“拔鸡腿”对三七入药部位氨基酸和三七素含量的表征效应

【目的】探明三七地上茎顶部茎段鸡腿状增粗(俗称“拔鸡腿”)对三七传统入药部位氨基酸和三七素含量的影响,为三七优质高产提供理论依据。【方法】采用茚三酮法和高效液相色谱法分别测定三七“非拔鸡腿”和“拔鸡腿”植株主根、侧根、根状茎和地下部器官的总游离氨基酸含量(TFAC)和三七素含量(DC);在此基础上采用方差分析法研究“拔鸡腿”对三七传统入药部位氨基酸和三七素含量的表征效应。【结果】与“非拔鸡腿”相比,2年生“拔鸡腿”主根的TFAC不显著偏低18.92%,根状茎和地下部器官的TFAC分别显著偏低31.06%和16.26%,侧根显著偏高14.26%;主根、侧根和地下部器官的DC分别极显著偏低33.87%、26.55%和17.97%,根状茎极显著偏高9.37%;3年生“拔鸡腿”主根的TFAC显著偏高13.90%,侧根、根状茎和地下部器官分别不显著偏低1.13%、14.32%和1.45%,主根和根状茎分别显著偏低9.96%和8.61%,侧根显著偏高18.14%,地下部器官不显著偏高0.37%;从2年生至3年生,“非拔鸡腿”和“拔鸡腿”侧根、根状茎和地下部器官的TFAC均下降,且后者较前者分别下降673.98%、-31.21%和-44.82%,二者主根的DC均上升,且后者较前者增加5.74倍。【结论】“拔鸡腿”表征着2年生侧根和3年生主根的TFAC较高,2年生根状茎和3年生侧根、地下部器官的DC较高,2年生至3年生时主根TFAC、主根、侧根和地下部器官的DC呈上升趋势;但2年生、3年生其余入药部位的TFAC和DC偏低,且2年生至3年生时各部位的TFAC和DC呈下降趋势。

多组学分析揭示三七镰刀菌属致病菌的生物学差异

镰刀菌属病原菌是三七根腐病的主要病原菌。为探究不同种镰刀菌之间产生生物学差异的机制,本研究结合多组学数据,对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporium)、层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)和腐皮镰刀菌(Fusarium solani)的生物学特性进行分析。采用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基培养菌株,同时对孢子萌发率、菌丝生长、孢子产量及致病力进行测定,并采用广泛靶向代谢组学和转录组学,对尖孢镰刀菌、层出镰刀菌和腐皮镰刀菌3种镰刀菌9个样本进行转录组高通量测序及代谢物分析,比较镰刀菌属不同种间的差异表达基因(DEGs)和差异代谢物(DAMs),并结合GO和KEGG数据库对DEGs和DAMs进行功能注释和代谢通路分析。结果显示,孢子萌发率表现为:尖孢镰刀菌<层出镰刀菌<腐皮镰刀菌;菌丝生长及孢子产量表现为:尖孢镰刀菌>层出镰刀菌>腐皮镰刀菌;致病力表现为:尖孢镰刀菌>腐皮镰刀菌>层出镰刀菌。DAMs分析结果表明,氨基酸类化合物是主要的差异代谢物,其成分和含量的差异是造成这3种镰刀菌生长差异的主要因素。转录组数据结果显示,不同种镰刀菌中的DEGs功能主要与核糖体和氧化磷酸化相关。本研究结果为三七镰刀菌属根腐病害的防控提供了理论依据。

外源茉莉酸对三七根系代谢物的影响及关键代谢物诱导三七抗病性分析

【目的】揭示叶部喷施茉莉酸(Jasmonic acid,JA)诱导三七根系的代谢变化,明确显著变化的代谢物,为三七病害的生物防治提供理论基础。【方法】以三七为试验材料,在叶部接种黑斑病菌(Alternaria panax)菌株SL17,于接种4和8 d时测定三七植株内源JA含量;于三七叶片外源喷施不同浓度的JA后,利用气相色谱—质谱联用仪(GC-MS)分析三七根系代谢物变化,并检测显著变化代谢物对主要根腐病菌的抑制活性及其灌根后诱导三七叶部抗黑斑病的效果。【结果】叶部接种黑斑病菌4 d时,三七叶部JA和茉莉酸亮氨酸螯合物(JA-ile)的含量增加而在根系减少;接种8 d时,叶部JA含量显著增加(P<0.05,下同),而根系中2种物质的含量均极显著增加(P<0.01)。外源喷施不同浓度JA后三七根系代谢变化测定结果显示,三七根系中共检测出125种代谢物,主要分为有机酸类、氨基酸类、酯类、糖类、胺类、核苷酸及其衍生物和酮类等,其中有机酸类、氨基酸类和糖类是根系代谢物中的主要成分。与对照相比,叶部施用JA后三七根系中的草酸和氢化乳清酸含量显著增加。进一步测定显著变化的差异代谢物功能发现,草酸和氢化乳清酸对三七主要根腐病菌具有一定的抑制活性,其中氢化乳清酸在浓度为0.001μg/mL时对茄腐镰刀菌(Fusarium solani)菌株F3和锈腐病菌(Ilyonectria destructans)菌株RS6的抑制效果最佳,浓度为0.010μg/mL时对锈腐病菌菌株RS8的抑制效果最佳,浓度为0.100μg/mL时对恶疫霉(Phytophthora cactorum)菌株D-6的抑制效果最佳;草酸浓度为0.001μg/mL时对菌株F3的抑制效果最佳,浓度为10.000μg/mL时对菌株D-6的抑制效果最佳;草酸和氢化乳清酸灌根后还能明显减小三七叶部黑斑病的病斑面积,且均在浓度10.000μg/mL时诱导抗病效果最佳。【结论】外源喷施JA可改变三七根系代谢,促进氢化乳清酸和草酸的积累,进而增强三七对黑斑病的抗性,并对三七主要根腐病菌具有一定的抑制活性。

三七悬浮细胞生物合成绿原酸类物质及其生物活性

利用三七(Panax notoginseng)悬浮细胞生物合成绿原酸类物质(CGAs),并对其生物活性进行了研究。对三七细胞中CGAs进行定性分析,优化了细胞培养条件以及6种诱导模式,测定了三七细胞CGAs的抗氧化及α-葡萄糖苷酶活性抑制能力。结果表明三七愈伤组织内含有4种CGAs;最优工艺条件为:B5+40 g/L蔗糖,pH 7.5,15%接种量;经30μmol/L茉莉酸甲酯诱导3 d后,CGAs产量(684.07 mg/L)比原工艺(475.18 mg/L)提高了0.44倍;三七细胞CGAs具有良好的抗氧化及α-葡萄糖苷酶活性抑制能力。

对羟基苯甲酸对三七黑斑病致病性因素的影响研究

[目的]探讨对羟基苯甲酸与三七黑斑病“病害三角”之间的互作影响,分析对羟基苯甲酸对病原真菌及其寄主植物在生理功能、抗病性和病原菌致病性上的影响。[方法]以三七一年生幼苗及三七黑斑病菌(Altemaria panax Whetzel)为试材,借助酶学分析技术,分别探讨4个不同浓度对羟基苯甲酸胁迫下三七-土壤-病原菌致病性生态因素的变化。[结果]不同浓度的对羟基苯甲酸对三七幼苗及病原菌的化感作用受到浓度效应的影响。在2.5~5.0 mmol/L浓度下,三七根系抗性酶活性会有短期内的增加,后逐渐降低,而高浓度(10.0 mmol/L)的胁迫下则明显下降;土壤酶活性的变化也有相同的趋势。三七黑斑病菌在2.5~5.0 mmol/L浓度下其果胶酶、纤维素酶均出现较高活性,说明在该浓度范围内病原菌生长情况及繁殖能力较好。[结论]对羟基苯甲酸与三七黑斑病发生的3个要素即寄主、土壤、病原菌三者之间存在化感浓度效应。

Determination of Amino Acids in Panax notoginseng by Microwave Hydrolysis and Derivatization Coupled with Capillary Zone Electrophoresis Detection

The microwave hydrolysis and derivatization coupled with capillary electrophoresis detection were developed for the separation and determination of the amino acids in Panax notoginseng. The experimental conditions for the microwave hydrolysis and derivatization were examined and optimized. Several parameters of capillary electrophoresis, such as pH value of background electrolyte, borate concentration and applied voltage were optimized Under the selected conditions, 11 amino acids were completely separated. The real sample was analyzed and the results were satisfactory. Compared with that of conventional heat hydrolysis and derivatization, the analytical time of this method was significantly shortened.

不同产地三七的氨基酸含量比较

目的:分析不同产地三七中氨基酸含量及其特征性。方法:采集15个不同产地的三七样品,采用日立835-50型高速氨基酸分析仪测定。结果:三七含有19种以上的氨基酸,其中精氨酸(Arg)、天门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)等三种含量最高,且排列次序不随产地的变化而变化;β-丙氨酸(β-Ala)和鸟氨酸(Orn)在三七中首次检测出。结论:不同产地三七中氨基酸含量有一定差异,精氨酸(Arg)、天门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)的含量及排列次序在三七上具有特征性。

三七抗肝纤维化的实验研究

目的探讨三七对四氯化碳(CCl4)中毒性肝纤维化的防治作用。方法复制大鼠CCl4 中毒性肝纤维化模型 ,并以秋水仙碱作为阳性治疗对照。采用光镜、电镜观察组织学改变 ,测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、白蛋白、球蛋白、透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、肝组织羟脯氨酸(Hyp)含量 ,以反映肝细胞损伤及肝纤维化程度。将形态改变与功能变化相结合 ,对比分析三七对CCl4 中毒性肝纤维化的防治作用。结果三七治疗后肝细胞损害、肝脏脂肪变性、炎细胞浸润的程度均较轻 ,成纤维细胞和胶原纤维增生亦较少。结论三七对肝细胞损伤有一定保护作用 ,并可明显抑制肝组织中成纤维细胞及胶原纤维增生 ,是较理想的防治肝纤维化的药物。

三七的超细粉碎研究

以中药三七为原料,水作溶剂,油酸作为表面活性剂,利用高速离心剪切式超细粉碎机对其进行湿式超细粉碎,成功制备了纳米三七液,并通过多种方式对其进行了粒度、显微组织形貌及其结构的表征,包括ZetaPALS粒度分析仪、光学显微镜、红外光谱、扫描电镜等方法。实验结果表明,利用高速离心剪切式超细粉碎可使颗粒尺寸达到50nm,且粉碎后药物的主要成分并没有破坏。

硫酸香草醛显色-紫外吸收光谱法在三七质量评价中的应用

采用氯仿、乙醇、水提取三七样品,同时在各溶剂提取液中加入一定量5%硫酸香草醛溶液,建立三七紫外指纹图谱和三七-硫酸香草醛紫外指纹图谱,采用SIMCA软件及共有峰率和变异峰率双指标序列分析法对两种处理所得紫外指纹图谱进行分析研究。结果表明,用氯仿、乙醇、水三种溶剂超声提取20min时效果最佳,加入硫酸香草醛溶液前后,三七紫外指纹图谱变化较大;三七紫外指纹图谱的共有峰率数据较为分散,最小为25.00%(Y5—Y8),最大为84.38%(Y11—Y13,Y20—Y21),最大变异峰率达177.78%(Y8—Y5),且有多个样品的变异峰率超过100%;三七-硫酸香草醛指纹图谱的共有峰率最小为42.86%(Y1—Y19),最大为79.55%(Y22—Y23),且数据分布较为集中,主要分布在50%～70%之间,其变异峰率的范围也较小,主要集中分布在20%～50%之间;双指标序列分析的结果与图谱结果一致,三七-硫酸香草醛紫外指纹图谱的相似性大于三七紫外指纹图谱,差异性与产地和生长年限都相关,相同生长年限样品间的相似性大于不同年限,样品间的异同与地理空间距离的远近没有相关性,相邻产地样品间有较大或较小的相似性。该方法的稳定性、重现性和精密度均较好,可以对至少2个样品的异同进行定量评价,克服了其他一些方法只能进行模糊定性识别的局限,为三七的质量评价提供一种新方法。

三七根际土壤中酚酸类物质的鉴定及含量测定

目的:对云南文山三七根际土壤中酚酸的种类进行鉴定,并对其进行含量测定。方法:采用HPLC-MS、HPLC技术,并通过文献和对照品比对,鉴定了云南文山三七根际土壤中酚酸的种类并对其进行含量测定。结果:从三七根际土壤提取液中检测到对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、对香豆酸、阿魏酸和苯甲酸6种酚酸类物质,其中对香豆酸含量最高(24.01μg·g-1),丁香酸含量最低(1.26μg·g-1)。6种酚酸类成分在三七根际土壤中的含量顺序为对香豆酸>香草酸>苯甲酸>对羟基苯甲酸>阿魏酸>丁香酸。结论:三七根际土壤中的酚酸类物质可能为三七植物须根残体腐解产生,也可能是三七根系分泌产生。

三七总皂苷对棕榈酸诱导的HepG2细胞炎症反应的保护作用

目的:观察三七总皂苷(Panax notoginseng saponins,PNS)对棕榈酸(Palmitic acid,PA)诱导的HepG2细胞炎症反应的作用,探讨PNS在抗炎作用中可能的机制。方法:体外培养HepG2细胞,根据实验要求设置对照组、PA处理组、PNS预保护组。采用MTT实验检测PA和PNS对HepG2细胞增殖的影响;油红O染色检测HepG2胞内脂质沉积;Real time PCR检测HepG2细胞肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)基因表达水平;ELISA法检测TNF-α释放水平;免疫荧光检测核转录因子(Nuclear factor kappa B,NF-κB)激活。结果:PA处理可诱导HepG2细胞凋亡、脂质沉积及炎症反应;PNS预处理则能够显著抑制PA诱导的HepG2细胞TNF-α表达及释放;PNS预处理组NF-κB激活被显著抑制。结论:PNS对PA诱导的HepG2细胞TNF-α表达及释放具有抑制作用,提示PNS具有减轻肝细胞炎性反应的作用,抑制细胞NF-κB信号途径可能是该保护作用机制之一。

三七总皂苷含药血清对溶血磷脂酸诱导血管平滑肌细胞增殖的影响及其机制研究

目的:观察三七总皂苷含药血清对溶血磷脂酸(LPA)诱导的血管平滑肌细胞增殖效应的影响,分析该作用与细胞外信号调节激酶ERK信号通路的关系。方法:采用贴块法培养大鼠主动脉平滑肌细胞;以四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观察不同分组对细胞增殖的影响;采用流式细胞仪分析细胞周期和DNA含量。结果:空白血清+LPA组较空白血清组OD值升高(P<0.05),S期指数升高(P<0.01);三七总皂苷含药血清+LPA组与卡托普利含药血清+LPA组比较OD值降低(P<0.05),S期指数无差异;三七总皂苷含药血清+LPA+PD98059组较空白血清组OD值降低(P<0.05),S期指数无差异。结论:三七总皂苷对LPA诱导的VSMC增殖有拮抗作用,且作用强于卡托普利,其作用机制可能与抑制LPA对ERK信号通路的激活,从而抑制DNA合成,阻止细胞进入S期有关。

复方丹参方有效组分及其配伍对2型糖尿病胰岛素抵抗的影响

目的对复方丹参方进行拆方、分离、纯化及配伍,观察复方丹参方不同组分及其配伍对2型糖尿病胰岛素抵抗(IR)的干预作用,并初步探讨其作用机制。方法以高糖高脂饲料喂养加小剂量链脲佐菌素腹腔注射法建立2型糖尿病IR动物模型,以复方丹参方不同组分及其配伍干预6周,于末次给药后分别检测各组大鼠空腹血糖、血脂、空腹胰岛素及氧化应激水平。结果丹参酚酸、三七皂苷及其配伍组分丹参酚酸+三七皂苷和丹参酚酸+三七皂苷+冰片,能够明显调节糖脂代谢,降低游离脂肪酸(FFA)表达,增强机体抗氧化能力,提高胰岛素敏感性;而丹参酮作用不明显。结论丹参酚酸、三七皂苷是复方丹参方中改善IR的主要活性部位,其作用与调节脂代谢、抑制FFA分泌、抗氧化应激等有关。

三七、虫草菌丝对实验性肝纤维化预防作用的研究

目的 观察三七、人工虫草菌丝对CCl4中毒性肝纤维化的预防作用。方法 复制大鼠CCl4中毒性肝纤维化模型 ,并以秋水仙碱作为阳性治疗对照。分空白对照组、肝纤维化模型组、秋水仙碱组、三七组、虫草菌丝组。采用光镜、电镜观察肝脏组织学改变 ,测定血清ALT、白蛋白、球蛋白、HA、LN、肝组织Hyp含量 ,以反映肝细胞损伤及肝纤维化程度。将形态改变与功能变化相结合 ,对比分析虫草菌丝对CCl4中毒性肝纤维化的预防作用。结果 CCl4可引起肝组织严重脂肪变性及肝纤维化。各组肝组织损伤及肝纤维化的严重程度依次为 :模型组 >虫草菌丝组 >秋水仙碱组 >三七组。结论 本实验条件下 ,三七是较理想的预防肝纤维化的药物。虫草菌丝对肝脏CCl4损伤具有一定保护作用 ,有较强促进肝细胞再生修复作用 ,同时在损伤肝组织中成纤维细胞及胶原纤维也明显增生 ,这将加快肝纤维化进程 ,临床应用时应权衡利弊。秋水仙碱有一定预防肝纤维化作用 ,但毒副作用不可忽视。

丹酚酸B/三七总皂苷配伍对心肌梗死大鼠左室结构和功能的影响

[目的]研究丹酚酸B(SalB)、三七总皂苷(PNS)对心肌梗死大鼠左室结构和功能的影响,探讨中药组分配伍的作用。[方法]结扎冠脉左前降支复制大鼠心肌梗死模型,假手术组作对照,连续灌胃给药7d。用彩色超声心动仪观察心脏左室结构和功能变化。[结果]SalB、PNS以及配伍组可以不同程度地降低左室收缩末期内径(LVDs)、左室收缩末期容积(LVESV),升高左室射血分数(EF)、左室短轴缩短率(FS),配伍组有优于其他中药组的趋势。[结论]SalB、PNS配伍可以有效改善心肌梗死大鼠的左室结构和功能。

外源草酸对三七皂苷Rg_1自毒效应的缓解作用及机制研究

【目的】明确外源添加草酸缓解皂苷Rg_1对三七根系自毒的缓解效应及作用机理,为缓解三七自毒危害提供依据。【方法】采用外源添加的方式,测定了1.0mg/L皂苷Rg_1溶液单独处理及外源添加质量浓度0.1,1.0,5.0mg/L草酸的混合处理对三七种苗根系萎蔫和鲜质量的影响,同时以体积分数0.1%甲醇为空白对照,分析外源添加草酸对Rg_1引起的三七种苗自毒效应的缓解作用。利用硝基四唑蓝氯化物(NBT)活性氧染色法,比较外源添加草酸后三七根尖活性氧的积累情况,测定抗氧化酶系统中与活性氧清除相关的过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的活性,以及抗坏血酸-谷胱甘肽(ASC-GSH)循环中抗坏血酸过氧化物酶(APX)和脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)的活性及抗坏血酸(ASC)和脱氢抗坏血酸(DHA)含量,探讨外源添加草酸对Rg_1自毒作用的缓解机制。【结果】1.0mg/L Rg_1单独处理会导致三七植株出现明显萎蔫,萎蔫率达到46.70%,鲜质量减少率达18.10%。外源添加质量浓度为0.1,1.0,5.0mg/L草酸后,三七的萎蔫率显著降低,仅为0～2.50%,鲜质量减少率降低至3.64%～6.17%,明显缓解了由皂苷Rg_1引起的自毒效应。NBT染色结果显示,Rg_1能诱导三七根尖活性氧大量积累,外源添加草酸后根尖积累的活性氧显著减少。酶活性分析表明,Rg_1能降低抗坏血酸-谷胱甘肽(ASC-GSH)循环中的抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性和抗坏血酸(ASC)含量,从而降低细胞对氧自由基的清除能力,导致细胞内活性氧的大量积累。外源添加草酸能通过增强过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)的活性及增加抗坏血酸(ASC)的含量来提高根系的抗氧化能力。【结论】外源添加草酸能提高ASC-GSH循环中APX和DHAR的活性及抗氧化剂ASC含量,进而增强三七根系的抗氧化能力,有效缓解皂苷Rg_1对三七生长的自毒活性。

三七总皂甙对马兜铃酸I诱导人肾小管上皮细胞转分化的作用及机制

目的探讨三七总皂甙(PNS)治疗肾间质纤维化的作用机制。方法将人肾小管上皮细胞(HK-2)按不同处理因素分为6组,空白对照组不予干预;PNS对照组加入PNS,使终质量浓度为400μg/ml;马兜铃酸I(AAI)诱导组加入AAI,终质量浓度为20μg/ml;PNS低、中、高剂量组均加入AAI20μg/ml,同时分别加PNS200、400、600μg/ml。培养48h后应用倒置相差显微镜观察细胞形态学变化;免疫组织化学法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达;ELISA法测定细胞上清液中TGF-β1水平;RT-PCR法检测结缔组织生长因子(CTGF)mRNA表达。结果AAI诱导组HK-2细胞从原来典型的上皮细胞形态转变为长梭形肌成纤维细胞形态,胞质内大量表达α-SMA,其积分光密度值、TGF-β1水平、CTGFmRNA表达均增加(P<0.05);PNS各剂量组细胞形态学改变减轻,α-SMA、CTGFmRNA表达和TGF-β1分泌降低,且呈剂量依赖性(P<0.05);PNS对照组各指标均无明显变化。结论PNS可抑制AAI诱导的肾小管上皮细胞转分化作用,其机制可能是抑制TGF-β1及其下游因子CTGF表达。

生、熟三七中多糖的含量比较

目的:提取分离生、熟三七中所含的多糖,并测定其含量;比较生、熟三七中多糖含量的差异性。方法:通过水煮醇沉的方法提取;Sevag法除蛋白;蒽酮-硫酸比色法测定其多糖的含量。结果:蒽酮-硫酸法测定生三七中多糖的含量为6.60%,熟三七中多糖的含量为6.95%。结论:熟三七中的多糖含量高于生三七中的多糖含量。

三七总皂苷对马兜铃酸I诱导的人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的:探讨三七总皂苷(total saponins of panax notoginseng,PNS)对马兜铃酸I(aristolochic acid I,AAI)诱导的人肾小管上皮细胞株HK-2转分化的影响。方法:应用倒置相差显微镜观察HK-2细胞形态学变化;免疫组织化学方法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达;ELISA法测定培养细胞上清液中转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的含量。结果:AA I诱导组HK-2细胞从原有典型的上皮细胞形态转变为长梭形肌成纤维细胞形态;胞浆内大量表达α-SMA,其积分光密度值增加(P<0.05);细胞培养上清液中TGF-β1含量均增加,且呈时间依赖性(P<0.05)。不同剂量PNS治疗可减轻AAI诱导的细胞形态学改变,不同程度的抑制α-SMA的表达和TGF-β1的分泌,且呈剂量依赖性(P<0.05)。PNS对照组HK-2细胞形态学、α-SMA表达和TGF-β1分泌与空白对照组比较均无明显变化。结论:AA I可通过促进TGF-β1的分泌诱导肾小管上皮细胞转分化,促进细胞外基质α-SMA的合成;PNS可抑制AA I诱导的肾小管上皮细胞转分化作用,减少α-SMA的表达,该作用可能是通过抑制TGF-β1表达实现的。