Dok4和Dok5 PTB结构域融合蛋白的表达和纯化

目的 :制备Dok4和Dok5PTB结构域的GST融合蛋白。方法 :用PCR方法分别扩增编码Dok4、Dok5PTB结构域的cDNA ,并将其克隆入表达载体pGEX 4T 3中 ,转化大肠杆菌BL 2 1,构建成表达GST PTB融合蛋白的菌株。经IPTG诱导表达后 ,经Glutathion Sepharose 4B亲和层析柱纯化 ,用SDS PAGE进行分析 ,该融合蛋白的表达量超过菌体总蛋白的 2 5 %。结果 :获得重组的GST 4PTB和GST 5PTB融合蛋白 ,纯度在 95 %以上 ,产物得率约 75 %。结论 :成功制备高纯度Dok4和Dok5PTB结构域的GST融合蛋白 ,为进一步研究磷酸化酪氨酸结合结构域 (PTB)

p62Dok PTB结构域融合蛋白的表达和纯化

目的 :制备p6 2DokPTB结构域的GST融合蛋白。方法 :用PCR方法扩增编码p6 2DokPTB结构域的cD NA ,并将其克隆入表达载体pGEX 4T 3中 ,转化大肠杆菌BL 2 1,构建成表达GST PTB融合蛋白的菌株。经IPTG诱导表达后 ,经Glutathion Sepharose 4B亲和层析柱纯化 ,用SDS PAGE进行分析 ,该融合蛋白的表达量超过菌体总蛋白的 2 5 %。结果 :获得重组GST PTB融合蛋白 ,纯度在 95 %以上 ,产物得率约 75 %。结论 :成功制备高纯度p6 2DokPTB结构域的GST融合蛋白 ,为进一步研究p6 2DokPTB结构域的结构和生物学功能奠定了基础。

DoksPTB结构域与EGFR特异性结合

目的:探讨Doks家族的PTB结构域在识别上游分子时的特异性。方法:利用裂解大量内源性表达表皮生长因子受体(EGFR)的COS-7传代细胞株获取EGFR,利用大肠杆菌表达GST融合蛋白GST1PTB、GST4PTB和GST5PTB,采用GST共沉淀技术检测Dok1、4和5的PTB结构域能否与EGFR结合。结果:Dok1的PTB结构域,而非Dok4和Dok5的PTB结构域,能够特异性地与被激活的EGFR结合,不能与未激活的EGFR结合。结论:Doks家族的PTB结构域功能有差别,即PTB结构域在识别上游分子时具有特异性。

p62dok-PTB结构域样新基因片段的克隆

利用 RT- PCR方法 ,从胎儿脾脏和肝脏组织中克隆出一个 342 bp的基因片段 ,并测定了其核苷酸序列。在基因库中未见相同序列报道 ,但该片段与 p62 dok- PTB结构域核苷酸序列有 93%的同源性 ,提示它是一种新的 p62 dok- PTB结构域样基因片段。

丹蛭降糖胶囊改善肥胖大鼠骨骼肌胰岛素抵抗机制的初步研究

目的:探讨丹蛭降糖胶囊对高脂饮食诱导的肥胖大鼠骨骼肌脂联素(APN),脂联素受体结合蛋白(APPL1)及葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)表达的影响。方法:雄性SD大鼠随机分为普通饮食组(NC组)、单纯高脂饮食组(HF组)、高脂饮食+丹蛭降糖胶囊组(FD组,470 mg·kg-1·d-1)、高脂饮食+吡格列酮组(PIO组,10 mg·kg-1·d-1)、高脂饮食+丹蛭降糖胶囊联合吡格列酮组(FD/PIO组,丹蛭降糖胶囊470 mg·kg-1·d-1+吡格列酮10 mg·kg-1·d-1),ig给药4周。NC组继续普通饲料喂养,给予蒸馏水ig。应用全自动生化分析仪测定骨骼肌甘油三酯(TG)含量;免疫组化及Western blot检测APN,APPL1,GLUT4在骨骼肌组织中的定位以及蛋白表达。结果:1HF组骨骼肌内TG含量显著高于NC组(P<0.01)。相较于HF组,各干预组大鼠骨骼肌TG含量均明显下降(P<0.05)。2免疫组化以及Western blot检测结果显示,HF组APN,APPL1,GLUT4表达较NC组明显降低(P<0.05);各干预组APN,APPL1,GLUT4表达均较HF组明显增加(P<0.05)。3相关分析发现,大鼠骨骼肌TG含量与HOMA-IR呈正相关(r=0.63,P<0.01),与APN,APPL1,GLUT4蛋白均呈负相关(r分别为-0.57,-0.51,-0.62,均P<0.01);HOMA-IR与APN,APPL1,GLUT4蛋白均呈负相关(r分别为-0.49,-0.44,-0.52,均P<0.05,P<0.01)。结论:丹蛭降糖胶囊可减轻骨骼肌脂质沉积,上调骨骼肌组织中的APN,APPL1,GLUT4表达,从而改善骨骼肌胰岛素抵抗。