一种新的免疫球蛋白超家族成员PTA1的细胞分布及表达的研究

ＰＴＡ１分子是一种新的人类Ｔ细胞活化抗原，同时表达于血小板表面，最近基因克隆序列表明，ＰＴＡ１分子属于免疫球蛋白超家族中一个新的成员。ＰＴＡ１分子与杀伤性Ｔ淋巴细胞的分化密切相关，并参与血小板的凝集和活化。本文应用ＰＴＡ１单克隆抗体间接免疫荧光染色和流式细胞仪分析，对ＰＴＡ１抗原在正常人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）、人胎儿胸腺细胞及各种血液细胞系的分布及表达进行了较系统的观察。结果表明，正常人ＰＢＭＣ经ＰＨＡ刺激后ＰＴＡ１有较高水平表达，并与Ｔａｃ抗原（ＣＤ２５）表达具有良好的相关性；ＰＭＡ刺激的胎儿胸腺细胞、ＰＭＡ刺激的Ｊｕｒｋａｔ细胞和Ｔ淋巴细胞杂交瘤细胞系４７Ｃ７均有高水平的表达，而Ｂ淋巴细胞系和绝大多数髓样细胞系则不表达该抗原。此结果对于进一步研究ＰＴＡ１分子的功能，以及对ＰＴＡ１配体的鉴定具有重要的价值。

小鼠CD226(PTA1)的基因克隆及其异型

目的 :克隆小鼠CD2 2 6 (PTA1)分子。方法 :从GenBank中检索出与人CD2 2 6分子在氨基酸水平上有 5 1%同源性的EST序列 ,设计并合成特异性引物 ,采用快速扩增cDNA末端的RACE方法 ,从 4周龄BALB c小鼠的胸腺中扩增小鼠CD2 2 6cDNA序列。结果 :克隆出完整的小鼠CD2 2 6cDNA ,长 2 2 2 3bp ,其中开放读框为 10 0 2bp ,编码含信号肽在内的 333个氨基酸 ,属免疫球蛋白超家族分子 ,较人CD2 2 6分子少了 3个氨基酸 ,在氨基酸水平上有 5 3%的同源性。此外 ,还克隆了小鼠CD2 2 6分子的 3种异型。结论 :成功克隆出小鼠CD2 2 6 (PTA1)cDNA ,并发现 3种异型 ,全面探讨该分子生物学特性 ,进行体内功能实验 ,基因敲除小鼠和转基因小鼠的研究提供了坚实的基础。

人血小板/T细胞活化抗原PTA1/Ig融合蛋白表达载体的构建、表达及鉴定

目的：获得人血小板／Ｔ细胞活化抗原１（ｐｌａｔｅｌｅｔａｎｄＴｃｅｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎ１，ＰＴＡ１）胞膜外区与人ＩｇＧ１Ｆｃ段融合蛋白，为ＰＴＡ１配体的鉴定及其功能的研究提供有力的工具。方法：针对人ＰＴＡ１ｃＤＮＡ序列设计３段引物，通过反转录、半套式ＰＣＲ方法从活化Ｊｕｒｋａｔ细胞中扩增出ＰＴＡ１胞膜外区基因片段，并将其克隆入融合蛋白表达载体ｐＩＧ中，通过酶切、ＰＣＲ及序列测定鉴定重组表达载体。重组载体通过ＤＥＡＥｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，经夹心ＥＬＩＳＡ及亲和层析、ＳＤＳＰＡＧＥ鉴定融合蛋白的表达及免疫学活性。结果：经序列测定后证实重组表达载体含有正确的ＰＴＡ１胞膜外区序列及剪接供体序列，转染ＣＯＳ７细胞后，通过亲和层析纯化证实融合蛋白的Ｍｒ为８３０００，并能被抗ＰＴＡ１胞膜外区单抗及抗人ＩｇＧＦｃ的单抗同时识别。结论：ｐＰＴＡ１／Ｉｇ融合表达载体的构建及表达成功，为ＰＴＡ１的功能及配体（ＰＴＡ１Ｌ）的研究打下了良好的基础。

一种新的人内皮细胞可诱导性粘附分子PTA1的表达、调变及粘附功能

目的观察PTA1分子在活化人内皮细胞的表达、调变及其所参与的粘附功能。方法用间接免疫荧光染色结合流式细胞仪分析观察PTA1在内皮细胞的表达和分布 ;用RT PCR方法检测内皮细胞中PTA1mRNA的表达 ;用Na251CrO4 标记静止和TPA活化Jurkat细胞 ,采用4h粘附实验观察不同条件下内皮细胞和Jurkat细胞间的粘附以及PTA1/Ig融合蛋白的粘附阻断作用。结果①静止内皮细胞表达很弱的PTA1分子 ,TNF α、LPS可显著上调PTA1在内皮细胞的表达 ,TNF α刺激8h、LPS刺激2d后PTA1分子在内皮细胞的表达达到高峰。用RT PCR方法在TNF α刺激6h后的内皮细胞中可检测到较高水平的PTA1mRNA ,但静止内皮细胞中只能检测到极微弱的PTA1mRNA。②TNF α活化内皮细胞与Jurkat细胞的粘附作用明显高于静止内皮细胞与Jurkat细胞的粘附作用 ,TPA活化Jurkat细胞与内皮细胞间的粘附作用明显高于静止Jurkat细胞与内皮细胞间的粘附作用 ,且这两种粘附作用均可部分被PTA1/Ig 融合蛋白所阻断。结论TNF α和LPS刺激后的活化内皮细胞可表达较高水平的PTA1mRNA和PTA1蛋白 ,且此PTA1分子可直接参与活化内皮细胞和Jurkat细胞间的粘附 ,表明PTA1是内皮细胞上一种新的可诱导性粘附分子。

可溶性PTA1分子的发现及其检测方法的建立

目的建立检测sPTA1的方法 ,探讨正常人和肿瘤患者血清中是否存在可溶性PTA1(sPTA1)分子。方法以亲和层析法从血小板纯化的天然PTA1分子作为免疫原 ,制备抗PTA1分子的多克隆抗体(PcAb) ,并以此建立检测sP TA1的双抗体夹心ELISA法。结果建立的双抗体夹心ELISA法敏感性达100ng/L,应用此方法从经TPA ,PHA及抗CD3mAb活化的人PBMC细胞培养上清中检测到sPTA1。与膜型PTA1(mPTA1)分子表达的动态相关研究发现,sPTA1的产生晚于mPTA1分子的表达 ,且可持续存在。检测60例正常人血清sPTA1的水平为(36.2±4.5)μg/L ,16例肿瘤患者为(57.3±5.0)μg/L。血清中sPTA1相对分子质量(Mr)约为50000。结论首次发现sPTA1分子 ,建立了具有较高敏感性和特异性的检测sPTA1的方法 ,为进一步深入研究PTA1分子的生物学功能提供了新的手段。

人血小板/T细胞活化抗原1(PTA1)亲和层析柱的制备及PTA1/Ig的纯化

目的：制备可用于纯化血小板／Ｔ细胞活化抗原１（ｐｌａｔｅｌｅｔａｎｄＴｃｅｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎ１，ＰＴＡ１）融合蛋白的亲和层析柱，纯化真核表达的ＰＴＡ１／Ｉｇ融合蛋白，以进一步研究ＰＴＡ１的功能及其配体。方法：以硫酸铵及阴离子交换色谱法纯化抗ＰＴＡ１ｍＡｂ，并交联Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ制备ＰＴＡ１亲和层析柱。通过亲和层析法，从ｐＰＴＡ１／Ｉｇ表达载体转染的ＣＯＳ７细胞培养上清中纯化ＰＴＡ１／Ｉｇ融合蛋白，用夹心ＥＬＩＳＡ及ＳＤＳＰＡＧＥ鉴定纯化结果。结果：硫酸铵及阴离子交换色谱纯化后，获得纯度高和活性好的抗ＰＴＡ１ｍＡｂ，用其交联Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ制备ＰＴＡ１亲和层析柱，交联率为９６％。该亲和层析柱可从ｐＰＴＡ１／Ｉｇ转染的ＣＯＳ７细胞上清每１００ｍｌ中，纯化ＰＴＡ１／Ｉｇ融合蛋白约１２６μｇ。结论：制备成功可用于纯化ＰＴＡ１的亲和层析柱，并获得纯化的ＰＴＡ１／Ｉｇ融合蛋白。

噬菌体展示法筛选抗人PTA1单克隆抗体结合肽

目的从噬菌体展示文库中筛选能与抗人PTA1单克隆抗体(mAbs)特异性结合的短肽。方法采用protein-A亲和层析法纯化系列抗人PTA1mAbs，通过流式细胞术检测筛选出能够阻断PTA1-Fc融合蛋白与其天然配体结合的mAb，经过三轮亲和筛选，从噬菌体随机12肽库中筛选可特异性结合mAb的重组噬菌体阳性克隆，进而对这些克隆的短肽序列进行测定和分析。结果确定了能够阻断PTA1-Fc融合蛋白与其天然配体结合的mAb为LeoA1，得到了13个具有特异性结合LeoA1的重组噬菌体阳性克隆，序列测定结果发现，这些可结合LeoA1的短肽，有较保守而集中的模式序列，即WPXHHX序列。结论这些具有保守模式序列的短肽，有可能模拟PTA1分子的功能表位，成为其天然配体拮抗剂的候选肽段。此外，PTA1分子与其配体结合的功能表位的确定，也为今后寻找天然配体和进一步深入研究PTA1分子的结构和功能提供了实验依据。

一种新的恒河猴T淋巴细胞活化抗原PTA1

本文应用抗人Ｔ细胞活化抗原ＣＤ２５和ＰＴＡ１ＭｃＡｂ对恒河猴ＰＢＭＣ进行间接免疫荧光染色和流式细胞仪分析，结果发现，恒河猴静止ＰＢＭＣＣＤ２５和ＰＴＡ１均为阴性，而ＰＨＡ活化后或经连续２个月注射ｒＨｕＴＮＦ－α恒河猴ＰＢＭＣ均表达高比率的ＣＤ２５和ＰＴＡ１阳性细胞。此结果表明，ＰＴＡ１抗原可作为恒河猴活化Ｔ淋巴细胞的一种有用标志，为ＰＴＡ１分子结构和功能研究以及采用恒河猴作为灵长类动物模型，观察细胞免疫功能状态提供了有用的资料。

人血小板T细胞活化抗原PTA1基因探针的制备及初步鉴定

目的：制备地高辛标记的PTA1基因探针，以用于PTA1表达及功能的研究．方法：根据新克隆的人PTA1基因序列，设计针对PTA1分子不同结构域的引物，通过PCR扩增、地高辛标记的方法制备基因探针．结果：细胞原位杂交方法证实这种探针具有较高的敏感性和特异性．结论：PTA1基因探针的制备为进一步研究PTA1分子的分布、表达及功能打下了较好的基础．

支气管哮喘患者T淋巴细胞PTA1的表达

目的:研究特异性血小板/T细胞活化抗原1（PTA1）在支气管哮喘患者外周血T淋巴细胞的表达,探索T细胞在支气管哮喘发病中的作用。方法:应用双色直接荧光标记,流式细胞仪分析支气管哮喘患者在急性期及缓解期时体内CD3,CD4,CD8淋巴细胞在PHA刺激下PTA1（CD226）表达。结果:支气管哮喘患者组CD3淋巴细胞上PTA1表达率高于正常对照组（P<0.01）;急性期组CD3,CD8细胞上PTA1表达比正常对照组及缓解期组均显著增高（P<0.01）,CD4细胞上PTA1表达也存在差异（P<0.05）;PTA1在缓解期组 CD4,CD8细胞上的表达与正常对照组差异无显著意义（P>0.05）。结论:支气管哮喘患者体内存在T细胞亚群异常活化,PTA1表达增高;CD4,CD8细胞活化程度与支气管哮喘疾病严重程度有关;PTA1可能参与了支气管哮喘的免疫发病机制。

PTA1在人巨核母细胞系HEL细胞和血小板的表达及分布

应用抗人血小板和Ｔ细胞活化抗原１（ＰＴＡ１）单克隆抗体（ｍＡｂ）间接免疫荧光染色和流式细胞仪（ＦＣＭ）分析，以及胶体金免疫电镜技术，检测了人巨核母细胞系ＨＥＬ细胞和血小板膜表面ＰＴＡ１分子的表达水平，并对静止与活化血小板膜表面ＰＴＡ１分子的表达和分布进行了比较。结果表明，ＨＥＬ细胞与人血小板膜表面均表达高水平ＰＴＡ１分子，活化血小板膜表面ＰＴＡ１分子表达水平有所降低，但胞膜内陷所形成的胞浆空泡膜内侧可见密度较高的ＰＴＡ１分子。

血小板对ECV304细胞PTA1表达和PDGF释放的影响

目的:探讨血小板对妊高征患者血清刺激下的ECV304细胞(ECV304)表达人血小板/T细胞活化抗原1(PTA1)和释放血小板衍生生长因子(PDGF)的影响。方法①用间接免疫荧光染色结合流式细胞仪分析观察血小板与妊高征患者血清刺激的ECV304细胞孵育前后PTA1的表达②用ELISA方法检测血小板与妊高征患者血清刺激的ECV304细胞孵育前后PDGF的量。结果:①血小板与妊高征患者血清刺激(24h、48h)的ECV304细胞孵育后PTA1表达的百分率(6.32%、4.13%)明显低于对照组(15.51%、5.64%)(P<0.05)。②妊高征患者血清刺激ECV304细胞8h、24h、48h释放PDGF的量(1593、2625、2175ng/L)明显高于正常孕妇组(235、405、133.5ng/L)差异显著(P<0.01)。③血小板与妊高征患者血清刺激的ECV304细胞孵育后,24h、48h细胞培养上清液中PDGF-B的量又进一步增加(3266、2360ng/L),与对照组比差异显著(P<0.05)。结论:ECV304细胞与血小板之间的黏附可能是通过PTA1分子发挥作用的,同时导致了PDGF的进一步释放。

小鼠PTA1(CD226)胞膜外两个结构域同时与小鼠Tage4(CD155)的相互作用

目的:确定mPTA1分子与mTage4参与相互作用的结构域,以深入研究这两种分子的功能.方法:扩增编码mTage4全长分子和mPTA1,hICAM-1分子不同结构域的DNA序列,构建含mTage4,mPTA1不同结构域编码序列的截短体、mPTA1/hICAM-1荧光蛋白嵌合体分子基因的真核表达载体,并转染COS-7真核细胞,通过激光共聚焦扫描显微镜研究这两种分子间的相互作用.结果:DNA序列测定证实成功构建了含mTage4全长分子和mPTA1截短体、mPTA1/hICAM-1嵌合体分子基因的真核表达载体,激光共聚焦扫描显微镜观察结果表明mPTA1截短体分子和mPTA1/hICAM-1嵌合体分子不能与mTage4有效结合,而mPTA1全长分子能与mTage4相互作用.结论:mPTA1分子胞膜外区两个结构域同时参与了与mTage4的相互作用.

AP1对人CD226/PTA1启动子的调控作用

目的:确定血小板/T细胞活化抗原1(PTA1)基因的转录起始点,及激活蛋白1(AP1)对PTA1启动子的调控作用.方法:采用5′RACE方法确定PTA1基因的转录起始点;将含AP1的真核表达载体和含有PTA1启动子的荧光素酶的报告基因载体共转染人肝癌细胞系HHCC,培养48h后检测其荧光素酶活性.结果:人PTA1基因的转录起始点定位于ATG上游229bp处,AP1可以显著地增强PTA1启动子P1和P2的活性,转录因子ets1对AP1上调P1和P2活性有不同的调控作用.结论:PTA1的转录起始点位于ATG上游229bp处,AP1可能参与调控PTA1的表达.

识别不同结构域的PTA1/CD226的mAb与活化血小板的关系

目的:研究识别不同PTA1/CD226分子结构域的mAb与刺激血小板活化的关系。方法:采用识别不同结构域的抗PTA1/CD226的mAb(FMU17),应用免疫荧光染色、流式细胞术和血小板凝集试验,研究识别不同结构域mAb对血小板的活化作用。结果:识别CD226第1个结构域的3株mAb(FMU1、2和3)可以与血小板结合,并可刺激血小板发生凝集,而识别CD226第2个结构域的mAbFMU6、FMU7以及识别两个结构域之间序列的FMU4和FMU5既不能与血小板表面天然的CD226分子结合,也不能刺激血小板活化。结论:抗PTA1/CD226mAb刺激血小板活化与抗体识别的结构域有关。

四环素调控的PTA1/CD226转基因小鼠的初步建立

为研究小鼠PTA1分子在体内的功能,建立四环素调控的小鼠PTA1/CD226转基因小鼠,我们构建了pBI-5-mPTA1载体,显微注射入B6D1F1受精卵,使用PCR检测新生小鼠基因组DNA中的PTA1与荧光素酶(luciferase)基因。将mPTA1和荧光素酶双阳性小鼠耳成纤维细胞转染含rtTA的pUHD17.1质粒,用含有盐酸强力霉素(Dox)的培养基进行培养,检测细胞裂解液中荧光素酶的活性。将荧光素酶表达依赖Dox的小鼠与C57BL/6小鼠交配,采用PCR对子代鼠进行检测。最终共获得7只首建鼠,其目的基因表达高度依赖Dox,并得到了其中2只首建鼠的F1代小鼠。

PTA1在大鼠淋巴器官中定位分布的免疫组织化学和原位杂交研究

采用免疫组织化学方法和地高辛 -碱性磷酸酶标记原位杂交组织化学方法观察 PTA1在大鼠胸腺、脾脏和淋巴结等淋巴器官中的定位分布。首次证实 PTA1和 PTA1m RNA散在分布于大鼠脾脏和胸腺中 ,但在淋巴结中未见分布。本研究结果为全面了解 PTA1在体内的分布及功能提供重要的实验依据。