修饰的ORF5基因增强猪繁殖与呼吸综合征DNA疫苗的体液免疫

为了提高猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) ORF5基因 DNA疫苗的免疫效力 ,将通用型辅助性 T淋巴细胞表位 (PADRE)插入 ORF5的中和表位和覆盖表位间 ,获得修饰后的 ORF5基因 ORF5 M。在此基础上 ,进一步构建了ORF5 M的真核表达质粒 p CI- 5 2 M。间接免疫荧光证实体外表达后 ,免疫 BAL B/c小鼠 ,检测免疫后的 EL ISA抗体和中和抗体 ,并与未经修饰的 ORF5基因真核表达质粒 p CI- 5 2进行比较。结果表明 ,修饰后的 DNA疫苗 p CI- 5 2 M诱导的 EL ISA抗体和中和抗体均明显优于未经修饰的 DNA疫苗 p CI- 5 2 ,是一种具有良好开发前景的

Hsp65与HBV多表位融合基因的表达及其免疫应答研究

目的用基因工程的方法构建并表达一种由Hsp65、通用辅助T细胞表位(PADRE)和HBV表面抗原与核心抗原的多个表位组成的乙型肝炎治疗性疫苗(简称为Hsp65-HBV)。方法采用PCR方法人工合成由PADRE和HBV的多个表位组成的基因片段,将此片段克隆入原核表达质粒pET28a/Hsp65后,利用大肠杆菌进行融合蛋白的表达。用纯化后的蛋白免疫Balb/c小鼠。将小鼠脾细胞用HBsAg装载的P815细胞在体外刺激5d后,用流式细胞仪检测IFN-γ+细胞的频率。用ELISA方法检测小鼠血清中的特异性抗体(IgG1和IgG2a)的产生。结果由Hsp65、通用辅助T细胞表位(PADRE)和HBV的多个表位组成的融合蛋白能在大肠杆菌中进行高水平的表达,能诱导小鼠产生IgG2a亚型的特异性抗体,并能诱导HBV特异性的IFN-γ+的淋巴细胞的产生。结论获得了大肠杆菌表达的由Hsp65、通用辅助T细胞表位(PADRE)和HBV的多个表位组成的融合蛋白,并能被机体以MHC-Ⅰ途径递呈,为检测本融合蛋白是否能激发出HBV特异性CTL反应奠定了基础。

水牛奶中β-乳球蛋白过敏原表位定位的初步研究

为绘制水牛奶中β-乳球蛋白的过敏原表位,本实验以兔抗水牛乳β-乳球蛋白的抗体IgG为固相筛选分子,免疫筛选噬菌体随机七肽库,采用间接ELISA和竞争抑制ELISA鉴定阳性克隆。经四轮富集后,得到16个阳性克隆子,进行测序,得到5个不同的肽段。与已知的表位比对,初步确定了六个IgG识别表位,分别为:第41～51位(VYVEELKPIPE)、第51～64位(EGDLEILLQKWENDE)、第81～96位(VFKIDALNE NKVLVLD)、第141～56位(KALPMHIRLSFNPTQL)、第127～136位(LNENKVLVLD)和第145～159位(MHIRLSFNPTQLEEQ)。

共表达PRRSVGP5蛋白和CSFV E2蛋白的“自杀性”DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答

为了获得新型双价"自杀性"DNA疫苗,将猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5基因克隆于此前构建的表达猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)E2基因的甲病毒复制子载体疫苗pSFV1CS-E2中。为了增强免疫效果,在密码子优化的GP5基因中插入了泛DR表位(PADRE),在CSFV E2基因后融合伪狂犬病病毒(PrV)UL49基因,获得了6种重组质粒。间接免疫荧光试验显示,PRRSV GP5和CSFV E2基因在瞬时转染的293T细胞中得到同时表达。将6种重组质粒和空载体pSFV1CS分别免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA方法检测血清抗体水平,通过基于CSFE/WST-8的淋巴细胞增殖试验和细胞因子ELISA评价疫苗诱导的细胞免疫。结果显示,除pSFV1CS组外,从各疫苗组小鼠血清中均可检测到低水平的针对GP5和E2蛋白的抗体;各疫苗组小鼠脾细胞经CSFV和PRRSV刺激后均能诱导特异性的淋巴细胞增殖;部分疫苗组小鼠脾细胞经CSFV和PRRSV刺激后可分泌较高水平的IFN-γ和IL-4;引入UL49的疫苗组细胞免疫应答显著高于其它疫苗组。结果表明,这些共表达GP5和E2蛋白的自杀性DNA疫苗可以诱导体液免疫和细胞免疫,PrV UL49可以增强其细胞免疫应答。

噬菌体展示随机十肽库的构建及抗WSSV单链抗体A1的模拟抗原表位的淘选和鉴定

本实验以pCANTAB5E噬菌粒为载体,成功构建了较高容量的噬菌体展示随机十肽库,并将其应用于抗原模拟表位的淘选和鉴定。将一种特异识别对虾白斑综合症病毒(Whitespotsyndromevirus,WSSV)的单链抗体A1对十肽库和十五肽库分别进行淘选,结果得到一系列能与单链抗体A1特异性结合的阳性克隆。将这些阳性克隆所编码的多肽氨基酸序列与已知的单链抗体A1的抗原WSSV388片段氨基酸序列做比对,发现多数阳性多肽序列都与WSSV388片段序列的C端一处K????R??R?QS的氨基酸片段相似,由此推论单链抗体A1的模拟抗原表位可能是由该不连续氨基酸片段所构成的构象表位,而非线性表位。研究结果表明,噬菌体展示随机肽库技术是一种用于研究抗原表位结构的有效方法,有助于进一步探讨WSSV的结构蛋白的构象及功能,以及相应单链抗体与细胞受体相互作用的机理。

分子模拟在门冬酰胺酶Ⅱ表面呈现多肽技术中的应用(英文)

简要地介绍了表面呈现技术和组合酶技术的应用以及发展前景,描述了一种应用分子建模系统辅助进行抗动脉粥样硬化的嵌合酶疫苗的构建过程。门冬酰胺酶活力测定结果证明,嵌合酶的空间结构和活性位点均能够依照设计要求保留。提供了一种生物信息学手段在组合生物合成领域中的应用方法。

T辅助细胞在疫苗研制中的作用(英文)

发展感染性疾病疫苗之关键挑战在于利用确定的抗原以刺激产生能引起保护作用的合适的免疫反应。肽类疫苗的运用得到了极大的关注 ,其意义在于 ,已知不同的多表位构成单一结构以诱导出所希望的免疫反应所表现出的灵活性。这一般比利用减毒的活疫苗要安全并且相对而言比制造亚单位疫苗要容易。然而 ,多肽疫苗的发展面临巨大挑战。这一方法在诱导遗传背景复杂的人群免疫反应方面受到限制 ,这与主要组织相溶性复合物 (MHC)多态性有关。因同样的理由 ,肽类免疫应答常因缺乏适当的辅助T淋巴细胞 (HTL)而引导出不充分的细胞毒素T淋巴细胞 (CTL)和抗体反应。另一个运用线性肽链结构的可能缺点是 :为了引导出合适抗体反应 ,表面免疫球蛋白受体簇对于激活静息的B细胞就成为必须因素。由MHC多肽性引起的问题可由运用不加区别的T细胞表位来解决。从麻疹病毒F蛋白 (氨基酸 2 88到 30 2 )中得到的不加区别的T细胞表位和鼠的确定结合在多种MHC分子上的辅助T细胞表位 (V1EB ,aa 191- 2 0 9)已被定性并且被用于能极大激发免疫应答的结构中 ,以克服单一限制型免疫应答的缺陷。合成的 ,非自然PanDR表位 (PADRE)具有退化的结合几种通常HLA DR的能力 ,能以绝对效价和抗体反应质量两种形式来增强激发短肽链的免疫应答。另外 ,?

扎伊尔埃博拉病毒糖蛋白泛MHC Ⅱ限制性表位预测及验证

目的生物信息学预测获得埃博拉病毒(EBOV)糖蛋白泛主要组织相容性复合体Ⅱ(MHCⅡ)限制性优势表位,分析其特征并筛选鉴定可用于疫苗研制的候选对象。方法通过IEDB分析预测EBOV糖蛋白的优势表位,并对优势表位进行聚类分析,保守性分析和分子对接。同时,利用编码糖蛋白DNA的质粒pVAX-GP免疫小鼠,酶联免疫斑点试验(ELISpot)验证预测获得的表位。结果在构成人群覆盖率达99%的人类白细胞抗原Ⅱ(HLAⅡ)超家族限制性15表位肽预测中筛选获得19个优势表位,H-2筛选获得13个优势表位。ELISpot结果显示pVAX-GP可诱导小鼠脾细胞产生针对合成优势表位的细胞免疫反应,其中表位LFLRATTELRTFSIL和GYYSTTIRYQATGFG在C3H小鼠体内具有显著激活细胞免疫反应的效果。保守性分析结果中存在种间和种内均保守的优势表位,不存在种内不保守而种间保守的优势表位。分子对接显示实验鉴定的两条优势表位可在人HLAⅡ类超家族分子中均可获得良好的对接分数,进一步肯定其在人群免疫中应用的可行性。结论多肽LFLRATTELRTFSIL和GYYSTTIRYQATGFG可作为EBOV表位疫苗的候选表位。

T细胞表位对新型冠状病毒疫苗诱导抗体反应的影响

目的通过构建严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)S1蛋白与通用型辅助性T淋巴细胞表位(pan HLA DR-binding epitope,PADRE)融合的DNA疫苗,探讨PADRE对S1蛋白DNA疫苗诱导抗体水平的影响。方法以pJW4303质粒为载体分别构建表达S1蛋白的重组质粒(pJW4303-S1)、表达S1和PADRE融合蛋白的重组质粒(pJW4303-S1-PADRE)。以人源密码子优化的SARS-CoV-2刺突蛋白基因为模板设计引物,PCR扩增获得基因片段,并将其克隆入真核表达载体pJW4303。对pJW4303-S1、pJW4303-S1-PADRE进行PCR扩增和酶切,产物通过琼脂糖凝胶电泳验证,并将重组质粒进行测序。构建正确的质粒转染293T细胞,Western blot验证蛋白体外表达情况。以C57BL/6小鼠为实验动物并分组,采用不同的免疫接种策略进行动物免疫,每次免疫间隔2周,免疫前采血,第6次免疫2周后处死小鼠并采血。通过ELISA检测不同免疫策略诱导的针对SARS-CoV-2 S蛋白受体结合域(receptor binding domain,RBD)的特异性抗体水平及其亲和力指数。结果PCR扩增和酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果及质粒测序结果表明质粒构建成功;Western blot结果表明这2个质粒可以在体外稳定表达S1蛋白、S1融合PADRE蛋白;ELISA结果显示,pJW4303-S1、pJW4303-S1-PADRE单次免疫均可以诱导产生明显的针对RBD的抗体水平(P<0.0001,P=0.0034)。不同的免疫策略在进行6次免疫后,针对RBD的特异性抗体水平在各组间差异无统计学意义(P>0.05)。抗体亲和力检测结果显示,第6次免疫后不同免疫策略诱导的针对RBD的抗体亲和力指数差异也无统计学意义(P>0.05)。结论pJW4303-S1、pJW4303-S1-PADRE均具有较强的体液免疫原性,但PADRE不能进一步提高S1蛋白DNA疫苗的体液免疫原性。