夏氏疟原虫感染的红细胞膜表面抗原Pc90的cDNA特征 I．cDNA文库的构建及阳性克隆的筛选

目的：构建夏氏疟原虫早期滋养体的ｃＤＮＡ文库，并从中筛选出表达Ｐｃ９０的阳性克隆。方法：采用ＧＴＣ／ＣｓＣｌ法提取ＲＮＡ，ｃＤＮＡ克隆入λ－ＺＡＰ噬菌体，用抗Ｐｃ－ＨＣＰＭ血清３次筛选并经抗Ｐｃ９０单克隆抗体复筛，阳性克隆经体内剪接后行限制性内切酶酶切分析。结果：该ｃＤＮＡ文库有１．９×１０６个重组体。用抗Ｐｃ９０－ＨＣＰＭ的多克隆抗体筛选后，得到１６个阳性克隆，其长度分别为：０．６ｋｂｐ，１．４ｋｂｐ，１．６ｋｂｐ，２．２ｋｂｐ以及２．５ｋｂｐ。其中仅２．２ｋｂｐ和２．５ｋｂｐ克隆与抗Ｐｃ９０单克隆抗体反应呈阳性。限制性内切酶酶切分析表明，２．２ｋｂｐ，２．５ｋｂｐ和１．６ｋｂｐ的克隆具有不同的特征。结论：２．２ｋｂｐ和２．５ｋｂｐ的克隆极有可能表达Ｐｃ９０蛋白。

夏氏疟原虫感染的红细胞膜表面抗原Pc90的cDNA特征 Ⅱ．免疫阳性克隆Pc90-1的DNA序列分析及其在大肠杆菌中的表达

目的：对表达Ｐｃ９０的ｃＤＮＡ克隆进行鉴定和分析并在大肠杆菌中予以表达。方法：将２．５ｋｂｐ的克隆（Ｐｃ９０－１）分别双向经外源性核酸酶Ⅲ删除，以制备亚克隆，末端终止法测序，并在大肠杆菌中表达。结果：经ＤＮＡ序列分析，这个克隆全长２５８１ｂｐ，翻译大约６１ｋＤａ的蛋白（５３２个氨基酸），开放阅读框到１５９６ｂｐ，随后是２个连续的终止码。值得注意的是３－末端的非翻译区相对较长。Ｐｃ９０－１在第１００到３５５个氨基酸之间有一个明显的重复区。将Ｐｃ９０－１的各亚克隆在大肠杆菌中表达，仅得到一约３５ｋＤａ的融合蛋白。Ｐｃ９０－１的ＤＮＡ序列与其它已知序列无同源性。Ｐｃ９０－１的酸性等电点及潜在的磷酸根结合位点均与前人报道的Ｐｃ９０的特征相符。结论：Ｐｃ９０－１可能表达Ｐｃ９０蛋白。