导致云南马铃薯品种中甸红退化的PVX分离物提纯及鉴定

对引起云南马铃薯品种中甸红退化的病毒分离物进行了纯化 ,应用酶联免疫吸附测定 (ELISA)和免疫电镜技术 (ISEM )检测鉴定了分离纯化的病毒样品 ,鉴定为马铃薯X病毒 (PotatovirusX ,PVX)的分离株。经ELISA和ISEM复合检测筛选 ,用组织培养法得到了侵染中甸红的PVX分离物标准毒株。应用电镜技术检测了PVX在寄主植株中的分布 ,结果呈系统侵染。

利用RT-PCR快速检测马铃薯X病毒(PVX)

采用TR IZOL试剂盒和异硫氰酸胍法2种方法提取了带PVX马铃薯试管苗的总RNA。根据设计好的1对特异性引物,运用反转录PCR技术对提取的总RNA进行了体外扩增。结果表明,所用2种方法都能有效地提取马铃薯RNA,并适合于反转录合成病毒cDNA,得到了与预期大小相一致的720 bp片段,而对照未得到任何产物。但利用TR IZOL试剂盒进行RNA提取价格较贵,而异硫氰酸胍法所用试剂可自己配制,方法灵活,价格较TR IZOL试剂盒便宜。从而建立了经济简便的PVX RT-PCR检测体系,为PVX的防治、脱毒种薯和核心种苗的检测提供有效手段。

马铃薯Y病毒蚜传辅助成分介导PVX/PVY协生作用

构建了马铃薯Y病毒中国株系 (PVY C)蚜传辅助成分 (HC Pro)基因的正义、反义和缺失三种植物表达载体 ,通过农杆菌介导法转化烟草品种NC89。Southernblot分析表明 ,HC Pro基因及其突变体已经整合到烟草染色体中 ,Westernblot分析证明 ,正义HC Pro基因及其缺失突变体在转基因烟草中有表达产物。攻毒试验结果证明 ,转正义HC Pro基因及其缺失突变体不仅能够提高T1转基因烟草中PVY C的病毒积累和致病性 ,而且对异源病毒PVX具有同样的作用 ,而转反义HC Pro基因烟草对PVY C和PVX的致病性无影响。因此PVY CHC

重组黄瓜花叶病毒2b基因PVX侵染性载体的稳定性分析

本研究利用北京甘蓝CMV分离物(CMV-BG)全长2b基因,构建了含其正义和反义序列的PVX侵染性载体pVX2bS和pVX2bAS,并进行了它们与PVX侵染性载体间的共侵染稳定性实验。结果表明:pVX2bS和pVX2bAS能侵染本氏烟、SR1、Sam sun NN烟草、Shepody马铃薯和中蔬5号番茄,与pSfinx相比,表现不同程度的症状延迟效应;pVX2bS和pVX2bAS在22℃/16℃(昼/夜温度)条件下,接种SR1烟草45d仍可检测到重组载体的存在;pVX2bS和pVX2bAS菌液混合接种15d后只能检测到正义或反义一种载体的随机表达,二者交互接种,后接种的一方不能表达。

PVX介导拟南芥Flowering locusT诱导烟草开花研究

为研究拟南芥Flowering locus T(FT)基因在开花诱导过程中的重要生物功能,本研究用RT-PCR方法,从拟南芥野生型(WS)中得到全长FT序列,采用Potato Virus X(PVX)野生型病毒构建载体,将全长FT基因连接到PVX第5个阅读框架即Coat Protein(CP)编码序列之前,经体外转录成PVX-FT病毒RNA,人工感染短日照烟草Maryland mommath,成功诱导短日照烟草在长日照条件下开花。

amiRNA介导的兼抗PVX、PVY、PSTVd马铃薯植株获得及抗性鉴定

为获得兼抗多种病毒(类病毒)的马铃薯植株,分别克隆了靶向PVX、PVY和PSTVd蛋白的P25、HC-Pro和Virp1基因,以拟南芥pre-miR159a为骨架设计了针对P25、HC-Pro和Virp1基因的amiRNA序列,通过Overlapping PCR将3个amiRNA片段连接,并导入植物双元表达载体pCAMBIA1300-221,构建植物表达载体p1300-221-pre-amiR-P25-HCPro-Virp1,经PCR及酶切验证,表达载体构建正确。农杆菌介导法将含目的基因质粒菌液侵染马铃薯品种费乌瑞它脱毒微型薯片,经再生、压力筛选,抗性植株分化及植株壮苗共获得转化株系15株,PCR检测结果表明,其中10株检测到与目的基因大小一致的片段(729 bp)。qRT-PCR结果显示,外源amiR-P25-HCPro-Virp1基因在10个转化植株中均有表达,相对表达量在7.68~21.37。对T0阳性转化植株的攻毒试验,将PVX、PVY和PSTVd病毒等量混合液摩擦接种至6~8叶期的植株叶片,20 d后观察发现,对照植株感病严重,出现植株矮小、叶片斑驳等症状,而转化植株未表现出感病症状,生长正常。RT-PCR进行病毒特异性检测,结果显示,转化植株中也未检测到病毒序列,这表明转amiR-P25-HCPro-Virp在转化植株中能稳定表达,转化植株能够兼抗PVX、PVY和PVSTd 3种病毒(类病毒)。得到了同时兼抗PVX、PVY和PVSTd转化植株,且抗性显著,为马铃薯抗病毒育种提供了新的遗传资源。

利用PCR对PVX外壳蛋白基因进行同义密码子修饰

利用聚合酶链式反应 (PolymeraseChainReaction ,PCR)与限制性内切酶相结合的方法 ,设计 4条含有限制性酶切位点和相应突变的引物。以马铃薯X病毒 (PotatoVirusX ,PVX)外壳蛋白cp基因为模板 ,扩增出相应的片段 ,相应酶切后通过三片段连接构建到克隆载体pBlueKS(+/ - )上。随机挑选重组子测序表明 ,利用三片段拼接成功地在PVX外壳蛋白基因的不同部位产生了突变。实验结果说明利用三片段接可以大大提高筛选得到突变子的效率 ,从而节省人力、物力和时间。

应用Dot-ELISA检测PVX、PVY和PVS

以NCM为固相载体、应用间接ELISA法测定了纯化的PVX、PVY和PVS;对接种的烟草,马铃薯块茎的芽、休眠块茎顶端的PVX、PVY和PVS也分别进行了测定。结果表明检测纯病毒PVX、PVY和PVS的灵敏度分别为2.76pg、2.835pg和5.831pg。检测感病烟草汁液马铃薯块茎芽、休眠块茎顶端的稀释度PVX分别为:1/20480～1/81920、1/20480和1/5120;PVY分别为1/81920、1/20480和1/5120;PVS分别为1/81920～1/327680、1/20480～1/81920和1/5120～1/20480。和Cocktail-ELLSA相比,检测PVX和PVY的灵敏度提高至少16倍。实验结果表明,Dot-ELISA是检测PVX、PVY和PVS灵敏而有效的方法。

马铃薯X病毒外壳蛋白基因片段的瞬时表达诱导对PVX的高抗性(英文)

为获得抗马铃薯X病毒(PVX)的植株,从疑似感染马铃薯X病毒的马铃薯叶片中提取出PVXcp cDNA,将其保守片段插入到RNAi质粒pHellsgate12中以构建编码发夹结构RNA的载体,通过Agroinfiltration的方法在本氏烟植株中瞬时表达。结果表明:病毒侵染10d后,15株引入该载体的本氏烟植株对PVX均具有抗性,此载体可用于产生对马铃薯X病毒具有高抗性的转基因植物。

河南疑似烟草PVX的病原种类鉴定及田间发生规律

采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术和多点田间试验调查的方法,研究了河南疑似烟草PVX的病原种类及田间发生规律。结果表明,河南疑似烟草PVX的病原种类为马铃薯Y病毒;移栽后10～20d发生较轻且发展缓慢,20～60d发生较重且发展迅速,60d以后病情趋于稳定;中烟100和云烟87品种的抗性无显著差异,且均显著低于NC89。

华盛顿大学等开发抗CMV、AIMV、PVX的重组植物

美国华盛顿大学(密苏里州圣路易丝)生物学部的Roger.N.Beachy与孟山都公司共同导入植物病毒的外壳蛋白基因,分别成功地培育出抗病毒的植物。该小组已用这种方法培育出抗烟草花叶病毒(TMV)的烟草、番茄。其中番茄已开始了野外试验。这次把应用范围扩大到TMV以外,所以这种方法应用范围很广,而且实验证明能应用于抗病毒。

TFT-LCD产业中PVX OPEN不良改善研究

通过对TFT-LCD制造中PHOTO工艺PVX OPEN不良产生机理的研究,提出改善PVX OPEN不良的方法。分析表明PVX OPEN不良主要成因为PR胶涂布前细菌粘附在玻璃基板上,曝光显影后造成PR胶破洞,PVX刻蚀工序完成后形成对应位置PVX OPEN;通过改善生产气流及定期清理细菌等措施,PVX OPEN发生率由最初的6%以上降低到0.5%以下,且改善周期可持续2个月以上。

天然抑制剂对 PVX 和 PVY^n 的抑制作用

实验结果表明:石竹目叶子花、紫茉莉和商陆属叶浆可抑制 PVX 和 PV^n对植物的单独感染或交互感染.苋色藜仅对 PVX 有抑制,血苋也仅对 PV^n有抑制作用。

高分子絮凝剂PVX对重金属的絮凝研究

研究了高分子絮凝剂PVX(聚乙烯醇黄原酸钠),对含铅、镉、锌离子废水的絮凝性能,并在pH=6的条件下,对影响处理性能的因素(Ca^(2+)和Mg^(2+))进行探讨.研究结果表明:PVX在用量分别为40,70和100mg/L时,对1000mg/L的含Pb^(2+),Cd^(2+)和Zn^(2+)水样的最高去除率均可达到99.9%;Ca^(2+)和Mg^(2+)的存在,对Pb^(2+)和Cd^(2+)的絮凝起促进作用;少量的Ca^(2+)和Mg^(2+)对Zn^(2+)的絮凝起促进作用,但大量的Ca^(2+)和Mg^(2+)对Zn^(2+)的絮凝效果降低.

大麦黄矮病毒运动蛋白核定位信号对PVX病毒运动的影响

应用马铃薯X病毒(PVX)载体研究大麦黄矮病毒运动蛋白(BYDV-MP)核定位信号对PVX病毒运动的影响。我们将BYDV-MP克隆到PVX改造载体pGR107中,同时用GFP作为指示蛋白,研究BYDV-MP对异源病毒PVX系统运动的影响。侵染烟草发现BYDV-MP能够在PVX载体中表达并能加强病毒的系统侵染;将PVX编码系统运动蛋白25kD基因进行缺失突变,重复上述试验发现BYDV-MP能够补偿PVX系统运动;将BYDV-MP的N端的第五、六位氨基酸和第七位氨基酸进行替换突变,侵染烟草发现BYDV-MP的N端的第五、六位氨基酸突变不能完全抑制PVX系统运动,但是可以延迟并减弱PVX系统运动;BYDV-MP的N端的第七位氨基酸突变能够完全抑制PVX系统运动。

木尔坦棉花曲叶病毒V2蛋白N端保守脯氨酸对病毒致病性的影响

木尔坦棉花曲叶病毒(CLCuMuV)是棉花曲叶病的主要病原之一,其V2蛋白在病毒致病过程中起重要作用。本研究对V2蛋白N端第4位脯氨酸在病毒致病过程中的作用进行了分析。通过构建马铃薯X病毒(PVX)异源表达载体(PVX-V2、PVX-V2^(P4A)),利用农杆菌介导的方法接种于本氏烟发现,PVX-V2能够增强PVX异源病毒的致病性,致使PVX在植物体内复制量增加,而PVX-V2^(P4A)对PVX异源病毒致病性的影响相对较小。通过构建V2基因突变体(ΔV2、V2^(P4A))侵染性克隆,利用农杆菌介导的方法接种于本氏烟发现,ΔV2、V2^(P4A)侵染性克隆引起的症状较野生型更弱。结果表明,CLCuMuV V2蛋白N端第4位脯氨酸在病毒侵染过程中起重要作用。

超低温保存法去除马铃薯X病毒和马铃薯纺锤块茎类病毒

病毒病严重危害马铃薯生产,是造成马铃薯减产和品质下降的主要因素。PVX和PSTVd属于危害马铃薯最主要的病毒。本文尝试用超低温保存法和常规方法(茎尖分生组织培养、温热疗法以及温热疗法结合茎尖分生组织培养)来去除马铃薯试管苗中的PSTVd和PVX。结果显示马铃薯茎尖经过超低温保存后,存活率和成苗率分别为83.64%和72.04%,高于茎尖分生组织培养(46.67%和31.49%)、温热疗法(72.22%和44.44%)以及温热疗法结合茎尖分生组织培养(50.54%和30.38%)。4种方法都可以去除PVX,其中超低温保存法的脱毒率最高,为59.13%,温热疗法结合茎尖分生组织培养为56.02%,温热疗法和茎尖分生组织培养较低,为42.61%和35.83%。但是4种方法都未能有效地去除PSTVd类病毒,只能通过严格检疫来控制。

瞬时表达比较马铃薯X病毒CP基因3种结构对RNA沉默的诱导效果

RNA沉默是植物抵御病毒侵染的一种防卫机制,病原来源的抗性(pathogen-derived resistance,PDR)被认为是通过RNA沉默起作用的.转化的核酸片段在基因组中的位置、长短和不同排列结构等均影响RNA沉默的效率.用全长马铃薯X病毒(PVX)CP基因构建非翻译的正义、反义和反向重复结构转基因的植物表达载体,通过农杆菌渗入法瞬时表达测试了这些转基因对RNA介导抗性的诱导效率和有效性.结果表明,反向重复的PVXCP是更为有效的RNA沉默诱导因子,同时也证明让目的基因在受试植物中瞬时表达,在转化植物之前能比较快速地检测转基因的表达情况以及表达产物的功能,从而节约时间和资源,并减少盲目性.

利用病毒载体在烟草中瞬时表达融合HBsAg基因

利用马铃薯PVX病毒载体构建了外源人工融合乙肝表面抗原HBsAg基因的表达载体,在烟草中利用农杆菌介导进行瞬时表达,以快速鉴定外源基因瞬时表达的状况以及重组蛋白的免疫活性。利用PCR技术从含有人工融合HBsAg基因的表达载体中分别扩增出LP+PreS1+PreS2+S、PreS1+PreS2+S、PreS2+S序列,将其分别与PVX病毒载体pgR106连接,构建成PVX-LP、PVX-S1和PVX-S2等3个转化载体,并将此载体导入农杆菌菌株GV3101中用于侵染烟草植株叶片。感染植株经RT-PCR、RNA Dot blotting和HBsAg蛋白的ELISA检测显示,3个人工融合的HBsAg基因均可在植物体内得到转录,翻译成具有活性的蛋白。结果表明,外源融合HB-sAg基因经过植物病毒载体瞬时表达系统可以在植物系统中正常转录和翻译。

马铃薯六种主要病毒通用RT-PCR检测体系的建立

马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)、马铃薯M病毒(PVM)和马铃薯A病毒(PVA)是马铃薯生产田中发生率较高、危害较严重的病毒,因此,建立特异性强、灵敏度高、检测速度快的RT-PCR分子检测体系对保障马铃薯种薯质量具有非常重要的意义。试验筛选了6种病毒的特异引物、优化了PCR部分的试剂以及确定了退火温度。结果表明,当Mg2+浓度为2.6 mmol/L、d NTPs浓度为0.1 mmol/L、Taq DNA聚合酶浓度为0.03 U/μL,以及退火温度为55.5℃时反应体系最稳定。最终,建立了一套通用RT-PCR检测体系,只需要变换每种病毒的引物,就可以实现对PVX、PVY、PVS、PLRV、PVM和PVA病毒的RT-PCR检测。每种病毒检测灵敏度均能达到pg以上。