人血清白蛋白与PTH(1-34)融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及鉴定

目的:在毕赤酵母中高效分泌表达人血清白蛋白与PTH(1-34)融合蛋白。方法:利用PCR技术获得HSA和PTH(1-34)基因,以柔性连接肽相连插入到表达载体pPIC9,重组质粒线性化后,用化学法转化毕赤酵母GS115,经组氨酸缺陷型培养板和PCR鉴定筛选得到转化子。在启动子AOX1和α交配因子信号肽的作用下,分泌表达融合蛋白HSA-PTH(1-34)。PCR法和电泳鉴定表达验证阳性转化子,并观测不同时间点的表达量。Western blot验证其免疫活性,在兔肾皮质细胞膜中测定腺苷酸环化酶的激活产生cAMP的量来检测融合蛋白的生物学活性。结果:PCR鉴定重组转化子验证了融合基因的成功整合,用甲醇诱导表达,蛋白电泳分析表明融合基因得到高效表达,HSA-PTH(1-34)同时具有HSA和PTH(1-34)的抗原性,且能激活兔肾皮质细胞中的腺苷酸环化酶产生cAMP,但活性低于PTH(1-34)。结论:在毕赤酵母中成功表达了具有生物学活性的人血清白蛋白与PTH(1-34)融合蛋白。

液质联用技术(LC-MS)在rh-PTH(1-34)肽图确定中的应用

目的:建立可用于质量控制的 rh-PTH(1-34)的标准胰酶肽图分析方法,并确定其理论肽图。方法:用胰酶动态酶切rh-PTH(1-34)探索最佳肽图分析条件,利用氨基酸特征吸收波长色谱分析结合 LC-MS 相对分子质量分析确证理论肽图。结果:多批 rh-PTH(1-34)原液经胰酶解、RP-HPLC 分析后,可产生4个主要肽段,其图谱与人工合成的 hPTH(1-34)对照品一致;确定其理论肽图为:T_1—HLNSMER、T_2—LQDVHNF、L_3—VEWLR、T_4—SVSEIQLMHNLGK。结论:建立的胰肽图分析方法可用于 rh—FFH(1—34)产品的质量控制,用氨基酸特征吸收波长分析辅助 LC-MS 相对分子质量分析可有效用于 rh-PTH(1-34)的标准肽图确定。

负载PTH(1-34)聚乳酸微球体外促成骨分化作用的研究

目的:评价包载PTH(1-34)聚乳酸微球的缓释效应对前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化的影响。方法:将MC3T3-E1细胞分为空白培养液对照组、持续性和间歇性给药组、未载药PLGA微球组和载药PLGA微球组。通过碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红染色和Reverse Transcription PCR观察负载PTH(1-34)的PLGA微球对细胞成骨分化的影响。结果:释放终浓度为10-9mol/L的载药PLGA微球组可以提高成骨细胞ALP活性,促进矿化,上调RUNX2、ALP和VEGF基因的表达。结论:PLGA微球缓释PTH(1-34)可促进成骨细胞分化。

人甲状旁腺激素1-34对培养的人牙髓细胞PTH-PTHrP受体mRNA表达的影响

目的:观察人甲状旁腺激素1-34(hum an Parathyroid hormone 1-34,hPTH1-34)对PTH-PTHrP(Parathyroid hormone-Parathyroid hormone related prote in)受体mRNA在体外培养的人牙髓细胞中表达的影响,探讨PTH影响牙本质形成和矿化的机制。方法:将培养的第4代牙髓细胞分为两组:实验组培养基加入含33.3 nmol/L hPTH1-34,在其培养的第5,10,15,20天提取总RNA,以RNA为模板在逆转录酶作用下合成cDNA,加入特异引物进行PCR扩增,同时扩增β-肌动蛋白的cDNA作为半定量RT-PCR的内参照,对PCR产物进行半定量分析。结果:在人牙髓细胞培养的5、10 d,对照组和实验组的PTH-PTHrP受体mRNA水平均较低,10 d以后PTH-PTHrP受体mRNA水平开始升高,实验组高于对照组,差异有统计学意义。结论:PTH-PTHrP受体的表达与牙髓细胞的分化密切相关;hPTH1-34可以促进PTH-PTHrP受体的表达,PTH可能通过促进PTH-PTHrP受体的表达或与PTH-PTHrP受体结合影响牙本质的形成和矿化。

甲状旁腺激素PTH(1-34)的二级结构及其功能研究

目的 :探讨甲旁亢患者血清中的甲状旁腺激素PTH(1 -34)二级结构的改变及其与功能的关系。方法 :采用远紫外圆二色谱分析法,对正常人及甲旁亢患者血清的PTH(1 -34)进行蛋白质二级结构的测定。结果 :甲旁亢患者血清PTH(1 -34)的二级结构与正常人相比有明显变化 ,在208nm和222nm处的远紫外圆二色谱波谷幅度降低 ,表明其α螺旋含量显著降低。结论 :甲旁亢患者血清的PTH(1 -34)除含量有明显增高外 。

人甲状旁腺素(1-34)衍生物在大肠杆菌中表达、纯化及其生物学活性

为研究Gly hPTH(1 34)衍生物的生物学活性 ,用重叠PCR方法合成编码hPTH(1 34)的DNA片段 ,克隆到融合表达载体pGEX 2T的缩短型谷胱甘肽转移酶基因GST6 9△的 3′末端 ,构建正确读码框架的融合基因 .在两个基因间引入蛋白质羟胺切割位点序列 ,转入E .coliJM10 9中 ,IPTG诱导表达 .该融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的 2 0 %以上 ,主要以包涵体形式存在 ,盐酸羟胺切割表达产物 .分析表明 ,80 %左右的融合蛋白被裂解为GST6 9△和Gly hPTH(1 34) .经分子筛柱层析和反相层析分离纯化获得重组Gly hPTH(1 34)衍生物 ,纯度达 98%以上 ,回收率约为 10mg/升发酵液 ,分子量为 4 177,等电点 (pI)为 8 4 0 ,N端 16个氨基酸 ,除第一个为甘氨酸外 ,其余与天然hPTH(1 34)序列一致 .Western印迹结果表明 ,Gly hPTH(1 34)衍生物具有hPTH(1 34)的免疫学活性 .体外活性测定结果表明 ,Gly hPTH(1 34)衍生物能刺激人成骨细胞HOSTE85增殖、增加细胞内胶原合成、ALP活性增高和cAMP生成量增加 ,并呈量效关系 ,提示它具有与化学合成的hPTH(1 34)相同的生物学活性 ,N端多一个Gly对其活性无明显影响 .

甲状旁腺激素(1-34)、多聚赖氨酸应用于口腔种植体表面促成骨作用研究

目的研究甲状旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)(1-34)、多聚赖氨酸应用于种植体表面的促成骨作用。方法将PTH(1-34)和多聚赖氨酸通过层层自组装的方式涂层到种植体表面。按照涂层制备方法和PTH(1-34)浓度将种植体分为4个组:PLL载体组(A组)、10μg组(B组)、100μg组(C组)和空白对照组(D组)。使用ELISA法探索该涂层的体外药物释放规律;将小鼠胚胎成骨前体细胞MC3T3-E1接种于涂层后的种植体表面,使用MTT法、碱性磷酸酶半定量、PCR等方法,检测该涂层在体外条件下对成骨细胞生物学行为的影响。结果通过层层自组装技术于钛种植体表面制成的PLL-PTH(1-34)聚电解质多层膜涂层在初始阶段表现出明显的释放过程,随后释放程度趋于平缓,第14天时仍可检出PTH(1-34)。MTT检测:第5天时C组OD值(1.738±0.026)与第1天(1.663±0.045)相比有明显升高(P=0.0219)。碱性磷酸酶半定量:第14天时,C组(3.377±0.336)U/gprot明显高于A组(2.537±0.083)U/gprot、B组(2.843±0.060)U/gprot和D组(2.063±0.061)U/gprot,差异均有统计学意义(P<0.05)。PCR检测:ALP基因于第7天时各组表达水平最高,且C组明显高于A、B、D三组,差异均有统计学意义(P<0.05);OCN基因于第14天时各组表达水平最高,且C组明显高于A、B、D三组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论在钛种植体表面可以通过层层自组装技术制成PLL-PTH(1-34)聚电解质多层膜涂层。通过该技术可以实现PTH(1-34)较长时间的局部释放,从而促进其表面成骨细胞的增殖和分化。

重组人甲状旁腺素(1-34)对角质形成细胞分泌IL-6和IL-8的影响

目的研究人甲状旁腺素(PTH)(1-34)对角质形成细胞分泌IL-6和IL-8的影响,探讨其治疗银屑病的分子机理。方法体外培养人角质形成细胞株(HaCaT),研究中设空白对照组、骨化三醇组、骨化三醇和PTH(1-34)联合组以及1.0×10-7mol/L～1.0×10-10mol/L4个不同剂量的PTH(1-34)给药组。48h后收集上清液,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测HaCaT细胞分泌至培养液中IL-6和IL-8的含量。结果在1.0×10-7mol/L～1.010-10mol/L四个梯度浓度PTH(1-34)及联合骨化三醇处理48h后,HaCaT细胞分泌IL-6量和空白对照组、骨化三醇组比较,差异无统计学意义,而IL-8的分泌量明显降低(P<0.05),且1.0×10-7mol/LPTH(1-34)处理组IL-8分泌量明显低于其他各组。结论PTH(1-34)治疗银屑病的作用机制可能部分通过调节IL-8的表达和分泌来实现。

人甲状旁腺激素(1-34)在人成骨肉瘤细胞中对基质Gla蛋白及Wnt/β-catenin信号通路的调节作用

目的观察人甲状旁腺激素(PTH)的N端活性片段PTH(1-34)对人成骨肉瘤细胞MG63基质Gla蛋白(MGP)表达的影响,以及PTH通过Wnt/β-catenin信号通路介导MGP表达调控的作用,探讨PTH(1-34)在防治骨质疏松症作用中可能的分子机制。方法(1)用不同浓度PTH(1-34)(10-9、10-8、10-7mol/L),单独或联合Wnt/β-catenin信号通路抑制剂DKK-1(200 ng/m L)干预MG63细胞;(2)检测碱性磷酸酶(ALP)染色及活力测定用于判断细胞分化情况;(3)MGP及Wnt/β-catenin信号通路各组分的m RNA及蛋白的表达分别采用实时定量RT-PCR及Western blotting方法。结果 (1)PTH(1-34)上调MGP基因的表达,MGP m RNA的表达分别是对照组的2.56倍、4.14倍、7.81倍(P<0.05或P<0.01),且呈剂量依赖性增高;(2)PTH增强MG63细胞ALP活力,Dkk-1抑制ALP活性,Dkk-1与PTH联用部分阻断PTH上调ALP活力(P<0.05);(3)PTH上调MGP及Wnt/β-catenin信号通路中相关因子LRP5、β-catenin、Runx2 m RNA及蛋白水平,其m RNA分别是对照组的2.65、4.01、3.48倍(P<0.05或<0.01);DKK-1对PTH(1-34)促MGP表达没有影响,但大部分阻断了Wnt/β-catenin信号通路中相关因子的表达。结论PTH(1-34)能明显上调MGP及Wnt/β-catenin信号通路中相关因子的表达,Wnt/β-catenin信号通路和MGP在PTH调节骨代谢中起重要作用。

比较雷奈酸锶与甲状旁腺激素(1-34)对卵巢切除大鼠骨质量的影响

目的：比较雷奈酸锶与甲状旁腺激素（1-34）对卵巢切除大鼠骨质量的影响。方法：80只SD大鼠,分别接受假手术（A组,n=10）和双侧卵巢切除（B组,n=70）手术,术后3个月B组大鼠随机分为7组,每组10只。分别sc生理盐水[0.9 g/（kg·d）,B0组];ig雷奈酸锶低、中、高剂量[0.45、0.9、1.35g/（kg·d）,B1～B3组];sc甲状旁腺激素（1-34）低、中、高剂量[30、60、90μg/（kg·d）,连续给药5 d后停止给药2 d,B4～B6组],A组大鼠给药方案同B0组。8周后处死所有大鼠,酶联免疫吸附法（ELISA）检测大鼠血清1型前胶原氨基末端肽（P1NP）、1型胶原C端肽（CTX-1）含量;骨密度仪检测第4腰椎骨密度;微电子计算机断层扫描（CT）检测松质骨相对体积（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁分离度（Tb.Sp）;压缩试验检测第5腰椎最大载荷和弹性模量。结果：与A组比较,B0～B6组大鼠血清P1NP、CTX-1水平显著升高,第4腰椎骨密度、第5腰椎最大载荷、弹性模量显著降低（P〈0.05）;B0组大鼠第4腰椎BV/TV水平显著降低、Tb.Sp水平显著升高（P〈0.05）。与B0组比较,B1～B3组大鼠第4腰椎骨密度、第5腰椎最大载荷、弹性模量显著升高（P〈0.05）;B4～B6组大鼠P1NP含量、BV/TV、Tb.N水平、第4腰椎骨密度、第5腰椎最大载荷、弹性模量显著升高,且高于B1～B3组（P〈0.05）;B1～B6组大鼠Tb.Sp水平显著降低,且B4～B6组低于B1～B3组（P〈0.05）。8组大鼠Tb.Th水平比较,B0～B6组大鼠CTX-1含量比较,差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论：甲状旁腺激素（1-34）抑制去卵巢大鼠骨丢失、改善其椎体骨微观结构和生物力学性能的作用强于雷奈酸锶。

注射用重组人甲状旁腺素代谢产物PTH(1-34)的测定及其药动学

目的:注射用重组人甲状旁腺素PTH(1-84)在体内的代谢产物PTH(1-34)对骨质疏松症具有较好的疗效,本试验通过测定人血浆中PTH(1-34)浓度的变化,了解PTH(1-34)在体内的分布,对注射用重组人甲状旁腺素PTH(1-84)的药效及作用机制具有重要意义。方法:采用固相萃取法结合放射免疫分析(RIA)测定人血浆中注射用重组人甲状旁腺素代谢产物PTH(1-34)的浓度,采用DAS2.0数据处理系统进行药动学分析。结果:PTH(1-34)的线性范围为10～1 280 pg.mL-1,最低检测限为10 pg.mL-1(RSD为3.51%),采用固相萃取柱Styre Screen H2P在血浆样本萃取效率大于85%。结论:本法测定注射用重组人甲状旁腺素在血浆中的代谢产物PTH(1-34)的方法是可行的,特异性、灵敏度、精密度和准确度较高,可应用于临床样本的检测。

重组人甲状旁腺素类似物PTH(1-34)在大鼠体内药动学研究

目的:研究大鼠scPTH(1-34)的药动学特征。方法:用125I标记PTH(1-34)示踪法对大鼠scPTH(1-34)后的血清药物浓度进行了测定,并用3P97程序拟和分析并计算药动学参数,采用超滤离心的方法进行药物与血浆蛋白结合率的研究。结果:大鼠scPTH(1-34)10、20和40μg/kg后,药物消除符合一房室模型。平均t1/2ke为(0.92±0.04)h;平均CL为(0.56±0.05)L/(kg.h);Cmax和AUC0-8h均与剂量呈线性正相关,不同剂量药物与血浆蛋白平均结合率为13.4%。结论:大鼠scPTH(1-34)后,药物消除符合线性动力学特征。

重组人甲状旁腺素rh-PTH(1-34)结构类似物纯度的质量研究

目的:对重组人甲状旁腺素rh-PTH(1-34)结构类似物(以下简称rhPTH′)的纯度进行质量控制,为其生产工艺提供实验室研究依据。方法:采用聚丙烯酰胺小肽凝胶电泳(SDS-PAGE)、等电聚焦电泳(IFE)、氨基酸组成分析和反相高效液相色谱法(RP-HPLC)对制备的rhPTH′的纯度等进行质量鉴定,并配合质谱法测定样品的精确相对分子质量。结果:经鉴定酸水解后目的蛋白纯度为89.2%;离子交换层析后样品纯度经电泳和HPLC鉴定分别为100%和94.9%;样品等电点为9.05,与理论值基本一致;氨基酸组成与理论组成相同,质谱鉴定相对分子质量为4663.76,与理论值4664.01相差0.25。结论:用现有生产和纯化工艺制备的rhPTH′具有较高的纯度,质量符合要求。

HPLC法测定甲状旁腺激素(1-34)原料药的含量

目的:建立以高效液相色谱法测定甲状旁腺激素(1-34)原料药含量的方法。方法:色谱柱为Spherisorb ODS;流动相A为甲醇,流动相B为0.05mo·lL-1 Na2SO4水溶液(磷酸调节至pH2.5),A∶B=30∶70;流速为1.0mL·min-1;检测波长为215nm;柱温为室温;进样量为20μL。结果:甲状旁腺激素(1-34)检测浓度线性范围为0.06～0.90mg·mL-1(r=0.99997),平均回收率98.6%,RSD=0.15%。结论:本方法简便、准确、灵敏度高,可用于甲状旁腺激素(1-34)原料药含量的测定。

HPLC法测定甲状旁腺激素1-34原料药中有关物质的含量

目的:建立测定甲状旁腺激素1-34原料药中有关物质含量的方法。方法:采用高效液相色谱法。色谱柱为Kromasil C18,流动相为0.05mo·lL-1氯化钾水溶液(磷酸调节pH至4.5)-乙腈=75∶25,流速为1.0mL·min-1,检测波长为210nm,柱温为室温,进样量为20μL;以主成分自身对照法计算有关物质的含量。结果:甲状旁腺激素1-34与杂质能完全分离,其有关物质检测浓度线性范围为5～50μg·mL-1(r=0.99996);3批样品中有关物质含量均小于0.29%。结论:所建立的方法简便、准确、灵敏度高、专属性强,可用于甲状旁腺激素1-34原料药中有关物质的含量测定。

术后甲状旁腺功能减退内科治疗

术后甲状旁腺功能减退(简称甲旁减)是与外科关系最为密切的甲状旁腺功能异常性疾病,以血钙和甲状旁腺素(PTH)降低为特征性改变。永久性甲旁减需要长期内科治疗。传统的治疗方法主要是应用钙剂和维生素D制剂。随着PTH类药物的研发问世,未来有望实现对术后甲旁减的PTH替代治疗。

不同性质抗骨质疏松药物对大鼠骨质疏松性骨折的影响

目的探讨和比较甲状旁腺激素1-34、阿仑膦酸钠、辛伐他汀对卵巢切除大鼠骨折愈合的作用。方法 3月龄SD大鼠40只,随机分为5组,每组8只,除假手术组外,其余大鼠接受双侧卵巢切除术,术后3个月建立股骨骨折模型,并于术后分别给予双蒸水(安慰剂组)、甲状旁腺激素1-34,20μg/kg,5d/周(甲状旁腺激素组)、阿仑膦酸钠70μg/(kg·周)(磷酸钠组)、辛伐他汀5mg/(kg·d)(辛伐他汀组),单纯骨折组不给予药物处理。6周后处死大鼠,双能X线法检测大鼠骨折侧股骨中段骨密度,CR摄片及评分评估骨折愈合情况,三点弯曲试验分析骨折部位最大载荷。结果股骨中段骨密度单纯骨折组显著高于其余四组,甲状旁腺激素组显著高于安慰剂组、辛伐他汀组和磷酸钠组(P<0.05);CR摄片单纯骨折组组、甲状旁腺激素组骨折愈合情况优于其余三组;CR评分甲状旁腺激素组与单纯骨折组显著高于其余三组(P<0.05),其余组间差异无统计学意义;生物力学检测各组最大载荷由高到低为单纯骨折组、甲状旁腺激素组显著高于其余三组(P<0.05),其余组间差异无统计学意义。结论在本研究采用的剂量和干预周期下,仅有甲状旁腺激素1-34能显著促进骨质疏松大鼠骨折愈合。