2型猪链球菌gene0969基因敲除突变体的构建及毒力分析

目的:构建2型猪链球菌强毒株05ZYH33毒力岛89K上的Ⅳ型分泌系统组分gene0969敲除突变体,初步分析其活性,为进一步研究猪链球菌假想毒力因子在致病中的作用提供实验基础。方法:以05ZYH33基因组为模板,PCR扩增gene0969基因的上下游片段;以穿梭质粒pSET1为模板,PCR扩增氯霉素抗性基因Cm;采用重叠PCR方法搭建3个片段,并克隆到自杀载体pSET4s上,构建基因敲除载体,通过同源重组构建gene0969突变体,再用小鼠感染模型对突变株和野生株的毒力进行比较。结果:获得了gene0969基因敲除突变体,并发现其毒力与野生型相比有下降趋势。结论:2型猪链球菌假想毒力因子gene0969可能与毒力有关,其作用和机制值得进一步分析。

应用LAMP技术鉴定含89K毒力岛2型猪链球菌菌株

目的应用LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)技术鉴别含89K毒力岛2型猪链球菌(Streptococ-cus suisserotype2,S.suis2)菌株。方法根据S.suis2中国分离株(05ZYH33)89K毒力岛中基因序列设计4条引物(2条内引物、2条外引物);应用LAMP,对21株S.suis2、18株其它链球菌、9株葡萄球菌、5株其它菌株及49份未知样本进行检测,并对LAMP的最低检测限进行测试,结果通过肉眼目测或电泳检测,并将结果与PCR/定量PCR结果比较。结果该方法仅对含89K毒力岛的中国S.suis2特有株检测为阳性,而其它菌株经LAMP检测均为阴性,试验表明本方法特异性好,其最低检测限为24CFU/反应,无需特殊设备,结果通过肉眼即可判断,从菌株核酸的提取至检测完成仅需2h左右。应用本方法对49份不同来源样本进行实际考核,其中32份不明发热病人呼吸道咽拭子应急样本及15份正常猪扁桃体咽拭子样本经检测89K毒力岛基因均为阴性,2份疑似SS2病人血液应急样本中一份检测到该毒力岛基因,该结果与普通PCR/定量PCR检测结果一致。结论成功建立了检测S.suis289K毒力岛的LAMP方法 ,该方法特异性好,操作简便,无需特殊的仪器设备,操作简单方便,极适合在我国广大基层实验室(包括基层医院/动物检疫等部门)开展应用。

云南战区部队首次检出携带耶尔森菌HPI毒力岛基因irp^(-2)的大肠杆菌

目的:了解携带小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛基因irp-2的大肠杆菌在云南战区部队腹泻患者粪便标本中的存在情况,并对其菌株做毒力试验。方法:用PCR扩增法检测毒力岛基因irp-2,小白鼠腹腔注射检测毒力。结果:从268份腹泻病人粪便中分离的大肠杆菌菌株中,检测出携带小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛基因irp-2的18株,检出率为6.72%(18/268)。毒力试验使小白鼠发病并死亡。结论:云南战区存在携带小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛基因irp-2的大肠杆菌,该菌对部队指战员的健康具有潜在性的威胁。

猪链球菌2型ABC转运蛋白gene0910敲除突变体的构建及活性分析

目的:构建猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2)强毒株05ZYH3389K毒力岛上的ABC转运蛋白gene0910敲除突变体,并初步分析其活性,为进一步研究猪链球菌假想毒力因子在致病中的作用提供实验基础。方法:以猪链球菌2型05ZYH33基因组为模板,扩增gene0910两侧各约500bp左右的片段为上下游同源臂,以pSET1质粒为模板,扩增氯霉素抗性基因Cm为中间片段,采用重叠PCR方法搭建三个片段,并克隆到自杀载体pSET4S上,构建基因敲除的载体。电转化05ZYH33感受态细胞,经30℃双交换和40℃质粒丢失,最后点板法筛选出基因敲除突变体△0910。对突变株和野生株的生物学活性及小鼠的致病性进行了初步比较。结果:PCR分析和测序结果均显示gene0910完全被氯霉素抗性基因Cm所替代,基因敲除突变体构建成功。结论:突变株的生物学活性和对小鼠的致病性与野生株相比差异不显著。

阴沟肠杆菌菌株中携带小肠结肠炎耶尔森菌毒力岛irp-2基因的检测

目的:了解从云南战区感染性腹泻患者粪便标本中分离的阴沟肠杆菌是否携带小肠结肠炎耶尔森菌H IP(H ighPathogen ic ity Island)毒力岛irp-2基因,并研究菌株的毒力及耐药情况。方法:用PCR扩增法检测毒力岛irp-2基因,小白鼠腹腔注射检测毒力。结果:从1040例腹泻病人粪便分离的25株阴沟肠杆菌中,检测出18株携带小肠结肠炎耶尔森菌H IP毒力岛irp-2基因,毒力试验证实有较强毒力,药敏试验筛选出了敏感、中度敏感及耐药三类药敏谱。结论:云南战区检出的阴沟肠杆菌含有小肠结肠炎耶尔森菌H IP毒力岛irp-2基因且为毒力较强的菌株,对人类的健康具有潜在性的威胁。建立的药敏谱,为军队和地方今后在治疗由此菌引起的感染提供重要参考。