利用改进的酚-氯仿法从猪毛囊中提取基因组DNA

为提高从猪毛囊组织中提取基因组DNA的效率，文章在借鉴从其他组织提取基因组DNA方法的基础上，对经典的酚-氯仿法的反应体系和步骤进行了改进。利用改进的酚-氯仿抽提法，从猪的毛囊组织中快速、高效地提取了高质量基因组DNA。利用该方法从1-6根猪毛囊中提取的基因组DNA可满足基于PCR技术的相关分子生物学实验需要。

环介导等温扩增技术检测恶性疟原虫的研究

目的环介导等温扩增(LAMP)技术检测恶性疟原虫。方法酚氯仿法提取恶性疟原虫基因组DNA,设计四条扩增恶性疟原虫环子孢子蛋白基因的LAMP引物,以间日疟原虫、弓形虫、卡氏肺孢子虫、人全血DNA为对照,进行LAMP反应。LAMP产物经显色、电泳鉴定。将原虫血症为1.5%的恶性疟原虫血样用正常人血按1∶10倍比稀释为1.5×10-3、1.5×10-4、1.5×10-5、1.5×10-6、1.5×10-7、1.5×10-86个浓度后进行LAMP,检测其敏感性。结果恶性疟原虫检测管经显色后呈绿色(阳性),对照组均呈棕色(阴性)。恶性疟原虫LAMP产物经电泳后呈LAMP特征性梯状条带,对照组均无扩增产物。LAMP可检测恶性疟原虫的敏感度为1.5个疟原虫/107RBC。结论检测恶性疟原虫的LAMP方法特异、敏感及简便。

藏酋猴毛干DNA的3种提取方法

为寻求一种从藏酋猴毛干中提取总DNA的有效方法,从一藏酋猴个体背部剪取数量不等的毛干样品(不含毛囊),经蛋白酶K消化后,分别采用高盐沉淀抽提法、酚氯仿抽提法、纳米磁珠抽提法分离获得用于PCR扩增的模板DNA,通过紫外分光光度计测定OD值并计算出质量浓度,同时进行琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增检测,分析3种方法提取藏酋猴毛干DNA的质量差异。每处理设置10个重复。结果表明,纳米磁珠法提取藏酋猴毛干中DNA是一种快捷、简便、经济、高效、安全的有效方法;进行毛发取样时以5～10根较为合适。

牛支原体分离株全基因组序列测定及初步分析

为全面了解牛支原体NM2012株的基因序列,研究其潜在的致病机制及其复制、转录、翻译过程的调控机制,采用体外大量培养,酚-氯仿法提取牛支原体NM2012株基因组DNA,并送往北京华大基因公司进行全基因组测序注释。结果显示,牛支原体NM2012株基因组大小为993 483bp,GC含量为29.26%,测序组装后共产生3个scaffolds,24个contigs。基因组组分分析后发现,NM2012株的基因组含有885个基因,总长度为834 042bp,基因平均长度为942bp,占基因组全长的83.95%。串联重复序列共79个,总长为9 203bp,占基因组全长的0.926 3%。小卫星序列53个,微卫星序列5个,tRNA 34个,rRNA 4个。牛支原体NM2012株16SrRNA序列与支原体属致牛羊病主要菌株构建进化树进一步证实NM2012株为牛支原体,为后期进一步研究牛支原体提供依据。

牛基因组DNA两种提取方法的比较研究

研究哺乳动物基因组DNA的水煮抽提法,并将传统的酚仿抽提法和水煮法进行比较,水煮法即通过对细胞的煮沸和冷却,使细胞破裂、蛋白变性,从而获得用于PCR扩增的模板DNA的方法。通过电泳分析和PCR扩增检测了所提取基因组DNA的完整性、可行性。检测时采用3对引物对2种方法提取的DNA进行了PCR扩增,同时对冷冻保存的基因组DNA也进行了扩增检测。结果表明:水煮法提取基因组DNA是一种快速、简便、经济、高效的方法。

运用酚-氯仿法结合磁珠法提取蝇蛆体内人类DNA

目的建立运用酚-氯仿法结合磁珠法从蝇蛆嗉囊内提取人类DNA的方法,从而提高STR分型检验的灵敏度。方法采用酚-氯仿法对蝇蛆嗉囊内容物中的人类DNA进行提取,提取产物经磁珠法纯化浓缩后用QuantifilerTM人类DNA定量试剂盒在7500型实时荧光定量PCR仪上进行PCR定量,再用AmpF■STR IndentifilerTM试剂盒在3130XL-Avant遗传分析仪上对这些DNA样本进行STR分型。结果本研究建立的方法可增加模板DNA浓度约为单独使用酚-氯仿法的2倍。用此方法提取到的DNA浓度[(0.218±0.041)ng/μL]可获得全部16个STR分型结果。结论酚-氯仿法结合磁珠法可以有效地提高提取到的人类DNA样本STR分型检验的灵敏度,对于从事法医昆虫学方面研究的工作者有较好的实用价值。

一种高效稳定的微生物总RNA提取方法

本研究通过对玻璃珠-酚仿RNA提取方法进行改进优化,实现对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌这3类微生物RNA高效稳定的提取。结果表明,玻璃珠-酚仿提取法能有效提取的RNA最低菌体细胞量为1×107个,远低于试验所选商业化试剂盒所需细胞量。以1×107个细胞量为例,利用Beadbeater仪破碎30 s,使用直径100μm的玻璃珠破碎提取得到的细菌RNA浓度显著高于使用直径500μm的玻璃珠提取的。使用2种直径的玻璃珠所得酵母菌RNA浓度无显著性差异。在直径100μm的条件下,破碎30 s即可保证RNA的高效提取,对于长双歧杆菌、大肠杆菌和酵母菌,破碎时间长达150 s也不会引起RNA降解。本法所提RNA的A260/A280为1.96~2.10,A260/A230为2.03~2.44,浓度和纯度均优于试验所选商业化试剂盒所提的RNA。

酚/氯仿法和盐析法提取人类外周血基因组DNA方法的比较

目的比较两种不同方法提取的基因组DNA的纯度、产量和后续实验效果。方法采用酚/氯仿法和盐析法两种方法直接从全血中提取基因组DNA,并采用电泳、PCR和基质支持的激光释放/电离飞行时间质谱分析(MALDI-TOF MS)方法进行检测。结果酚/氯仿法提取的基因组DNA纯度高于盐析法(P<0.001),但两组纯度平均值都高于1.80;没有发现两种方法提取的DNA浓度存在差异(P=0.819)。两组DNA在电泳中都没有出现明显拖尾现象,均很容易扩增出胰岛素诱导基因2片段,并且在MALDI-TOF MS检测中,两组DNA样本结果没有明显差异。结论酚/氯仿法和盐析法提取的基因组DNA质量无明显差异。相比酚/氯仿法,盐析法能简便、快速、无毒地进行DNA提取,适合于大规模的分子生物学实验。

不同提取方法和不同组织对中华绒螯蟹DNA提取效果的比较研究

为了优化中华绒螯蟹基因组DNA提取方法,采用酚-氯仿法和试剂盒法分别对中华绒螯蟹的鳃、肌肉、血淋巴液和刚毛4种组织进行DNA提取,并从纯度、浓度、片段完整性及微卫星标记PCR扩增效果4个方面评价提取DNA的质量。结果显示:酚-氯仿法提取的DNA片段比试剂盒法提取的更完整,且DNA浓度较高,但纯度稍低;无论何种提取方法,刚毛和血淋巴液中的DNA纯度都高于鳃和肌肉,4种组织中的DNA含量依次为鳃>肌肉>刚毛>血淋巴液,未剪碎刚毛中未能提取到基因组DNA;微卫星标记的电泳结果表明,两种提取方法下4种组织中提取的DNA均可满足微卫星标记的应用要求。综上,本研究建立了一种简便的非损伤性中华绒螯蟹的采样及其DNA提取方法,这对于进行中华绒螯蟹遗传育种和分子标记研究等方面具有一定的积极作用。

饱和苯酚-氯仿抽提法与Chelex-100树脂法提取DNA在研究犬STR基因座多态性中的应用比较

在研究犬STR基因座多态性中,比较使用了饱和苯酚-氯仿抽提法和Chelex-100树脂法,两种方法提取的DNA在扩增后的检测结果均能准确地反映实验结果。尽管从平均峰面积和平均峰高值等指标上,利用Chelex-100树脂法提取的DNA质量和扩增后的检测效果较饱和苯酚-氯仿抽提法差,但Chelex-100树脂提取法更为简单快捷,适合在建立警犬STR基因座等位基因数据库中和犬亲缘关系鉴定中广泛使用。

一种快速提取质粒DNA用于鉴别重组克隆的方法

介绍了一种利用过夜培养的菌液瞬时提取质粒DNA，并用于电泳鉴别含有插入子克隆的方法。事先无需准备许多繁琐的相关试剂，提取质粒的全过程只需3～5min就可完成，非常适合于做重组克隆的快速鉴别。

一种适于PCR扩增的快速提取猪基因组DNA的碱裂解法

以大白猪背最长肌、脾脏、耳组织为材料,用碱裂解法和酚-氯仿法分别提取猪基因组DNA,用紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳、PCR扩增检测DNA的产量和质量,结果发现2种方法提取的DNA产量没有明显差异。通过猪MC4R、TEF-1基因特异引物进行PCR扩增均能得到目的条带。碱裂解法提取的DNA原液稀释5倍、10倍后作为模板均获得了较为稳定的扩增产物。该结果表明,简单、快速、无毒的碱裂解法适用于动物定性PCR检测时DNA的提取。

烧骨DNA提取与检测技术的实验研究

目的探索烧骨DNA提取与检测方法。方法常压下以200℃分别对30例成人股骨焚烧1h后,生物冷冻研磨,EDTA脱钙,改良酚-氯仿提取DNA,光度计检测DNA浓度和纯度;5色荧光标记,PCR复合扩增,基因分析仪毛细管电泳,软件收集数据和分析。结果改良酚-氯仿法提取烧骨DNA浓度为(28.5±1.7)ng/μl,16个基因位点基本齐全,相对荧光单位(RFU)>500;传统酚-氯仿法提取烧骨DNA浓度为(4.7±0.8)ng/μl,基因位点检出不全,RFU<500。结论改良酚-氯仿法、PCR复合扩增、基因分析能对烧骨DNA进行有效提取和检测,但操作时要严格规程。

提取东北虎毛发DNA两种方法的比较研究

研究东北虎毛发DNA的水煮抽提法,并将传统的酚仿抽提法和水煮法进行比较。水煮法即通过对细胞的煮沸和冷却,使细胞破裂、蛋白质变性,从而获得用于PCR扩增的模板DNA。通过测定OD值并计算浓度和纯度,同时进行琼脂糖电泳检测、PCR扩增和PAGE电泳检测,分析2种方法提取东北虎毛发DNA的质量差异。结果表明:水煮法提取东北虎毛发中DNA是一种快捷、简便、经济、高效的方法。

不同方法提取鳗鲡病原菌DNA模板的差异分析

利用吸光值、琼脂糖电泳及PCR差异扩增等指标,对酚-氯仿法、水煮法、碱裂解法3种方法制备的鳗鲡病原菌DNA模板进行了差异分析.结果表明:1)不同方法提取的病原菌模板DNA的浓度、纯度及分子质量大小存在差异,但以这3种方法提取的病原菌DNA为模板,均能成功扩增到细菌16S rD-NA和外膜蛋白的保守序列.其中,酚-氯仿提取的模板DNA浓度较低、纯度较高;水煮法和碱裂解法提取的模板DNA浓度较高、纯度较低.2)电泳显示,3种方法获得的模板DNA扩增出的16S rDNA保守序列条带均一,没有显著差异,但在外膜蛋白保守序列的扩增中却因菌种和模板提取方法的不同而存在差异.

一种从鱼类肌肉组织中提取基因组DNA的简易方法

以泰山螭霖鱼、黄河鲤鱼、东平湖鲫鱼为材料,采用改进的酚-氯仿抽提法和蛋白酶K消化法提取基因组DNA,并对其进行紫外分光光度、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、微卫星PCR扩增等方法的鉴定。结果表明,本方法提取的鱼类基因组DNA浓度为0.9～3.25μg/μL,D260nm/D280nm值为1.79～1.87,电泳条带整齐明亮,适合微卫星PCR扩增。因此,本方法能够从鱼类肌肉组织中获得较为纯净的基因组DNA,适于进一步的分子生物学研究之用。

利用不同方法从深加工牦牛肉产品中提取基因组DNA效果的比较

为了从深加工牦牛肉产品中获得片段较大、数量较多的基因组DNA,以用于分子追溯的检测,尝试并系统地比较了异硫氰酸胍法、酚-氯仿抽提法和试剂盒提取法的提取效果。通过定量分析、凝胶电泳和PCR片段大小梯度扩增等手段,对利用3种方法提取的基因组DNA的数量和质量进行了比较。结果显示,利用酚-氯仿抽提法提取的基因组DNA质量不佳,异硫氰酸胍法和试剂盒提取法的提取效果相当,PCR可以扩增出730 bp左右的核外基因细胞色素b,而核内基因只能扩增出300bp左右的核基因DNA片段(内乳铁蛋白基因,271 bp;BoLA-DRB3基因,302 bp)。综合考虑提取时间、费用、数量和质量等各方面的因素,认为异硫氰酸胍法操作简便、快速、廉价、有效,是较好的从动物深加工肉产品中提取基因组DNA的方法。

猪源性成分检测中3种DNA提取方法比较

为了达到对动物源性成分快速、准确的检定,对提取动物源性基因组DNA的方法进行了比较分析。考察酚-三氯甲烷法、聚乙烯吡咯烷酮法(PVP法)和试剂盒法这3种方法对DNA提取的浓度、纯度及实时荧光PCR扩增效果的影响。结果表明:酚-三氯甲烷法提取DNA浓度最高,试剂盒法纯度最高且实时荧光PCR扩增效果最好,但PVP法操作简单、安全、经济,提取的DNA用于实时荧光PCR扩增检出限可达1.98 pg/μL。使用PVP法对市场上10份不同类型的动物性产品进行了检测,检出两份产品中含有猪源性成分。PVP法应是3种方法中的首选方法,本文为实验室选择合适的DNA提取方法提供了依据。

用改进的酚-氯仿法提取鱼类基因组DNA效果的分析

提取鱼类基因组DNA的研究报道并不多见,效果也各有差异。本文以泰山螭霖鱼、东平湖鲤鱼、东平湖鲫鱼为材料,采用改进的酚-氯仿法提取基因组DNA,并进行了紫外分光光度、琼脂糖凝胶电泳、微卫星PCR扩增等方法的鉴定。结果表明,本方法提取的基因组DNA浓度在0.9μg/μL^3.25μg/μL之间,A260/A280比值在1.79~1.87之间,电泳条带整齐明亮,适合微卫星PCR扩增,且整个操作过程使用试剂较少,简单易行。

改良酚-氯仿法提取及不同试剂盒扩增检测陈旧性人骨DNA

目的:探讨改良酚-氯仿法提取及不同试剂盒扩增对陈旧性人骨DNA检测的效果。方法:用传统和改良的酚-氯仿法对30例陈旧性人骨进行DNA提取,用Identifiler-plus试剂盒、Minifiler试剂盒和Godeneye TM 20A试剂盒行荧光标记和复合扩增,Genetic Analyzer软件对基因位点进行检测和分析。结果:改良酚-氯仿法提取及3种试剂盒对陈旧性人骨DNA基因位点检出469、262、588个,高于传统法的307、175、436个。结论:改良酚-氯仿法、3种试剂盒PCR复合扩增能对陈旧性人骨DNA进行有效提取和检测。