CRISPR-Cas系统在病原核酸检测中的研究进展

CRISPR-Cas系统作为原核生物获得性免疫系统,由簇状规则间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)构成,因其识别和切割特定DNA或RNA序列,而成为分子诊断领域研究的热点。研究人员利用Cas蛋白(Cas12、Cas13、Cas14、Cas3等)结合信号放大和转化技术(荧光法、电位法、比色法、侧向流动技术等),开发了许多高灵敏度、高特异性、低成本的诊断平台,为病原核酸检测提供了新途径。本文介绍了CRISPR-Cas系统的生物学机制及分类,总结现有的基于Cas蛋白反式切割活性开发的病原核酸检测技术,描述其特点、功能和应用场景,并对该系统的未来应用前景进行展望,期望CRISPR-Cas系统成为包括核酸检测在内的多靶标的理想检测平台。

环介导等温扩增技术在病原微生物临床检测中的应用

病原微生物是威胁人类健康的重要因素之一,快速、准确的检测方法对于感染性疾病的诊断具有重要意义。环介导等温扩增(LAMP)是一种恒温扩增方法,具有反应时间短、操作简便、灵敏度高、特异度高、检测成本低等优点,因此被广泛应用于感染性疾病的快速诊断。基于这种情况,该文主要阐述了LAMP的原理、特点及其在临床常见病原微生物检测方面的应用与研究进展。LAMP技术现在已经被应用于病原微生物的检测,且具有较高的灵敏度及特异度,但该技术仍有易产生假阳性、引物设计复杂等不足之处。该文综述了近年来LAMP技术在病原微生物感染中的应用与进展,并对其未来的发展前景进行了展望,以期在资源有限的环境中为病原微生物感染的快速诊断提供合理的研究方向。

CRISPR/Cas-等温扩增技术在食源性病原菌检测中的研究进展

食源性病原菌引起的食品安全事件引起广泛关注,为保证食品安全,采取有效的检测手段至关重要。新兴的簇状规则间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及其关联蛋白(CRISPR-associated protein,Cas)组成的CRISPR/Cas系统是广泛存在于细菌和古细菌中的一种获得性免疫系统,可高效、特异性识别并切割外源核酸,与传统技术相比在检测病原菌方面更为高效。本文基于CRISPR/Cas生物传感系统-等温扩增技术联用的相关研究进行综述,对CRISPR/Cas系统的分类、原理以及与等温扩增耦合后在食源性病原菌检测方面的研究进展进行概述,并对其在即时检测应用中的前景以及所面临的挑战进行深入探讨,以期为CRISPR/Cas生物传感系统的进一步发展提供参考。

基于核酸扩增-侧流层析试纸的食源性致病菌快速检测研究进展

食源性致病菌严重危害食品安全。传统的致病菌检测方法费时耗力,难以应对现代食品安全检测快速、简便的需求。分子生物学检测方法,如聚合酶链式反应法、等温核酸扩增法以及基于规律成簇间隔短回文重复序列的核酸检测技术等,已被广泛应用于食源性致病菌检测,为保障食品安全发挥了重要作用。近年来,联用核酸扩增检测技术和免疫层析技术成为食源性致病菌快速检测的研究热点。本文总结了核酸扩增和侧流层析试纸联用快速检测食源性致病菌的研究进展,重点讨论了其优缺点,并展望其未来发展方向,以期为食源性致病菌的检测和防控提供参考。

常见食源性病原菌的快速检测技术研究进展

食源性病原菌广泛存在于自然环境中,可通过肉类、海产品、奶制品等多种媒介传播,引起食源性疾病的发生。目前检测食源性病原菌的方法主要以平板培养辅以生化鉴定和血清型鉴定为主,检测的周期较长,效率较低,因此建立快速、精准的食源性病原菌检测方法对常见病原菌的现场检测及疾病的快速诊断尤为重要。本文对近年来常见食源性病原菌的快速检测方法进行了概述,主要包括免疫学检测手段、分子生物学检测方法和生物传感器检测技术,比较其优缺点,着重介绍了可以实现现场检测与实时检测的新兴技术:核酸-微流控检测技术,以期为常见食源性病原菌的预防与检测提供相关理论参考。

CRISPR-Cas13a系统在病原体检测应用中的最新研究进展

规律成簇的间隔短回文重复序列及相关蛋白(CRISPR-Cas)系统已作为近年来兴起的新一代分子诊断工具,被广泛应用于基因编辑、核酸检测等领域,其中Cas13a亚型因其在核酸检测中高特异度、高灵敏度、无需昂贵设备、操作简单、费用低廉等特点,在病原体检测领域展现出巨大的潜力。该文综述了CRISPR-Cas13a的作用机制、在病原体检测中的应用以及相关检测方法,并对Cas13a应用前景进行了展望。以期为CRISPR-Cas13a系统的进一步研究及其在病原体检测中的应用提供借鉴和参考。

CRISPR-Cas系统在病原微生物分子诊断中的研究进展

快速、灵敏、准确的病原微生物检测方法对感染性疾病的诊治及防控至关重要。基于成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关蛋白(Cas)系统的检测技术在病原微生物核酸检测中具有高灵敏度和高特异度的特点,该文概述了CRISPR-Cas系统的作用机制及不同Cas的核酸酶活性,总结了基于CISPR-Cas系统的检测技术在病原微生物核酸检测中的研究现状,对该系统在核酸检测应用中的挑战进行了综合分析,并提出了目前存在的一些解决方案。目前基于CRISPR-Cas系统的非核酸分析物检测仍处于前期研究阶段,但其在扩大检测范围、缩短检测时间、提高检测灵敏度等方面具有较大潜力,为开发基于CRISPR-Cas系统的病原微生物检测平台提供新思路。

病原体多重PCR检测技术研究进展

引起某一症候群传染病病原体种类繁多,且可能存在复合感染,快速、准确地诊断病原体,既可有效预防疾病传播,也可以很好地指导临床用药。多重PCR(multiplex polymerase chain reaction,MPCR)技术,可在一个反应体系中同时检测多个病原体,满足突发公共卫生事件中迅速查明病因需要。根据MPCR产物检测信号的时机不同,MPCR技术可分为PCR反应实时检测、终点检测、反应后检测3种类型。本文主要针对这3种类型的MPCR技术研究进展进行综述,并探讨此类技术的发展方向。

CRISPR-Cas系统在食源性致病菌检测中的研究进展

食源性致病菌的快速检测对预防食源性疾病的爆发具有重要意义。成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats,CRISPR)及CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated protein,Cas)构成的CRISPR-Cas系统已被广泛的应用于核酸检测,并在对食源性致病菌的检测中展现出快速、灵敏度高、特异性强等优势。本文介绍了CRISPR-Cas系统的原理、机制,总结了CRISPR-Cas系统与不同扩增方法和信号输出模式相结合在食源性致病菌检测中的应用,并讨论了这些检测方法存在的一些问题和挑战,最后对该技术的未来发展前景进行展望,旨在为食源性致病菌的快速检测提供新思路。

RPA检测技术在禽源病原检测中的研究进展

重组酶聚合酶扩增(recombinant polymerase amplification, RPA)是一种近年来研究者关注较多的新型恒温核酸扩增技术,该方法操作便捷、扩增速度快、特异性强及灵敏度高,无需借助精密仪器,且在恒温环境下(25~45℃)即可完成核酸检测,极有可能取代传统PCR检测技术。RPA检测技术迄今发展十余年,已广泛应用于细菌、病毒、真菌、寄生虫及耐药基因检测等领域,被认为是当前最有潜力的快速分子诊断工具,具有较为广泛的应用前景。笔者就RPA检测、技术优势、常见检测方式及其在禽源病原检测方面的研究进展进行概述,旨在为临床禽源病原新型检测技术的研究提供一定理论参考。

致病性弧菌检测新技术研究进展

随着人们对水产品需求的增加及致病性弧菌引发的食源性疾病的流行,致病性弧菌对水产养殖业及人类健康造成了巨大威胁,基于此,致病性弧菌检测新技术的开发变得尤为迫切。本文介绍了包括免疫学方法、核酸检测方法、基于生物芯片的检测方法、基于核酸适配体的检测方法、基于肽质量指纹图谱技术的检测方法、基于生物传感器技术的检测方法在内的6项检测技术,分析了其优缺点及其在致病性弧菌中的应用。最后,总结了致病性弧菌检测新技术的研究现状,结合新兴技术指出未来研究方向,为致病性弧菌的快速检测提供参考。

基于支气管肺泡灌洗液细菌核酸检测的桂林地区迁延性细菌性支气管炎病原研究

目的:通过支气管肺泡灌洗液(BALF)细菌核酸检测,研究桂林地区迁延性细菌性支气管炎(PBB)患儿的病原体。方法:选取2021年7月—2023年2月桂林医学院第二附属医院儿科收治的行支气管镜检查的PBB患儿40例作为研究对象,通过支气管镜取BALF进行核酸检测,查找病原体。结果:BALF细菌核酸检测结果显示,40例PBB患儿中有38例检出病原体,病原体共检测出61株。其中,以肺炎链球菌占比最高(44.2%),流感嗜血杆菌(22.9%)次之。1~3岁年龄段病原体检出率最高,4~6岁检出率次之。结论:桂林地区PBB常见的病原体为肺炎链球菌,与社区获得性肺炎相符,可为本地区提供参考。

乌鲁木齐米东区社区获得性病毒性肺炎患儿的病原体检测与流行病学情况分析

目的探讨与分析乌鲁木齐米东区社区获得性病毒性肺炎患儿的病原体检出与流行病学情况,希望为预防社区获得性病毒性肺炎的发生提供参考。方法选择2023年3月—2023年5月在乌鲁木齐米东区人民医院诊治的90例社区获得性病毒性肺炎患儿作为本次课题研究的对象,采集所有患儿的鼻咽拭子,采用多病原核酸检测技术检测病原体状况。结果在90例患儿中,检出流感病毒A型阳性6例、流感病毒B型22例、副流感病毒1型2例、副流感病毒2型1例、鼻病毒25例、呼吸道合胞病毒15例、腺病毒10例、人类偏肺病毒3例、博卡病毒6例。检出混合感染9例,占比10.0%,其中2种病毒混合感染7例,3种病毒混合感染2例。不同性别人群的多病原核酸检测分布情况对比,差异无统计学意义(P>0.05);<1岁人群的鼻病毒、流感病毒B型检出率显著高于其他年龄段人群(P<0.05);冬季人群的流感病毒B型检出率显著高于其他季节,其他病毒在不同季节与年龄人群的分布情况对比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论乌鲁木齐米东区社区获得性病毒性肺炎患儿的病原体以鼻病毒、流感病毒B型、呼吸道合胞病毒、腺病毒为主,可表现为混合感染,年龄、季节与鼻病毒、流感病毒B型感染的发生密切相关。

病毒类基因工程疫苗研究进展

疫苗接种被认为是控制病原体和预防人类以及动物疾病最有效的方法之一.近年来由于病毒性疾病来势汹汹,传统疫苗如灭活或减毒活疫苗的局限性及潜在问题日益突显,而基因工程技术的进步使得疫苗设计和研发得以改进,由此衍生的病毒类基因工程疫苗作为下一代疫苗越来越受到研究者的高度关注.通过病毒类基因工程疫苗的类型,重点介绍不同疫苗的开发原理、特点及用途,探讨其应用前景和发展趋势,旨在为新发病毒类疾病疫苗的研发提供参考.

社区获得性肺炎患儿肺泡灌洗液呼吸道病原体核酸十三项检测情况及特点分析

目的:探讨社区获得性肺炎(CAP)患儿肺泡灌洗液呼吸道病原体核酸十三项检测病原体分布情况,并进一步分析病原体分布特点。方法:选取240例行纤维支气管镜肺泡灌洗的CAP患儿作为研究对象,所有患儿均进行痰细菌培养、肺泡灌洗液细菌培养及肺泡灌洗液呼吸道病原体核酸十三项检测。比较上述三种检测方法结果的阳性率,并按照年龄将患儿分为<2岁、2~5岁、>5岁年龄组,分析肺泡灌洗液呼吸道病原体核酸十三项检测病原体在各组的分布特征。结果:240例患儿中,痰细菌培养结果阳性44例,阳性率18.34%;肺泡灌洗液细菌培养结果阳性者19例,阳性率7.93%;肺泡灌洗液呼吸道病原体核酸十三项检测结果阳性140例,阳性率58.33%。肺泡灌洗液呼吸道病原体核酸十三项检测的阳性率高于肺泡灌洗液细菌培养及痰细菌培养(P<0.05)。<2岁、2~5岁,>5岁年龄组患儿的病原体感染率分别为44.00%、61.27%及64.58%。140例肺泡灌洗液呼吸道病原体核酸十三项检测阳性患儿共检测病原体162株,排名前三的是肺炎链球菌、肺炎支原体及流感嗜血杆菌;其中,肺炎链球菌、肺炎支原体及流感嗜血杆菌占比均以2~5岁年龄组感染率最高。结论:肺泡灌洗液呼吸道病原体核酸十三项检测对CAP患儿诊疗具有重要价值,尤其是可准确检测肺部常见细菌、肺炎支原体感染情况。

成人呼吸道感染病原诊断核酸检测技术临床应用专家共识(2023)

呼吸道感染性疾病在临床中极为常见,病原体的快速检测和精准诊断是其有效治疗的前提。传统微生物学及免疫学技术对呼吸道病原体检测的灵敏度偏低,核酸检测技术的发展和临床应用大幅提高了呼吸道病原体的诊断能力。如何基于患者基础疾病、呼吸道感染类型及病原谱合理选择核酸检测技术并正确理解其临床应用价值,成为重要的临床问题。为此,中华检验医学培训工程专家委员会联合中华医学会呼吸病学分会组织我国多学科专家共同撰写了《成人呼吸道感染病原诊断核酸检测技术临床应用专家共识(2023)》。该共识参考国内外指南及文献,分析了实时荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)技术、等温扩增技术、数字PCR技术、核酸即时检测技术和病原体高通量测序技术的临床应用场景、技术特点和性能验证要求,以及该类技术在成人急性上呼吸道感染、气管支气管炎、社区获得性肺炎、医院获得性肺炎/呼吸机相关性肺炎、慢性阻塞性肺疾病急性加重、肺结核和免疫功能受损人群呼吸道感染中的应用,以供临床参考借鉴。

一种用于核酸即时检测的全集成微流控芯片

针对病原体的核酸即时检测需求,设计了一种集核酸提取和扩增功能于一体的微流控芯片,利用一次性注射器驱动芯片上的液体流动,借助紫外线验钞笔便可用肉眼直接读出核酸检测结果。芯片分为提取区、混合区和扩增区,在提取区设计了裂解池和清洗池,利用磁珠法完成核酸提取;在混合区设计了洗脱池、扩增试剂池和方波型混合器,用于核酸的洗脱以及与扩增试剂的混合;在扩增区,为了实现多靶标检测,一共设计了16个扩增反应池,采用一种滑动式芯片结构,实现各反应池之间的物理隔离。采用模拟仿真和实验,对方波混合器的混合性能进行了验证,表明其可以实现核酸洗脱液与扩增试剂的均匀混合。在微流控芯片上,利用荧光素钠溶液模拟了环介导等温扩增反应过程,证明了滑动式扩增反应池结构能够满足多靶标检测的物理隔离要求。

基于CRISPR/Cas系统的病原核酸检测技术研究进展

作为一种古老的细菌和古菌免疫系统,规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白[clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated protein(Cas),CRISPR/Cas]系统现已发展为新兴的热门基因编辑工具,极大地推动了其他多个生物学相关领域的发展。其中,通过结合CRISPR/Cas系统与核酸恒温扩增技术建立了一些新型的高效、灵敏、不依赖仪器设备的检测方法,如DNA内切酶靶向的CRISPR反式报告系统(DNA endonuclease-targeted CRISPR trans-reporter,DETECTR)、特异性高灵敏度的酶报告器系统(specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking,SHERLOCK)等,不但提高了CRISPR/Cas系统在不同应用场景下的检测性能,更进一步激发了其在现场检测中的应用潜力。本文基于近年来被广泛应用的3种CRISPR/Cas系统(CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12a以及CRISPR/Cas13)的生物核酸检测方法,阐述了CRISPR/Cas系统的生物学意义及一般作用原理,并通过回顾以往开展的CRISPR/Cas系统相关的病原检测研究,比较分析了不同检测系统的特点以及在实际应用过程中可能存在的不足,为针对不同病原在不同应用场景下建立更加高效、合理的CRISPR/Cas系统检测方法提供了有益参考。

凹凸棒土作为食源性致病菌核酸提取材料的可行性研究

目的研究凹凸棒土作为一种低成本、高效的食源性致病菌核酸提取材料的可行性。方法利用X射线衍射(X-ray diffraction,XRD)、傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)、Zeta电位分析、扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)和比表面积及孔径分析(brunauer-emmett-teller,BET)对凹土样品进行表征,建立凹土样品对DNA吸附和解吸附的方法和体系,并进行条件优化。利用吸附动力学模型和吸附等温模型考察其对DNA的吸附作用,以金黄色葡萄球菌为核酸提取对象,考察核酸提取的得量、纯度与完整性。结果吸附体系中最适pH为5.0,Na+最适浓度为300 mmol/L,准一级动力学模型和Freundlich模型更好地模拟吸附结果,凹凸棒土对DNA饱和吸附量理论值达到18.8972 ng/μg,选取25 mmol/L三聚磷酸钠为解吸剂,解吸率可达95.80%±0.44%。将凹凸棒土应用于金黄色葡萄球菌核酸的提取可获得完整、得量为(4.74±0.20)μg的基因组DNA。结论凹凸棒土对DNA有较强的吸附效果,且选取合适的解吸剂DNA易洗脱。以凹凸棒土为核酸固相提取材料,有望实现食源性致病菌基因组DNA的低成本、高效提取。

等温核酸扩增技术在食源性致病菌检测中的研究进展

等温扩增技术是近年来发展迅速的一种新型核酸扩增技术,其反应过程始终维持在恒定的温度下,降低了对精密仪器和检测场地的要求,并大幅度缩短了检测时间,更能满足准确、快速、灵敏、便携的日常检测需求。目前,食源性致病菌仍是影响食品安全的主要因素之一,等温核酸扩增技术已成功应用于部分食源性致病菌的检测中,具有广阔的应用前景,有望成为食源性致病菌快速检测的新方法。本文综述了环介导核酸等温扩增、滚环扩增、跨越式滚环扩增、重组酶聚合酶扩增、等温多自配引发扩增、单引物等温扩增、依赖解旋酶的等温扩增、链置换扩增、交叉引物扩增9种等温核酸扩增技术的扩增原理和优缺点,及其在食源性致病菌检测中的应用研究进展,提出了样品前处理、引物设计、结果判读、检测灵敏度、检测通量方面存在的共性问题,并给出相应解决措施,以期为等温核酸扩增技术在食源性致病菌快速检测中的实际应用和相关标准的制定提供研究思路。