基于线粒体COⅠ基因的中国沿海和泰国普吉岛里氏拟石磺群体遗传结构分析

通过对COI序列的分析，研究了中国沿海及泰国普吉岛8个里氏拟石磺群体的种群遗传结构，171个样本中共检测出单倍型101个，117个多态性位点，里氏拟石磺具有高的单倍型多样性（0．974±0．005）和核苷酸多样性（0．0322±0．0013）。分子方差分析（AMOVA）表明，50．99％的变异存在于种群间，49．01％的变异发生在种群内。群体间遗传分化固定指数（Fst）、基因流（Nm）及遗传距离分析表明，里氏拟石磺已明显分化为显著的遗传结构。遗传距离模式（IBD）检测显示，里氏拟石磺群体的遗传距离与地理距离之间不存在明显的线性关系。历史动态检验推断，湛江（zJ）、苍南（CN）、东寨港（HN）、文昌（WC）及普吉岛（TH）种群可能经历过历史上的种群扩张事件。中国沿海群体扩张时间推测大约为0．781～0．725Ma BP，泰国普吉岛群体约为0．035Ma BP，两者可能伴随更新世冰期的气候变暖、冰川消融和海平面上升等现象发生。

基于Illumina HiseqTM 2000高通量转录组测序的里氏拟石磺SSR标记开发

为给石磺科贝类系统进化研究和资源保育工作提供更有效的分子标记,使用Illumina Hiseq TM2000高通量测序技术对里氏拟石磺进行转录组测序,以所得的拼接序列为基础,利用MISA和SSR Hunter1.3软件进行微卫星序列的查找,对选出的51个微卫星位点进行引物设计,经PCR扩增得到单一清晰扩增条带的位点24个,研究湛江里氏拟石磺群体扩增。结果表明,其中14个位点表现多态性。14个多态性位点得到的等位基因数为2~4,其中观测杂合度（Ho）和期望杂合度（He）分别为0.031 3~0.714 3和0.031 3~0.708 4,多态性信息含量（PIC）为0.089 5~0.640 5,14个位点中的2个位点表现为高度多态性（PIC〉0.5）,10个位点表现为中度多态性（0.5〉PIC〉0.25）,另外2个位点表现为低度多态性（PIC〈0.25）。经Sequential Bonferroni校正的Hardy-Weinberg平衡检验,9个位点不偏离平衡（P〉0.05）。开发的SSR标记可用于里氏拟石磺群体遗传学和石磺科贝类间的系统发生研究,并为里氏拟石磺的群体种质保护提供数据支持。

高效液相色谱法测定4种石磺中牛磺酸的含量

利用高效液相色谱邻苯二甲醛(OPA)柱前衍生法测定瘤背石磺(Onchidium struma)(上海崇明)、里氏拟石磺(Paraoncidium reevesii)和平疣桑椹石磺(Platevindex mortoni)(福建厦门)、紫色疣石磺(Peronia verruculata)(广东湛江)肌肉组织中牛磺酸的含量。结果表明,瘤背石磺、紫色疣石磺、里氏拟石磺、平疣桑椹石磺的肌肉组织中牛磺酸平均质量浓度分别为6 740.42、7 168.96、5 545.42、5 263.33 mg·kg-1。紫色疣石磺和瘤背石磺的牛磺酸含量均较高,两者无明显差异。

瘤背石磺和里氏拟石磺背部皮肤蛋白质组差异分析

从蛋白质水平探讨瘤背石磺和里氏拟石磺背部皮肤蛋白质组差异表达,为完善石磺科贝类从海洋到陆地进化的研究以及解释两种石磺不同的环境适应性提供蛋白质依据。应用Label-free非标定量蛋白质组学技术,结合软件Sequest HT和Proteome Discoverer (Thermo),对瘤背石磺和里氏拟石磺的背部皮肤进行蛋白质组搜库鉴定及定量分析,其中瘤背石磺中鉴定到1 491个蛋白质,里氏拟石磺中鉴定到1 030个蛋白质;用Pfind软件对表达图谱进行同源序列的鉴定及定量分析,检测到928个同源蛋白表达量有差异,瘤背石磺较里氏拟石磺上调表达406个(p<0.05, FC>1.5),下调表达339个(p<0.05, FC<0.5)。适应水下生活的里氏拟石磺背部皮肤角质化程度较低,差异同源蛋白序列分析显示与角质形成、细胞凋亡相关蛋白在里氏拟石磺背部皮肤中高表达,与皮肤保湿性能相关的神经酰胺类物质在瘤背石磺中高表达;KEGG分析显示,嘌呤代谢通路中存在的差异蛋白最多,共73个,其中瘤背石磺较里氏拟石磺上调表达22个,下调表达21个。蛋白组差异分析显示关键酶尿素酶在陆栖性较强的瘤背石磺中高表达,与前人所做动物从水生到陆生进化过程中尿素酶基因完全丢失的研究结论有所出入,属于特殊物种。里氏拟石磺的皮肤辅助呼吸能力和血窦数目均高于瘤背石磺,且背部皮肤中肌纤维更加粗壮,此生理现象在蛋白质组上的表现为两种石磺能量代谢及氧离子运输相关蛋白的差别较大;瘤背石磺背部皮肤中对环境污染反应灵敏的谷胱甘肽S转移酶和谷胱甘肽过氧化物酶的表达量高于里氏拟石磺,推测其与瘤背石磺较强的皮肤免疫能力和环境适应性相关。蛋白表达谱中928个差异表达同源序列为两种石磺表现差异和环境适应的分子机制研究提供了有意义的蛋白质组的基础数据。

两种石磺胚胎发育比较

实验室内对平疣桑椹石磺(Platevindex mortoni)和里氏拟石磺(Paraoncidium reevesii)的胚胎发育过程进行了详细观察,比较了两种石磺受精卵生物学数据之间的差异。结果表明,平疣桑椹石磺和里氏拟石磺的受精卵生物学数据存在显著性差异(P<0.05)。分别记录两种石磺受精卵、分裂期、囊胚期、原肠期、膜内担轮幼虫期、膜内面盘幼虫期、孵化期7个发育阶段的胚胎大小和孵化所需时间,观察各期胚胎发育特征,并与瘤背石磺胚胎发育做比较。发现不同种石磺胚胎发育各期的主要形态结构并无明显区别,但是发育各期胚胎大小及孵化所需时间均有较大差异。在平均水温28℃,静水微充气,平均盐度15的条件下,平疣桑椹石磺、里氏拟石磺和瘤背石磺从受精卵到膜内面盘幼虫孵化分别需要210 h、253 h和270 h;死亡时间分别为产卵后的第25天、22天和24天。孵化后的自由面盘幼虫发育至匍匐幼虫期开始死亡,未完成幼虫培育过程,面盘幼虫的变态过程和变态条件仍有待研究。