＴＰＣＲ）技术。应用该技术从猪瘟兔化弱毒感染兔的脾、淋巴结、肾与肌肉等以及石门株强毒感染猪的脾与肌肉和湖北分离毒株感染猪组织匀浆液中均特异扩增出了１条预期大小为１９４ｂｐ的片段，从实验感染兔和猪的血液中也特异扩增出了该片段，但对牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）和健康兔脾总ＲＮＡ以及健康猪的血液ＲＮＡ扩增均为阴性。采用这种方法，对实验感染兔脾总ＲＮＡ的检测灵敏度可达１０－８ｇ，表明其灵敏度足以达到临床检验的要求。

逆转录-聚合酶链反应诊断IBDV的免疫后感染

用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)对 5个养鸡场的 13份病死鸡腔上囊、腺胃标本进行了检测 ,诊断为免疫后感染传染性腔上囊病毒 (IBDV) 。

颅脑损伤后促红细胞生成素的变化和意义

目的通过制作大鼠急性重型颅脑损伤模型,探讨急性颅脑损伤后促红细胞生成素动态变化的规律及意义,为今后外源性促红细胞生成素治疗颅脑损伤提供理论依据和参考。方法将120只SD大鼠随机分为对照组和颅脑损伤组,每组60只,检测时点为改良Feeney法颅脑损伤模型制作后5h、12h、24h、3d、5d、7d六个时点,在每个时点处死对照组及颅脑损伤组各10只大鼠进行标本制作。采用RT-PCR检测EPO mRNA量,采用免疫荧光法检测阳性细胞数。结果脑损伤组在颅脑损伤后5h开始出现EPO,mRNA及免疫荧光蛋白染色阳性细胞数均在损伤后5d持续升高,在伤后24h至3d达到高峰,5d后出现下降,7d时降至刚损伤后的水平,对照组在各时点mRNA及免疫荧光蛋白染色阳性细胞数均持续表达,无明显的变化趋势。经重复测量方差分析的结果表明,两组EPO mRNA表达量随时间变化的趋势有差异(F=22.368,P<0.01),两组免疫荧光蛋白染色阳性细胞表达量随时间变化的趋势有差异(F=19.324,P<0.01)。结论大鼠急性颅脑损伤后皮质内EPO可出现短暂性的升高,可能对神经系统可以起到保护作用。

大肠癌细胞表达的Fas配体具有功能性

目的 :探讨大肠癌细胞 Fas配体 (Fas L ) m RNA和蛋白的表达及其功能。方法 :分别采用 RT- PCR和 Western印迹法以及氚释放细胞活性测定技术检测大肠癌细胞株中 Fas L m RNA和蛋白的表达及其功能。结果 :所检测的 6株大肠癌细胞(RPMI 4788、HCT- 116、DL D- 1、L o Vo、Wi Dr和 COL O 32 0 DM)全部表达 Fas L m RNA和蛋白 ;DL D- 1,L o Vo和 Wi Dr等部分大肠癌细胞具有 Fas依赖的细胞毒活性。其中 DL D- 1细胞活性具有量效关系 ,并且乙酸肉豆蔻佛波醇 (PMA )和离子霉素(ionom ycine )刺激能显著增强 DL D- 1的细胞活性。结论 :DL D- 1、L o Vo和 Wi Dr等 3株大肠癌细胞表达功能性 Fas配体 ,并可能以此反击机体免疫系统 ,逃避免疫监督。

下丘脑褪黑素受体亚型基因及蛋白表达的研究(英文)

目的 :应用 PT- PCR技术和免疫组织化学染色显示人胚胎下丘脑褪黑素受体及其亚型的分布。方法 :取人胚胎下丘脑组织 ,抽提总 RNA并应用 RT- PCR方法检测其 m RNA,扩增所得阳性产物用自动测序仪测序 ;石蜡包埋下丘脑组织 ,应用鼠抗人 m t1 和 MT2 受体单克隆抗体分别检测褪黑素 mt1 和 MT2 受体亚型 m RNA及其蛋白的表达。结果和结论 :人胚胎下丘脑组织中存在 m t1 和 MT2 受体亚型 m RNA的表达及其蛋白的翻译 ,提示在该组织中有 m t1 和 MT2

胃癌组织中FHIT基因的异常表达

探讨FHIT基因与胃癌关系。方法 :采用PT -PCR及PCR产物直接测序法 ,对 2 6例胃癌组织及其配对正常组织的FHIT基因进行检测。结果 :7例 (2 6 .9% )胃癌组织存在异常FHIT转录本的表达 ,其中 1例无正常FHIT转录本的表达 ;另 6例同时存在正常FHIT转录本的表达 ;配对正常组织均无异常FHIT转录本的表达 ;测序证实异常转录本缺失 1个或 1个以上FHIT外显子。结论 :FHIT转录本的异常是胃癌中常见的和肿瘤特有的改变 ,FHIT基因的异常与我国部分胃癌的发生有关。

外科手术患者丙型肝炎病毒感染调查

目的 调查外科患者HCV感染情况。方法 采用酶联免疫吸附的方法和逆转录 -聚合酶链反应 (PT -PCR)方法进行HCV测定。结果 2 5 5 0 0例外科患者中HCV感染率为 3 15 %,其中泌尿外科组HCV感染率最高(13 11%) ,显著高于其它科 (P <0 0 1) ;其余外科组与正常组相比较差异不显著 (P >0 0 1)。抽取 5 0 0例HCV感染的病例 ,应用PT -PCR检测HCVRNA ,阳性率为 77 2 %。结论 透析患者是HCV感染的高危人群 ,加强HCV早期感染的检测十分重要。

PIK3CA及PDK1在乳腺浸润性导管癌中的表达及临床意义

目的探讨PIK3CA、PDK1在乳腺浸润性导管癌中的表达情况及其临床病理学意义。方法采用免疫组织化学SP法及RT-PCR法检测160例浸润性导管癌及对应癌旁正常组织中PIK3CA和PDK1的表达情况,并分析二者在不同组织中表达的差异及其与乳腺癌临床病理学特征的相关性。结果免疫组化检测显示PIK3CA和PDK1在浸润性导管癌中的表达均高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.001),且PIK3CA的表达与淋巴结转移、HER2阳性表达及Ki-67指数有一定相关性(P<0.01),PDK1的表达与淋巴结转移、ER阳性表达及Ki-67指数有一定相关性(P<0.01)。RT-PCR结果显示,乳腺癌组织中PIK3CA和PDK1 mRNA水平相对表达量显著高于正常组织中mRNA水平相对表达量(P<0.001),差异有统计学意义。结论 PIK3CA和PDK1在乳腺癌中高表达,表明二者参与了乳腺癌的发生、发展过程,且对乳腺癌分子分型及预后的评估及后续治疗提供一定参考价值。

差异显示技术及其进展

差异显示技术是在转录水平上研究基因表达差异的有效方法。它通过一系列的锚定引物与随机引物组合把不同种细胞的ｍＲＮＡ进行分组反转录及ＰＣＲ扩增，在相邻泳道上显示扩增结果，通过比较电泳图谱找出差异。差异显示技术建立至今仅五年时间便在分析基因表达差异、绘制遗传图谱、分离特异性表达基因、临床诊断遗传疾病等方面被广泛应用，并不断得到改进和完善。