PTHLH基因对水牛卵泡颗粒细胞活性的影响及其分子调控机制的初步研究

试验旨在探讨PTHLH基因过表达对水牛卵泡颗粒细胞活性的影响,以及PTHLH基因对增殖、表观修饰和多能性相关基因表达模式的调控作用,为理解卵泡颗粒细胞和卵泡发育的分子调控机制提供新的视角。采用脂质体转染法将PTHLH基因过表达载体转染到水牛卵泡颗粒细胞中;利用MTT细胞活性检测试剂测定细胞活性;用STRING在线分析PTHLH及相关蛋白的互作网络;用qRT-PCR检测转染后水牛卵泡颗粒细胞中增殖、表观修饰和多能性相关基因的表达情况,分析PTHLH基因过表达对水牛卵泡颗粒细胞相关基因表达的影响。结果显示,PTHLH基因过表达极显著降低了水牛卵泡颗粒细胞的活性(P<0.0001);过表达组细胞中增殖相关基因(CCNB1、CCND1、CDKN1B、CDKN1A和CDK2)的表达极显著下调(P<0.0001);甲基化相关基因DNMT1和羟甲基化相关基因TET3的表达极显著下调(P<0.001或P<0.01),甲基化相关基因DNMT3B和IDH1的表达显著下调(P<0.05),而羟甲基化相关基因TET1和TET2的表达显著上调(P<0.05);乙酰化相关基因(HDAC1、HDAC2、HAT1、P300和CBP)的表达极显著下调(P<0.001或P<0.0001);与此同时,多能性相关基因OCT4和SOX2的表达极显著上调(P<0.01或P<0.001),而NANOG基因的表达极显著下调(P<0.01)。综上,PTHLH基因过表达抑制了水牛卵泡颗粒细胞的细胞活性,对增殖相关基因(CCNB1、CCND1、CDKN1B、CDKN1A和CDK2)、甲基化相关基因DNMT1与羟甲基化相关基因TET3、乙酰化相关基因(HDAC1、HDAC2、HAT1、P300和CBP)和多能性相关基因NANOG的表达具有负调控作用,而对羟甲基化相关基因TET1和TET2,以及多能性相关基因OCT4和SOX2的表达具有正调控作用。

水牛PTHLH基因克隆分析及其真核表达载体构建

为揭示甲状旁腺激素样激素(parathyroid hormone-like hormone,PTHLH)基因对水牛繁殖性能的影响,本研究对水牛PTHLH基因进行克隆,并对其核苷酸和氨基酸序列进行生物信息学分析。以牛PTHLH基因为种子序列(GenBank登录号:NM_001290949),应用CE Design软件设计引物序列,运用PCR扩增和测序技术获得水牛完整编码区序列,使用DNAMAN、ProtParam、SOPMA、PSORTⅡPrediction等在线软件分析PTHLH蛋白的一级结构、二级结构、三级结构与理化性质,并进行同源性比对分析及系统进化树构建。结果显示,试验克隆了水牛PTHLH基因完整编码区序列,该序列长为534bp,可编码177个氨基酸。水牛PTHLH基因编码区核苷酸序列与黄牛、猪、马、山羊、绵羊和骆驼的同源性分别为98.3%、90.4%、90.1%、98.1%、97.5%和89.2%,物种之间同源性较高,系统进化树分析结果与其亲缘关系远近一致,表明水牛PTHLH基因编码区在进化过程中比较保守。蛋白理化性质分析显示,水牛PTHLH蛋白分子式为C895H1451N271O266S2,分子质量为2 885u,半衰期为30h,理论等电点(pI)为10.00,水溶液在280nm处的消光系数为23 950,肽链N端为蛋氨酸(Met),不稳定系数为60.04,属于碱性不稳定蛋白;脂肪系数为72.15,总平均亲水性为-0.928,该蛋白属于不可溶性蛋白,亚细胞定位于细胞核、细胞质和线粒体。结构域预测结果显示,水牛PTHLH蛋白包含有1个PTH区域,同时还包含有1个低复杂度区域。二级结构分析显示,水牛PTHLH蛋白包含83个α-螺旋(46.89%)、17个延伸链(9.60%)、10个β-转角(5.66%)和67个无规则卷曲(37.85%),与三级结构预测结果相一致。试验构建了PTHLH基因真核表达载体pcDNA3.1-PTHLH,并通过电泳和测序验证了载体的准确性。PTHLH基因的成功克隆及其真核表达载体的成功构建为今后研究水牛PTHLH基因的功能和遗传特性提供了材料。

肺鳞状细胞癌中PTHLH基因表达与抗肿瘤免疫的相关性研究

目的:分析甲状旁腺激素样激素(PTHLH)基因与肺鳞状细胞癌(LSCC)患者预后及其与肿瘤微环境(TME)免疫细胞浸润的相关性。方法:通过UALCAN、TIMER、c Bio Portal数据库在泛癌水平分析PTHLH在泛癌中的表达情况,运用KaplanMeier Plotter数据库分析PTHLH在LSCC中的表达及其与患者的预后关联。选用2017年1月至2020年12月在甘肃省肿瘤医院手术切除的24例LSCC患者的癌及癌旁组织标本,用qPCR和WB法分别检测LSCC组织中PTHLH mRNA和蛋白的表达,用qPCR法检测各种趋化因子和MHC分子的表达水平。采用TIMER数据库联合CIBERSORT反卷积法分析PTHLH基因表达和LSCC的TME中免疫细胞浸润的关系。结果:LSCC组织中PTHLH mRNA和蛋白的表达水平均显著高于癌旁组织(均P<0.05),且PTHLH高表达LSCC患者的OS明显缩短(P<0.01)。PTHLH的表达与LSCC患者TME密切相关(P<0.01)。PTHLH的表达与B细胞、CD8~+T细胞、CD4~+T细胞、中性粒细胞和DC等免疫浸润呈显著负相关(r=-0.142、-0.123、-0.224、-0.166、-0.213,均P<0.01)。PTHLH高表达抑制趋化因子、MHC分子的表达,从而抑制炎症反应、免疫浸润、抗肿瘤免疫反应等。PTHLH的表达与免疫检查点分子CTLA-4、PDCD1、TIGIT呈负相关(r=-0.340、-0.441、-0.38,均P<0.01)。结论:PTHLH与肿瘤免疫抑制相关,有望成为预测LSCC患者预后和免疫治疗效果的潜在生物标志物。

PTHLH在鼻咽癌细胞系及组织中表达上调

目的检测PTHLH在鼻咽癌细胞系及组织中的表达水平,从理论上初步探讨其在鼻咽癌发生发展过程中所起的作用。方法实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测PTHLH在7个鼻咽癌细胞系的表达情况,RT-PCR检测PTHLH在鼻咽癌及非癌鼻咽组织中的表达,免疫组化鉴定其在鼻咽癌及鼻咽上皮组织中蛋白水平的表达。结果PTHLH在鼻咽癌细胞系中的表达上调,以HONE1细胞中表达最高。RT-PCR分析显示PTHLH mRNA在鼻咽癌组织中表达明显上调(61.1%),免疫组化检测鼻咽癌石蜡标本(49例)发现,PTHLH蛋白在鼻咽癌组织中表达明显高于鼻咽上皮组织(12例)(P<0.001)。结论PTHLH基因在鼻咽癌细胞及组织中表达增高,提示其可能参与了鼻咽癌的发生发展,有望成为分子生物学诊断的靶点。

甲状旁腺激素相关蛋白基因mRNA在口腔鳞癌及正常黏膜中的表达及意义

目的探讨甲状旁腺激素相关蛋白基因(parathyroid hormone-like hormone,PTHLH)mRNA在口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)黏膜及正常口腔黏膜中的表达及意义。方法选取30例OSCC患者,逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-PCR,RT-PCR)方法检测肿瘤组织和自身对照正常口腔黏膜中PTHLH mRNA的表达,SAS6.12统计软件进行χ2检验和t检验。结果PTHLH mRNA在OSCC黏膜和自身对照正常黏膜中表达的阳性率分别为83.0%和36.7%,差异有统计学意义(χ2=11.74,P<0.001)。PTHLH mRNA在OSCC黏膜和自身对照正常黏膜中的表达水平分别为2.38±0.15和0.74±0.10,上调3.02倍,差异有统计学意义(t=49.83,P<0.01)。PTHLH mRNA在OSCC中表达上调与肿瘤临床分期(t=1.60)、病理分化程度(t=1.95)、是否发生颈淋巴结转移(t=1.73)无关,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论OSCC癌变过程中PTHLH mRNA表达水平显著上调,PTHLH基因可能是OSCC的1个靶基因,在OSCC分类诊断中有应用价值。

一个短指症E2型伴肥胖症家系的致病基因鉴定及遗传学分析

目的鉴定1个短指症伴肥胖症家系的致病基因,为遗传咨询和产前诊断提供依据。方法先证者为郑州大学附属儿童医院内分泌遗传代谢科收治的1例临床和X线片初诊为短指症E2型伴肥胖症患儿,应用外显子捕获结合二代测序技术对先证者致病基因筛查,采用Sanger测序方法对家系进行验证和遗传分析。结果先证者PTHLH基因第1外显子发现c.125A>C错义突变,导致谷氨酰胺变为脯氨酸(p.Gln42Pro)。该杂合突变在人类基因突变数据库未见报道,SIFT (0)和PolyPhen (0.999)程序评估其可能有害。Sanger测序结果与二代测序结果一致,证实先证者的c.125A>C杂合突变来自其母亲,其舅舅和妹妹也携带相同杂合突变,但其父亲该位点无突变。结论PTHLH基因c.125A>C错义突变可能是该家系致病突变位点。