Penicillium raistrickii15α羟基化左旋乙基甾烯双酮工艺研究

通过生物转化技术对甾体化合物左旋乙基甾烯双酮进行15α位羟基化,合成了重要的药物中间体15α-羟基左旋乙基甾烯双酮,对生物转化工艺进行了优化。重点对底物的助溶剂进行了筛选,同时对培养基成分,接种量,初始pH,通气量,投料浓度,投料时间,转化时间等转化条件进行了优化。结果表明:在摇瓶发酵中,Penicilliumraistrickii对甾体化合物左旋乙基甾烯双酮生物转化,产物15α-羟基左旋乙基甾烯双酮转化率达到60%,在发酵罐放大试验中,转化率达到50%以上。具有工业生产前景。

三种真菌对洋地黄毒苷的生物转化特性研究

考察了新月弯孢霉(Curvularia lunata)AS3.3589、蓝色犁头霉(Absidia coerulea)CICC40302和雷斯青霉(Penicillium raistrickii)ATCC10490对洋地黄毒苷的生物转化特性.结果表明:新月弯孢霉AS3.3589转化洋地黄毒苷得到2个产物,即产物Ⅰ和产物Ⅱ,产物Ⅰ的转化率为27%,产物Ⅱ的转化率为5%;蓝色犁头霉CICC40302转化洋地黄毒苷得到1个产物,即产物Ⅲ,转化率为6%;雷斯青霉ATCC10490对洋地黄毒苷不发生转化反应.通过优化新月弯孢霉KA-91生物转化反应的工艺条件,使转化产物Ⅰ的转化率达到38%,产物Ⅱ的转化率达到10%.

雷斯青霉转化左旋乙基甾烯双酮15α-羟基化反应工艺研究

对雷斯青霉(Penicillium raistrickii)微生物转化左旋乙基甾烯双酮15α-羟基化反应的培养基组成和转化条件进行优化.结果表明:优化后最佳培养基组分为葡萄糖30,g/L,玉米浆20,g/L,NaNO3 2,g/L,KH2PO4 1,g/L,K2HPO42,g/L,MgSO4 0.5,g/L,FeSO4 0.02,g/L,KCl 0.5,g/L;最适转化条件为接种量10%,初始pH7.5,摇瓶装量50 mL,转化温度28,℃,投料量0.2%,投料时间30,h,转化时间60,h,底物添加方式为底物超声粉碎后加4%甲醇和1.5%吐温80溶解.在此条件下,摇瓶转化率可达70%以上.

雷斯青霉15α-羟基化左旋乙基甾烯双酮的发酵工艺优化

利用雷斯青霉（Penicillium raistrickii）的特异性转化酶对甾体化合物左旋乙基甾烯双酮进行15a-位羟基化，制备了重要的激素药物中间体15a羟基左旋乙基甾烯双酮。以种龄、接种量、投料量、pH值控制、溶氧控制、投料和转化时间等影响因子为对象对其发酵罐二级发酵工艺进行了优化。确定0．2％投料量条件下最优发酵工艺条件为：种龄21h；接种量5％；0～27h，pH值7．5、溶氧40％；27～66h，pH值6．0、溶氧20％；投料时间第30h；转化时间42h。在此条件下，转化率可达65％以上，比优化前提高了11．4％，为药物中间体15a-羟基左旋乙基甾烯双酮的进一步扩大发酵转化以及工业化生产奠定了基础。

N^+离子注入选育高转化15α-羟基左旋乙基甾烯双酮雷斯青霉菌株的研究

应用离子注入技术,对能转化左旋乙基甾烯双酮为15α-羟基左旋乙基甾烯双酮的雷斯青霉(Penicillium raistrickii)进行研究,旨在提高其C15α位羟化能力。结果表明,雷斯青霉存活率曲线呈典型的"马鞍型",通过液相色谱分析,在N+注入剂量为50×1014ions.cm-2时可引起较高的正突变率,并从中获得一突变株,其15α-羟基左旋乙基甾烯双酮转化率达到62.7%,为出发菌株的1.16倍。

利用固定化微生物细胞羟基化左旋乙基甾烯双酮

研究了海藻酸钙包埋法固定化技术在甾体化合物的生物转化中的应用.利用固定化Penicillium raistrickii细胞实现对左旋乙基甾烯双酮(13-ethyl-estr-4-ene-3,17-dione)的15α位羟基化作用,合成了重要的药物中间体15α-羟基左旋乙基甾烯双酮.优化了固定化孢子浓度,固定化孢子接种量,投料浓度,投料时间,转化时间等转化条件.结果表明:在摇瓶发酵生物转化中,固定化Penicillium raistrickii细胞可重复利用5次而转化能力没有明显下降.

雷斯青霉菌次生代谢产物研究

目的：对雷斯青霉菌的次生代谢产物进行分离鉴定。方法：采用硅胶柱层析、薄层层析、葡聚糖凝胶、高效液相色谱等方法分离纯化目标菌株的代谢产物,以现代波谱技术和理化性质鉴定化合物结构。结果：从雷斯青霉菌的发酵物中分离得到12个化合物,分别鉴定为：pestafolide A（1）、4-甲基-3-甲氧基-2,4-戊二烯酸（2）、对羟基苯乙酰胺（3）、2-（2-羟基丙酰胺基）苯甲酰胺（4）、烟酸（5）、胸腺嘧啶（6）、尿嘧啶（7）、环（甘-丙）肽（8）、（22E,24R）-3β,5α,9α-三羟基麦角甾-7,22-二烯-6-酮（9）、酒酵母甾醇（10）、麦角甾醇（11）、过氧化麦角甾醇（12）。结论：化合物1~12均为首次从雷斯青霉菌中获得。

微生物转化法合成3-氧代齐墩果酸及其条件优化

以齐墩果酸为底物,选取雷斯青霉(Penicilliumraistrickii)、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)和黑根霉(Rhi-zopus nigricans)三种微生物对其进行转化,采用TLC、HPLC方法检测转化产物。结果表明,雷斯青霉和赭曲霉对齐墩果酸有转化能力,其中雷斯青霉转化能力较高,主产物为3-氧代齐墩果酸;对雷斯青霉生物转化条件进行优化,确定最佳工艺条件为:投料时间36 h、转化时间48 h、转化pH值5.5、转化温度28℃、最大底物加入量不超过100 mg.L-1、DMF体积分数0.6%。在此条件下,齐墩果酸转化率可达7.95%、3-氧代齐墩果酸生成率达50.97%。用雷斯青霉对齐墩果酸进行衍生化,是一种合成3-氧代齐墩果酸新方法。

雷斯青霉NADPH-细胞色素P450还原酶基因的克隆及生物信息学分析

工业上利用丝状真菌雷斯青霉(Penicillium raistrickii)转化生产高效避孕药孕二烯酮的关键中间体15α–羟基左旋乙基甾烯双酮.已知参与雷斯青霉甾体转化反应的关键酶为P450羟化酶,该羟化酶体系由细胞色素P450羟化酶和NADPH–细胞色素P450还原酶(CPR)组成,但有关其15α–羟基化反应的分子基础尚不清楚.根据转录组测序数据库,通过RT-PCR扩增克隆了一个雷斯青霉NADPH-细胞色素P450还原酶基因.该基因的开放阅读框为2,082,bp,编码694个氨基酸的多肽链,预测的蛋白相对分子质量为7.63×104,具有CPR蛋白的典型结构域(FMN结合域、FAD和NADPH结合域).NCBI BLAST结果显示雷斯青霉CPR与意大利青霉(P.,italicum)NADPH–细胞色素P450还原酶具有较高的同源性,一致性为93%.

增加雷斯青霉15α–羟化酶基因拷贝数提高甾体转化效率

孕二烯酮是第三代高效避孕药的主要成分.雷斯青霉(Penicillium raistrickii)ATCC10490催化甾体左旋乙基甾烯双酮的C15α–羟基化反应合成孕二烯酮的重要中间体C15α–羟基左旋乙基甾烯双酮.为了提高现有生产菌种的转化效率,本文研究了在雷斯青霉ATCC10490中增加甾体C15α–羟化酶基因(PRH)拷贝数对转化效率的影响.分别构建了PRH基因的诱导型和组成型过表达载体pPZP-p800-PRH和pPZP-TrpC-PRH,并通过同源重组的方法定点整合到雷斯青霉基因组.转化实验表明,在出发菌株中增加一个PRH基因拷贝显著提高了甾体左旋乙基甾烯双酮转化效率,重组菌PRH-P800和PRH-TrpC的摩尔转化率分别提高了13%和20%,同时转化时间均缩短了12h.

耐促溶剂雷斯青霉菌株N^+注入诱变选育

在甾体生物催化过程中,向发酵液中添加亲水性有机溶剂,是增加底物溶解进而提高转化效率的有效手段,但有机溶剂对于菌体普遍具有毒性。为此采用N+注入诱变方法,对出发菌株雷斯青霉p-10-8进行改良,获得耐促溶剂菌株60 A-5-8,当投料量增大到4‰时转化率达82.61%。经过5次传代实验证明,该菌株具有较高的遗传稳定性。

雷斯青霉的复壮及水溶性离子液体对其15α-羟基化的影响

针对真菌培养过程中出现的退化问题,对雷斯青霉采用灭菌胡萝卜作为斜面培养基进行了复壮处理,并通过添加水溶性离子液体的方式提高底物的溶解与传递.结果表明:在相同培养条件下,采用胡萝卜复壮后的雷斯青霉羟基化左旋乙基甾烯双酮产15α-羟基化左旋乙基甾烯双酮.选用离子液体[EMIm][EtOSO3]代替有机溶剂作为促溶剂,促溶剂添加量为4%,底物左旋乙基甾烯双酮投料量为5,g/L,投料时间为30,h,转化时间为72,h时的产物转化率最高可达68.1%.

雷斯青霉F-1发酵培养基优化及对枸杞木虱的毒力测定

雷斯青霉是本课题组在罹病木虱虫体上分离获得的具有生防效果的菌株,研究提高雷斯青霉的生长性能对进一步提高防治效果具有重要意义。本试验以产孢量为指标,采用单因素试验设计对发酵培养基中不同成分及其浓度进行筛选与优化,并对枸杞木虱三龄若虫进行毒力测定。结果表明,优化后的培养基配方为可溶性淀粉40 g·L^(-1)、酵母粉1 g·L^(-1)、K2-HPO41 g·L^(-1)、MgSO4·7H2O 1.5 g·L^(-1)、KCl 0.5 g·L^(-1)、FeSO40.01 g·L^(-1),产孢量较基础培养基提高了9.84倍。毒力测定结果表明,优化培养基对枸杞木虱三龄若虫在第7天的校正死亡率较同时间基础培养基增加了25.56%。综合产孢量与毒力结果,优化后培养基效果比基础培养基的效果更佳,为提高雷斯青霉防控枸杞木虱的防治效果奠定了基础。

雷斯青霉菌诱变菌株YB4粗毒素对枸杞线角木虱若虫的毒力及其稳定性分析

为开发防治枸杞线角木虱Bactericera gobica的天然微生物源杀虫剂,采用浸虫浸叶法和叶面喷施法测定雷斯青霉菌Penicillium raistrickii菌株F-1及其诱变菌株YB4粗毒素的室内毒力、温室防效,选择毒力效果较好的菌株粗毒素,测定其酸碱、温度和紫外线稳定性。结果表明:相同浓度下,诱变菌株YB4粗毒素对枸杞线角木虱若虫的室内毒力及温室防效均高于菌株F-1;处理72 h后,浓度为120 mg/L的诱变菌株YB4粗毒素对枸杞线角木虱若虫的室内毒力达到85.46%,处理14 d后,浓度为120 mg/L的诱变菌株YB4粗毒素对枸杞线角木虱若虫的温室防效达到78.61%。雷斯青霉菌诱变菌株YB4粗毒素主要成分为酚酸类、生物碱类、黄酮类、萜类、醌类及木脂素和香豆素。诱变菌株YB4粗毒素发挥杀虫作用的适宜pH为6~8,适宜温度为25~40℃,紫外线照射时间不宜超过30 min。表明雷斯青霉菌诱变菌株YB4粗毒素具有开发为天然微生物源杀虫剂的潜力。

非模式真菌雷斯青霉遗传操作系统的建立

雷斯青霉Penicillium raistrickii能够产生丰富的次级代谢产物,然而,对其生物合成途径和沉默基因簇的产物研究鲜有报道,这是由于高效遗传操作系统的缺乏严重阻碍了其分子生物学机制研究和天然产物的开发利用。本研究建立了未作为特定对象广泛研究的非模式真菌雷斯青霉CGMCC 3.1066的遗传操作系统。我们逐步确定了孢子萌发培养条件、抗生素筛选浓度、原生质体制备条件和转化DNA片段浓度,利用PEG介导的原生质体转化技术,成功敲除了5个长度分布在1-10kb的基因,平均敲除阳性率为17.5%。此外,我们敲除了雷斯青霉中黑色素前体1,8-dihydroxynaphthalene(DHN)-melanin的合成基因。结果表明,该基因的缺失会导致雷斯青霉孢子颜色变为白色,但不影响正常生长,这使得该位点可作为以雷斯青霉为宿主的异源表达整合位点,可快速可视化辨别整合外源基因的转化子。雷斯青霉遗传操作系统的建立,将为其基因功能鉴定、化合物生物合成途径解析等研究奠定基础,同时为其他非模式丝状真菌转化体系的建立提供重要参考。

雷斯青霉ATCC10490对补骨脂二氢黄酮甲醚转化的研究

研究了雷斯青霉(Penicillium raistrickii)ATCC 10490对补骨脂二氢黄酮甲醚生物的微生物转化,通过硅胶柱分离等技术得到转化产物BC-PC-4的纯品。在细胞水平上分析了该转化产物的抗肿瘤活性,结果发现产物BC-PC-4对细胞MCF-7的抗肿瘤活性IC50值为9.31μmol/L,较底物补骨脂二氢黄酮甲醚降低了7.04μmol/L,且对正常细胞HUVEC有促进增殖的作用。