基于CRISPR/Cas9系统制备猪Pax2基因敲除细胞系

肾脏发育缺陷或缺失的猪模型可为人源化肾脏器官在异种动物体内再生提供“发育空位”,因此敲除肾脏发育关键基因Pax2(Paired box2)获得该动物模型是肾脏再生的关键步骤。本文利用生物信息学分析软件比对分析了不同物种间Pax2蛋白结构,明确了猪Pax2蛋白在氨基酸序列、二级结构和三级结构方面与人、小鼠具有相似性。结合Pax2蛋白在人和小鼠肾脏发育中的功能,选择猪Pax2基因第8外显子序列作为打靶目标区间,设计并构建了用于敲除猪Pax2基因的CRISPR/Cas9打靶载体。在检测CRISPR/Cas9载体打靶猪Pax2基因效率的基础上,利用细胞核转染和G418药物筛选获得巴马小型猪细胞单克隆。通过PCR、T载体克隆和Sanger测序检测各细胞单克隆Pax2基因的敲除情况,鉴定出33个双等位基因敲除Pax2基因的巴马小型猪细胞系,敲除效率达到45.21%(33/73)。本研究为肾脏缺失或肾发育不全的猪模型的获得奠定实验基础,同时为后续在猪体内再造人源化肾脏以及肾发育疾病的研究提供了研究材料。

首次发现1例局灶性节段性肾小球硬化症患儿PAX2基因新的移码变异及文献复习

目的了解儿童遗传性慢性肾脏病的临床与病理特点,寻找其致病基因突变位点并分析基因突变与临床表型的关系,以期早期诊断,早期预防。方法收集徐州医科大学附属徐州儿童医院1例疑似为遗传性因素所致慢性肾脏病患儿及其直系亲属的临床资料,并行肾穿刺病理检查,同时采用二代基因测序方法对该患儿、患儿父母及妹妹进行基因检测,寻找可能的突变位点,并与该家系中正常个体进行比较。结果患儿为14岁男孩,3岁时起病,主要临床表现为蛋白尿、夜尿增多,未正规治疗。期间多次尿蛋白++~+++,且逐渐出现尿床症状,家长一直未予重视。2年前于当地医院查肝、肾功能,家长诉未见异常,2019年8月19日因尿床至我院就诊,门诊查尿蛋白+++,血尿素氮13.54 mmol/L,肌酐188μmol/L,肾脏超声提示双肾缩小,肾穿刺活检病理结果为局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)。基因检测示患儿PAX2基因存在c.143delGp.Gly48Valfs*35剪切位点突变,且目前尚未有人群携带记录,因而考虑该患儿为PAX2基因出现新的移码突变。结论该例患儿临床表现为慢性肾脏病,肾活检确诊为FSGS,基因检测PAX2基因发生新的移码变异。对于病因不明的慢性肾脏病患儿应注意完善肾脏病理及基因检测,有助于明确诊断。

PAX2在肾小管上皮细胞转分化中的作用

目的揭示核转录因子(PAX2)在肾小管上皮细胞转分化过程中的可能作用。方法38例病例组肾组织按间质病变程度分为轻、中、重3组,其中轻度病变15例,中度病变11例,重度病变12例;对照组为5例外伤后肾切除组织。采用免疫组化法评定肾组织PAX2的表达率和肾小管上皮细胞转分化率。对肾间质病变轻、中、重3组组内肾小管上皮细胞转分化率、PAX2表达率作方差分析,对PAX2表达量与肾小管上皮细胞转分化率作相关分析。结果正常对照组肾小管上皮细胞只表达角蛋白(CK),不表达平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及PAX2。病例组肾间质病变轻、中、重3组肾小管上皮细胞均不同程度表达α-SMA及PAX2;不同肾间质病变组,肾小管上皮细胞转分化率及PAX2表达量差异均有统计学意义。相关分析表明,PAX2表达量和肾小管上皮细胞转分化率呈正相关(r=0.886,P<0.05)。结论PAX2回归表达可能导致肾小管上皮细胞转分化。

Pax2在肾脏发育和肾疾病中的调控作用

配对盒基因2(Paired box2,Pax2)是肾脏发育中重要的转录因子,在前、中、后肾发育的全过程表达,集中分布在发育的各级小管和间充质成分,具有特定的时空特性。研究表明Pax2与多种调节肾脏发育的因子Gdnf、Ret、SHH、Wnt4及Fgf等相互作用,共同精准诱导生肾索形成,前/中肾管的形成及分化,输尿管芽的发生及分支,肾单位的诱导分化。Pax2的变异导致多种先天性肾脏及输尿管发育畸形,最易发生在肾-视神经盘缺损综合征。在肾细胞癌、Wilms瘤和多种肾小球及肾小管获得性疾病中存在Pax2的异常表达,其诊断和治疗价值将是今后研究的重点。文章主要对Pax2的分子结构、在肾脏发育和肾疾病的表达及调控进行了综述。

Pax2在肾病综合征糖皮质激素耐药中的作用

目的:通过观察原发性肾病综合征(PNS)激素敏感与激素耐药组病例中Pax2和P53表达的差异,探讨Pax2在肾脏糖皮质激素耐药中的作用。方法:采用免疫组织化学方法观察40例PNS患儿肾活检组织中Pax2和P53表达差异,分别对肾小球与肾小管间质的病理改变进行半定量评分,对Pax2,P53及病理积分进行相关分析。结果:正常对照组肾组织未见Pax2及P53阳性表达。所有PNS患儿肾活检组织可见不同程度肾小管上皮细胞Pax2表达,足细胞微弱表达或未表达Pax2,其它肾固有细胞未见Pax2表达。激素耐药组近端小管及远端小管上皮细胞Pax2表达较激素敏感组明显增多(P<0.01),表达密集部位的肾小管多呈现扩张、萎缩或结构不完整,小管绒毛明显脱失。肾小管上皮细胞Pax2阳性表达与肾小管病理积分呈正相关(P<0.01)。激素敏感组未见P53表达,激素耐药组中部分病例检测到P53表达,主要分布于肾小管上皮细胞。相关性分析发现P53表达与Pax2表达、肾小管病理积分均呈正相关(均P<0.01)。结论:肾小管上皮细胞Pax2过度表达,在一定的应激状态上调P53蛋白表达,使肾小管病理改变进一步加重,这可能是导致PNS患儿对激素耐药的机制之一。

PAX2稳转细胞系构建及对细胞迁移和侵袭能力的作用研究

目的探讨PAX2稳转细胞系构建及生物学作用。方法选择处于对数生长期大鼠肾小管上皮细胞,实验分为稳转组、空载组、对照组。稳转组采用阳离子脂质体转导将p EGFP-PAX2转入大鼠肾小管上皮细胞,空载组采用同样方法配置空载质粒转染溶液,对照组不添加质粒转染溶液。经G418筛选,建立稳定转染细胞系。通过细胞划痕实验及Transwell实验检测PAX2稳转细胞系的细胞迁移率及细胞侵袭作用。结果应用G418筛选14 d,稳转组大鼠肾小管上皮细胞有明显克隆长出,建立PAX2基因稳定转染肾小管上皮细胞系。稳转组在荧光显微镜下可见绿色荧光,基因融合表达获得成功。稳转组细胞PAX2条带密度与β-action吸光度比值为(1.00±0.04),空载组为(0.83±0.03),对照组为(0.85±0.04),3组吸光度比值比较,差异有统计学意义(F=398.7,P<0.05);其中稳转组吸光度比值高于空载组和对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。细胞划痕后18 h,对照组、空载组和稳转组细胞迁移率分别为(39.34±5.34)%、(40.56±7.54)%和(83.72±7.12)%,3组细胞迁移率比较,差异有统计学意义(F=431.8,P<0.05);其中稳转组细胞迁移率高于对照组和空载组,差异均有统计学意义(P<0.05)。各组细胞培养48 h后,对照组、空载组和稳转组迁移细胞分别为(23.33±3.63)、(22.00±8.14)、(45.67±7.14),3组迁移细胞数比较,差异有统计学意义(F=248.5,P<0.05);其中稳转组迁移细胞数高于对照组和空载组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 p EGFP-PAX2质粒成功转染大鼠肾小管上皮细胞,并成功筛选出高效稳定表达PAX2的稳转细胞系。PAX2稳转增加了肾小管上皮细胞的迁移及侵袭能力。

PAX2在卵巢浆液性腺癌中的表达及在MDACC分级系统中的应用价值

目的探讨PAX2在卵巢浆液性腺癌中表达的意义,及其在二级组织学(MDACC)分级系统中的应用价值。方法回顾性研究55例经手术治疗的卵巢浆液性腺癌患者的临床病理资料,并结合临床病理参数进行统计学分析。运用免疫组化技术观察PAX2在卵巢浆液性腺癌中的表达水平,分析表达结果与组织学分级和临床病理参数之间的关系。结果 PAX2阳性表达定位于细胞核,阳性率为40%。PAX2的表达水平在肿瘤的复发、pTNM分期间有显著差异(P<0.05),Kaplan-Meier检验显示pTNM分期、肿瘤复发、MDACC分级、PAX2表达分别与预后有关(P<0.05)。Kappa检验显示PAX2表达水平与MDACC分级水平一致性较好(κ=0.773,P<0.01)。结论PAX2可以作为判断MDACC分级的辅助手段,其低表达或不表达对诊断MDACC高级别可信度较高。

Pax2、增殖细胞核抗原、细胞凋亡在肾病综合征激素耐药中的作用

目的观察原发性肾病综合征(PNS)激素敏感与激素耐药组患儿Pax2、增殖细胞核抗原(PCNA)表达及细胞有效凋亡率,探讨Pax2在肾脏糖皮质激素(GC)耐药中的作用。方法采用免疫组织化学法观察PNS患儿40例肾活检组织Pax2、PCNA表达,采用荧光显微镜检测细胞凋亡。结果激素敏感组Pax2适量表达,与PCNA阳性表达呈正相关。激素耐药组,Pax2呈过度表达,与PCNA阳性表达无明显相关性。Pax2始终与细胞凋亡呈负相关。结论Pax2适量表达,通过促进细胞增殖及抑制凋亡,修复受损的小管-间质。Pax2过度表达,细胞增殖与凋亡进一步减少,导致肾小管病理改变加重,使其对激素不敏感甚至耐药。

PAX2在子宫内膜癌中的表达及其与ERα的相关性

目的:探讨PAX2在子宫内膜癌组织中的表达情况,分析PAX2和子宫内膜癌临床病理参数的关系及其与ERα的相关性。方法:采用免疫组化法检测60例子宫内膜癌、20例子宫内膜不典型增生及30例正常子宫内膜组织中PAX2与ERα的表达情况。结果:(1)PAX2在正常子宫内膜组织、子宫内膜不典型增生、子宫内膜癌3组中的阳性表达率比较差异均有显著性(P<0.05)。PAX2的高表达与子宫内膜癌的病理类型、手术病理分期、肌层浸润深度及淋巴结转移有明显关系,与组织分化程度无明显相关(P>0.05)。(2)在ERα阳性的子宫内膜癌患者中,PAX2阳性表达率为75%,而在ERα阴性的子宫内膜癌患者中,PAX2阳性表达率为50%,两者相比有统计学意义(P<0.05)。结论:PAX2可作为判断子宫内膜癌预后的一种新指标,在子宫内膜癌中PAX2的表达可能与ERα密切相关。

胚胎分化/发育基因pax2与WT1的序列启动在肾小管上皮细胞逆向分化中的意义

目的:通过观察肾小管上皮细胞(TEC)胚胎分化/发育关键基因Wilm s肿瘤基因(WT1)和pax2的序列启动,探讨TEC逆向分化的分子机制及病理生理学意义。方法:从胚胎肾、肾脏损伤模型及体外细胞培养3方面入手,通过RT-PCR、免疫组织化学等技术,研究TEC逆向分化时,胚胎期控制TEC分化/发育的关键基因pax2和WT1的表达、pax2和WT1之间的关系以及它们与TEC逆向分化间的关系。结果:(1)胚胎期:pax2和WT1mRNA先后在胚胎11.5 d及14 d时开始出现表达并逐渐增强,出生14 d后仅有痕量表达。免疫组化显示,成年大鼠中仅肾小球足突细胞表达WT1,TEC中pax2和WT1表达阴性。(2)5/6慢性肾损伤模型:损伤第2周,部分TEC重新出现pax2和WT1的表达,第4周达高峰,两者表达趋势相吻合。pax2在第10周尚有一个新的表达高峰,随后逐渐下降至痕量。(3)TEC体外培养:经炎性因子IL-1α(10μg/L)、AngII(10-9mol/L)掺入培养后,TEC分别在0.5、24 h内重新表达pax2和WT1,随后α-SMA出现高表达,细胞呈现间充质样细胞特征。以WT1中和抗体、An-gII受体阻断剂封闭WT1和pax2基因的作用后,α-SMA表达水平明显降低,细胞基本保持原有特征不变。结论:控制胚胎肾分化/发育的关键基因pax2和WT1在成年肾遭受损伤时,可获得重新表达,呈现序列启动现象,TEC同时出现胚胎间充质细胞特征;pax2和WT1的重新表达与细胞浸浴环境(高浓度细胞因子)密切相关,可能作为内在启动机制参与TEC的逆向分化。

PAX2、PCNA以及nm23在肾细胞癌中的表达及意义

目的:探讨发育调控基因PAX2和PCNA(增殖细胞核抗原)以及nm23(肿瘤转移抑制因子)在肾细胞癌组织中的表达及意义。同时作三者之间相关性的研究。方法:应用免疫组织化学SP法检测44例肾细胞癌患者肿瘤组织标本及11例癌旁肾组织标本(距肿瘤边缘2cm的肾组织标本)中PAX2、PCNA、nm23的表达情况。结果:PAX2、PCNA、nm23在肾细胞癌患者肿瘤组织标本及癌旁肾组织标本中的阳性表达率有显著差异(P<0.05)。PAX2阳性表达率随肾细胞癌临床分期的升高而增加,低分期组(Ⅰ+Ⅱ)与高分期组(Ⅲ+Ⅳ)相比差异显著(P<0.05)。PCNA的阳性表达率随肾细胞癌的临床分期及病理分级的升高而增加,有显著差异(P<0.05)。nm23的阳性表达率随临床分期和病理分级的升高而下降,之间有显著学差异(P<0.05)。PAX2与nm23之间以及PCNA与nm23之间的阳性表达有一定的相关性(P<0.05)。结论:PAX2、PcNA、以及nm23三者可能参与了肾细胞癌的发生发展过程,之间有一定的相关性。三者联合检测可减少单一指标检测的局限性,对肾细胞癌的诊断和恶性程度评估有重要意义。

PAX2小干扰RNA在UUO大鼠体内的筛选与鉴定

目的梗阻性肾病是由于泌尿道机构和(或)功能改变,阻碍尿液的排出,导致肾实质病理和功能损害的临床综合征。病理学特征主要表现为肾小管萎缩和间质纤维化。文中通过RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,筛选及鉴定有效抑制肾间质纤维化大鼠肾组织PAX2基因表达的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)序列。方法制作单侧输尿管结扎(unilateral ureteral obstruction,UUO)模型,光镜下观察肾组织病理形态学变化;针对大鼠PAX2 mRNA序列全长(mRNA:NM_001106361),设计合成4对siRNA干扰序列和阴性对照序列,为了观察体内转染同时合成FAM标记的阴性对照,以invivo jetPEI体内转染试剂为载体转染至UUO大鼠肾被膜下,利用实时荧光定量PCR及Western blot技术检测肾组织PAX2 mRNA及蛋白表达。结果通过HE和Masson染色观察到UUO模型3 d后肾纤维化表现;UUO模型转染3 d后,荧光显微镜观察到肾小管周围存在绿色荧光,4对干扰序列均有不同程度的抑制肾皮质PAX2 mRNA及蛋白的表达,其中siRNA3位点对PAX2干扰效果最强,mRNA及蛋白抑制分别达到55%和81%。结论成功筛选出1对有效抑制肾间质纤维化大鼠肾小管上皮细胞PAX2表达siRNA,为深入研究肾纤维化的发病机制提供新的手段。

PAX2和P53在卵巢浆液性肿瘤中的表达及其意义

目的:探讨PAX2和P53在卵巢浆液性肿瘤中的表达及其意义。方法:收集35例卵巢浆液性囊腺瘤、33例卵巢交界性浆液性囊腺瘤及50例卵巢浆液性囊腺癌标本,制作组织芯片;选取正常卵巢10例、包涵囊肿10例及输卵管内膜异位腺体或囊肿10例,采用免疫组织化学法检测PAX2、P53和Ki-67在其中的表达情况,分析其差异及临床病理意义。结果:①PAX2在正常卵巢表面上皮及包涵囊肿上皮中不表达,而在输卵管内膜异位腺体或囊肿上皮中有表达。②PAX2在卵巢浆液性囊腺瘤、交界性浆液性囊腺瘤及卵巢浆液性囊腺癌中的阳性率分别为86%(30/35)、67%(22/33)和16%(8/50),差异有统计学意义(P<0.01)。③P53在卵巢浆液性囊腺瘤、交界性浆液性囊腺瘤及卵巢浆液性囊腺癌中的阳性率分别为0%(0/35)、39%(13/33)和80%(40/50),差异有统计学意义(P<0.01)。④PAX2和P53的表达与卵巢癌患者的临床病理指标之间差异均无统计学意义。结论:①PAX2可能与卵巢浆液性肿瘤的良恶性分化有关;P53可能参与了卵巢癌的形成。②卵巢浆液性囊腺瘤、交界性浆液性囊腺瘤及低级别浆液性癌可能均来源于输卵管内膜异位腺体或囊肿;高级别浆液性癌的来源可能与之不同。

pax2基因在肾小管上皮细胞转分化中的作用

目的探讨pax2基因在大鼠慢性肾小管间质纤维化过程中的表达及其对肾小管上皮细胞转分化的可能作用。方法大鼠5/6肾切除造模,分别于术后2、4、6、8、10、12周取左肾皮质,采用逆转录(RT)-PCR及免疫组织化学的方法检测模型组和正常对照组的pax2和-αSMA的表达。结果病变组织见系膜细胞和基质增生,间质炎症细胞浸润,基底膜变厚。5/6肾切除模型组大鼠在术后第2周出现pax2mRNA的强表达,第4周达高峰,与正常对照组比较P<0.05,此后下降至痕量表达;α-SMA mRNA也在术后第2周表达逐渐增强,第8周达高峰,与正常对照组比较P<0.05,此后逐渐下降。免疫组织化学染色显示,5/6肾切除模型组pax2蛋白的表达、肾小管上皮细胞中α-SMA的表达与pax2mRNA、α-SMA mRNA的表达趋势相同。结论在大鼠慢性肾间质纤维化的过程中,受损的肾小管上皮细胞可向肌成纤维细胞转分化,肾小管发育胚胎基因pax2在此过程中的一过性表达可能起到重要的作用。

pax2启动子的克隆及其在人胚胎肾293T细胞中的转录活性

目的:克隆paired box2(pax2)基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并检测其活性。方法:采用PCR技术从人乳腺癌细胞系MCF-7基因组中扩增出pax2启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列。将重组的报告基因瞬时转染人胚胎肾293T细胞,检测pax2启动子活性。结果:测序结果显示扩增的pax2启动子序列正确;活性实验表明构建的报告基因具有启动子活性,雌激素受体α(ERα)能以剂量依赖的方式升高pax2报告基因的转录。结论:克隆了pax2启动子,为ERα共调节子的功能研究提供了重要基础。

PAX2在Ⅰ型子宫内膜癌及其癌前病变中的表达及意义

目的:探讨PAX2在Ⅰ型子宫内膜癌中的表达,分析其在Ⅰ型子宫内膜癌发病机制中的作用。方法:采用免疫组化法检测61例子宫内膜癌、35例子宫内膜增生、19例子宫内膜不典型增生及17例正常增殖期子宫内膜中PAX2的表达情况。结果:(1)PAX2的表达在不典型增生内膜、Ⅰ型子宫内膜癌与正常增殖期子宫内膜之间;不典型增生内膜、Ⅰ型子宫内膜癌与子宫内膜增生之间;不典型增生内膜、Ⅱ型子宫内膜癌与Ⅰ型子宫内膜癌之间差异均有统计学意义(P<0.05)。而PAX2的表达在正常增殖期子宫内膜、子宫内膜增生、Ⅱ型子宫内膜癌之间两两比较均无差异(P>0.05)。(2)61例子宫内膜癌中,有淋巴结转移的患者其PAX2的表达明显高于无淋巴结转移的患者(P<0.05),差异有统计学意义。而PAX2的表达与患者的年龄、分化程度以及肌层浸润情况均无关(P>0.05)。结论:PAX2基因可能在Ⅰ型子宫内膜癌癌变的机制中扮演了重要的角色,并可以成为鉴别子宫内膜过度增生以及不典型增生的染色指标。

卵巢上皮性癌组织中PAX2基因的表达及临床意义

目的探讨PAX2mRNA和蛋白在卵巢上皮性癌中的表达及临床意义。方法采用逆转录聚合酶链反应和免疫组化方法检测PAX2mRNA和蛋白在31例卵巢上皮性癌、11例卵巢上皮性交界性肿瘤、10例卵巢上皮性良性肿瘤和11例正常卵巢组织中的表达,并分析其表达与卵巢上皮性癌临床病理学指标的关系。结果正常卵巢表面上皮无PAX2的表达,PAX2mRNA和蛋白在卵巢上皮性癌组织中的表达显著高于卵巢交界性肿瘤组织、卵巢良性肿瘤组织及正常卵巢组织,差异均有统计学意义(P<0.01);卵巢交界性肿瘤组织、卵巢良性肿瘤组织及正常卵巢组织中PAX2mRNA和蛋白表达的差异无统计学意义(P>0.05)。在晚期(Ⅲ～Ⅳ)及低分化的卵巢上皮性癌中PAX2mRNA和蛋白的表达高于早期(Ⅰ～Ⅱ)及高中分化者,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 PAX2在卵巢癌的发生发展中起一定作用,可能对卵巢癌恶性程度的评估有指导意义。

PAX2基因在肾间质纤维化中的研究进展

配对盒子基因2(PAX2)是发育转录因子基因家族PAX成员之一,是肾脏发育重要调控因子。PAX2基因在肾脏损伤时重新表达,再表达部位主要位于肾小管,其诱导肾小管上皮细胞转分化以及肾脏细胞凋亡,进而导致肾间质纤维化。PAX2基因在肾间质纤维化中涉及众多的蛋白质、细胞因子、细胞外基质、补体以及许多的信号通路,其上游调控分子及下游靶基因至今尚未完全明确。PAX2在肾间质纤维化过程中的作用途径和作用机制至关重要,本文就PAX2在肾间质纤维化中的研究进展进行综述。

PAX2和增殖细胞核抗原在肾细胞癌组织中的表达及意义

目的 探讨PAX2和增殖细胞核抗原 (PCNA)在肾细胞癌组织中的表达及意义。方法 应用免疫组化SP法检测 4 4例肾细胞癌患者组织样本及 11例癌旁正常肾组织标本中PAX2和PCNA的表达。结果 在肾细胞癌患者组织样本及癌旁正常肾组织标本中PAX2的阳性表达率分别为 6 3 6 %和 18 2 % ,两者间有显著差异 (P <0 0 1)。PAX2的阳性表达随肾细胞癌临床分期的升高而增加 ,与组织类型及病理分级无明显相关。PCNA在肾细胞癌患者组织中的阳性表达明显高于癌旁正常肾组织 (P <0 0 1) ,并随肾细胞癌临床分期及病理分级的升高而增加 ,但与组织类型无关。PAX2和PCNA阳性表达间无明显的相关关系。结论 PAX2和PCNA可能参与了肾细胞癌发生和发展的过程 。

PAX2基因自发突变致肾⁃视神经盘缺损综合征一例

本文报道1例全长配对盒基因(PAX)家族中PAX2突变至肾⁃视神经盘缺损综合征的患儿。患儿男性,11岁10个月,临床表现持续泡沫尿伴不明原因的肾功能衰竭,患儿自幼出现视力下降。基因检测证实PAX2剪切位点突变(c.862⁃1G>A),Sanger测序验证显示患儿父母该位点均无变异,属于自发突变,结合临床表现符合肾⁃视神经盘缺损综合征诊断。PAX2突变是导致该患儿进展至终末期肾病及肾外表现的原因。