地龙提取物通过抑制wnt/β-catenin通路促进人卵巢癌细胞凋亡的实验研究

目的探讨地龙提取物对人卵巢癌细胞凋亡的影响及生物学机制。方法获取正常人卵巢上皮细胞和卵巢癌细胞,应用免疫组化检测细胞内wnt3a、β-catenin、c-Myc、Cyclin D1蛋白表达,应用PCR检测细胞wnt3a mRNA、β-catenin mRNA、c-Myc mRNA、Cyclin D1mRNA相对表达量,应用western-blot检测细胞wnt3a、β-catenin、c-Myc、Cyclin D1蛋白表达;分别应用终浓度400 mg/L和800 mg/L地龙提取物干预卵巢癌细胞生长72 h后、应用免疫组化检测细胞内wnt3a、β-catenin、c-Myc、Cyclin D1蛋白表达,应用PCR检测细胞wnt3a mRNA、β-catenin mRNA、c-Myc mRNA、Cyclin D1 mRNA相对表达量,应用western-blot检测细胞wnt3a、β-catenin、c-Myc、Cyclin D1蛋白表达,应用Tunel法分别检测卵巢癌细胞24、48、72 h凋亡率。结果与正常人卵巢上皮细胞比较,免疫组化结果显示卵巢癌细胞表达蛋白wnt3a[(5.61±1.13)分vs(0.79±0.21)分,t=9.60,P=0.00]、β-catenin[(5.27±1.40)分vs(0.74±0.25)分,t=7.12,P=0.00]、c-Myc[(4.15±1.70)分vs(1.10±0.30)分,t=3.88,P=0.01]、Cyclin D1[(5.42±1.90)分vs(1.00±0.38)分,t=5.07,P=0.00]均增多,PCR结果显示卵巢癌细胞wnt3amRNA[(7.20±2.12)倍vs(1.00±0.10)倍,t=6.92,P=0.00]、β-catenin mRNA[(6.44±1.27)倍vs(0.99±0.09)倍,t=10.03,P=0.00]、c-Myc mRNA[(3.65±1.10)倍vs(1.00±0.10)倍,t=5.26,P=0.00]、Cyclin D1mRNA[(6.50±1.72)倍vs(1.00±0.10)倍,t=20.44,P=0.00]相对表达量均增高,western-blot结果显示卵巢癌细胞wnt3a[(0.61±0.20)vs(0.18±0.10),t=4.00,P=0.00]、β-catenin[(1.24±0.43)vs(0.32±0.09),t=4.88,P=0.00]、c-Myc[(0.80±0.27)vs(0.11±0.08),t=4.95,P=0.00]、Cyclin D1[(0.51±0.18)vs(0.10±0.07),t=11.19,P=0.00]均增多;经地龙提取物干预后,免疫组化结果显示卵巢癌细胞表达蛋白wnt3a[0 mg组(5.80±1.40)分,400 mg组(3.10±1.00)分,800 mg组(1.60±0.30)分,F=22.28,P=0.00]、β-catenin[0 mg组(5.00±1.60)分,400 mg组(3.70±1.10)分,800 mg组(2.40±1.00)分,F=5.31,P=0.02]、c-Myc[0 mg组(4.60±2.11)分,400 mg组(3.58±1.75)分,800 mg组(1.20±0.40)分,F=6.49,P=0.01]、Cyclin D1[0 mg组(5.70±1.80)分,400 mg组(2.61±1.20)分,800 mg组(1.82±0.54)分,F=12.91,P=0.00]均降低,PCR结果显示卵巢癌细胞wnt3a mRNA[0 mg组(1.00±0.12),400 mg组(0.63±0.18),800 mg组(0.20±0.09),F=40.00,P=0.00]、β-catenin mRNA[0 mg组(1.00±0.09),400 mg组(0.41±0.09),800 mg组(0.10±0.08),F=112.10,P=0.00]、c-Myc mRNA[0 mg组(1.00±0.07),400 mg组(0.71±0.22),800 mg组(0.30±0.09),F=31.84,P=0.00]、Cyclin D1mRNA[0 mg组(1.00±0.10),400 mg组(0.48±0.20),800 mg组(0.23±0.09),F=40.83,P=0.00]相对表达量均减少,western-blot结果显示卵巢癌细胞表达蛋白wnt3a[0 mg组(1.33±0.42),400 mg组(0.81±0.30),800 mg组(0.10±0.08),F=20.96,P=0.00]、β-catenin[0 mg组(1.81±0.52),400 mg组(0.90±0.27),800 mg组(0.38±0.19),F=19.87,P=0.00]、c-Myc[0 mg组(1.41±0.40),400 mg组(0.28±0.10),800 mg组(0.10±0.06),F=40.83,P=0.00]、Cyclin D1[0 mg组(1.10±0.38),400 mg组(0.78±0.26),800 mg组(0.11±0.06),F=20.79,P=0.00]均减少,Tunel结果显示72h卵巢癌细胞凋亡率增高[0 mg组(2.17±1.10)%,400 mg组(17.20±3.65)%,800mg组(28.64±7.11)%,F=40.62,P=0.00]。结论地龙提取物可以通过抑制wnt/β-catenin通路来促进人卵巢癌细胞的凋亡,并且以终浓度800 mg/L为佳。

地龙及其注射液指纹特征谱研究

采用薄层扫描法建立了地龙药材及其注射液的指纹特征谱,为控制其质量提供了依据。

地龙规范化生产的研究概况

综合分析近年来地龙规范化生产的相关研究,重点针对地龙的种质资源调查、品种鉴定、人工养殖技术、采集加工和质量控制等关键问题进行评述。地龙规范化养殖相关研究取得了一定进展,但仍然存在着野生药用资源不足,药材品种混杂以及药材品质优劣参差不齐等问题。特别是缺少规范化养殖、产地加工和饮片炮制等关键技术的专项深入研究。因此,加强这方面的研究是今后研究的主攻方向和发展策略。

地龙有效成分对高糖下HMC细胞炎症因子分泌影响

目的观察地龙有效成分含药血清对HMC细胞炎症因子分泌的影响,并探讨其可能的作用机制。方法地龙有效成分及福辛普利干预高糖刺激HMC模型细胞,并设立正常组和高汤刺激组进行对照,应用MTT法检测HMC细胞生长抑制水平,酶联免疫法检测细胞培养液中TNF-α、IL-6和MCP-1的含量,应用RT-qPCR技术检测细胞样本的TNF-α、IL-6和MCP-1 mRNA表达水平。结果地龙有效成分组、福辛普利组HMC细胞生长平均抑制率下降(P<0.05);地龙有效成分、福辛普利干预后,细胞培养液中的TNF-α、IL-6和MCP-1含量均有下降趋势,与高糖刺激组比较,地龙有效成分组培养液中细胞TNF-αmRNA表达水平下降,MCP-1 mRNA表达水平上升,福辛普利组TNF-α、IL-6 mRNA表达水平明显下降。结论地龙有效成分对高糖下HMC细胞的干预作用可能是抑制细胞炎症因子分泌。

地龙注射液HPLC指纹图谱的研究

目的建立地龙注射液中游离氨基酸的HPLC指纹图谱。方法采用2,4-二硝基氟苯柱前衍生化法,用HPLC法进行梯度洗脱分析地龙注射液中游离的氨基酸。结果通过优化衍生条件,得到分离度、重复性均较好的HPLC指纹图谱,确定了14个共有峰,以缬氨酸为参照峰,用中药指纹图谱相似度软件计算不同批次样品的相似度均在0.97以上。结论本研究建立的指纹图谱,可用于地龙注射液的质量控制。

参环毛蚓中纤溶活性蛋白酶研究

分离纯化参环毛蚓中纤溶活性蛋白酶,并对其活性及氨基酸序列进行分析。采用凝胶层析等方法进行蛋白质的分离纯化,SDS-PAGE法进行分子质量的测定,纤维平板法测定纤溶活性,氨基酸自动分析仪分析氨基酸组成,并对一个具有纤溶活性的蛋白酶进行了序列分析。分离纯化得到4种酶,其中EQY-4活性较强,其N-端序列为:Gln-Ile-Gly-Gly-Thr-Asn-Ala-Ser-Pro-Gly-Glu-Phe-Pro-Pro-Gln-Leu-Ser-Gln-Thr。与文献报道中赤子爱胜蚓及粉正蚓中分离得到的蛋白酶对比,主要序列相近,但也有不同。

疏血通注射液对感染性休克患者组织灌注及预后的影响

目的观察疏血通注射液对感染性休克患者组织灌注及预后的影响。方法将80例感染性休克患者随机分为2组,对照组40例予常规治疗,治疗组40例在对照组治疗基础上应用疏血通注射液治疗,2组均治疗7 d。观察2组治疗前后尿量、乳酸、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、左室射血分数(LVEF)、心指数(CI),比较2组血管活性药物总用量及28 d病死率。结果 2组治疗后乳酸、BUN、Cr、AST、ALT均较本组治疗前降低(P<0.05),治疗组治疗后降低较对照组治疗后更明显(P<0.05);2组治疗后尿量、LVEF、CI均较本组治疗前增加(P<0.05),治疗组治疗后增加较对照组治疗后更明显(P<0.05)。治疗组多巴胺、多巴酚丁胺、去甲肾上腺素总用量少于对照组(P<0.05);治疗组28 d病死率低于对照组(P<0.05)。结论疏血通注射液可改善感染性休克患者的组织灌注,降低死亡率。

水蛭地龙注射液合大黄粉治疗慢性肾衰的临床观察

通过60例患者在常规治疗基础上加用水蛭地龙注射液的治疗,结果表明治疗组优于对照组。结论:水蛭地龙注射液与大黄粉合用,即加强了尿毒物质从肠道排出,抑制了肾小管萎缩和纤维组织增生,明显改善了患者慢性肾衰竭症状,延迟了进入透析时间。

HPLC法测定地龙注射液中苯酚的含量

目的 建立高效液相色谱法测定地龙注射液中苯酚的含量。方法 采用高效液相色谱法,色谱柱为Agilent C_(18)色谱柱,流动相为甲醇-水(60∶40),检测波长270 nm,流速1.0 mL·min^(-1),柱温30℃,进样量10μL。结果 苯酚浓度在26.59~425.44μg·mL^(-1)范围呈良好的线性(r=1);平均回收率(n=9)为98.52%;样品中苯酚含量为标示量的54%~60%。结论 此方法简便、准确,可用于地龙注射液中苯酚的含量测定。

浅议虫类药在咳喘病中的应用

虫类药是中草药的重要组成部分,其临床应用已有几千年的历史,功效逐渐被医家认知,应用范围不断拓展。近现代虫类药用于治疗咳喘病越来越受到医家的重视和广泛使用。临床实践表明常用虫类药具有疏风利咽、宣肺止咳,清肺化痰、解痉平喘,活血通络、息风止痛,温补肺肾、纳气定喘等功用。临床应在辨证论治基础上选药配伍,如蝉蜕、僵蚕适用于风热引起的咳喘;地龙、僵蚕适用于肺热、痰型咳喘;全蝎、蜈蚣适用于久病咳喘、血瘀痰阻明显,症状剧烈的咳喘或哮喘持续状态;蛤蚧、冬虫夏草则适用于久病体虚或年老体衰阴阳两虚的咳喘证。

HPLC法测定地龙注射液中主要氨基酸的含量

目的:建立测定地龙注射液中主要氨基酸含量的方法。方法:以6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(AQC)为衍生剂,与地龙注射液中的游离氨基酸柱前定量衍生,用HPLC法测定衍生物含量。结果:丙氨酸、缬氨酸、盐酸赖氨酸、异亮氨酸和亮氨酸在各自浓度范围内线性关系良好(r≥0.999 8),平均回收率102.6%～104.9%,RSD 0.3%～0.9%。结论:本法简便、准确,可用于地龙注射液的生产和质量控制。

水蛭地龙注射液对肾病综合征患者内皮素及D-二聚体的影响

目的 探讨水蛭地龙注射液(疏血通)对原发性肾病综合征(PNS)的治疗作用及对血浆内皮素(ET)、D 二聚体(DD)的影响。方法 将原发性肾病综合征患者68例随机分为治疗组及对照组各34例,对照组采用标准激素疗法及复方丹参注射液,治疗组在泼尼松治疗同时加用水蛭地龙注射液,治疗前及疗程结束后测定血浆ET及DD,比较各组在治疗前后其浓度变化。结果 治疗组与对照组在治疗后尿蛋白、血浆ET及DD浓度均较治疗前有显著降低,差异具有显著性,而对照组、治疗组在治疗前后分别比较差异无显著性(P>0. 05)。结论 水蛭地龙注射液可减少原发性肾病综合征患者内皮素的释放和D 二聚体的生成,对肾病综合征具有治疗作用。

郑邦本常用对药举隅

郑邦本老师常用黄芪60 g配伍益母草15～30 g治疗肾病综合征、肾炎综合征、慢性肾炎、糖尿病肾病;灵芝30 g配刺五加15 g对脾肾阳虚,体虚乏力,食欲不振,腰膝酸痛,失眠多梦等证尤为有效,常用于疲劳综合征、神经衰弱的治疗;苏子10 g配地龙10 g降气止咳平喘,常用于支气管哮喘、喘息性支气管炎的治疗;木香10 g配伍槟榔10 g行气宽肠,治疗腹胀、肛门坠胀疗效显著;益母草15～30 g配生山楂30 g活血通经,治疗月经量少、痛经、不孕症等;半枝莲30 g与垂盆草30 g清热利湿退黄,退黄与降酶并举,常用于治疗肝功能异常湿热证;血肉有情之品鹿角胶10 g配伍骨碎补15 g补肾强筋骨,用于骨质疏松、骨折术后愈合不佳、脑萎缩等病;穿山甲5～10 g配鹿角片5～10 g治疗乳腺增生、输卵管不通疗效显著;怀牛膝15 g配刘寄奴30 g治疗血瘀阻络引起的关节疼痛,用于风湿性关节炎、膝骨性关节炎、骨关节损伤疾病。上述对药为郑老师经过长期临床验证,效如桴鼓,具有可重复性,如能在辨证基础上正确运用,常能收到良好效果。

地龙提取物减弱矽尘诱导小鼠肺纤维化作用与a-SMA、TGF-β表达关系研究

目的研究地龙提取物减弱矽尘诱导的小鼠肺纤维化作用及与a-SMA、TGF-β表达的关系。方法选取的SPF BALB/c小鼠进行常规饲养,3组小鼠每组各20只采用随机数字表法将患矽尘病小鼠随机分组,正常鼠注射生理盐水作为空白组,矽肺鼠气管注射等量生理盐水作为模型组,矽肺鼠腹腔注射地龙提取物作为地龙提取物组,测定并记录小鼠0~5周内体质量具体变化情况,采用染色试剂染色后显微镜下观察肺纤维细胞增殖速率状况。采用RT-PCR荧光标记法检测TGF-β1及α-SMA mRNA的表达采用免疫荧光染色检测TGF-β1及α-SMA蛋白表达结果,探讨地龙提取物减弱矽尘诱导的小鼠肺纤维化作用及与a-SMA、TGF-β表达的关系。结果空白组小鼠od值为(0.328±0.0045),其肺纤维细胞增殖水平最低,模型组小鼠od值为(0.411±0.0100),其肺纤维细胞增殖水平最高,地龙提取物组小鼠od值为(0.359±0.0050),水平介于空白组与模型组之间,差异有统计学意义(χ2=14.9887,P=0.0006)。0~5周小鼠体质量呈现出增长趋势,第1、3、5周模型组小鼠体质量与空白组、地龙提取物组小鼠体质量比较有明显差异,差异有统计学意义(P<0.05)。小鼠肺纤维α-SMA蛋白表达水平空白组(1.000±0.019)明显低于模型组(1.739±0.101),模型组(1.739±0.101)明显高于地龙提取物组(1.463±0.047),比较存在差异且具有统计学意义(P<0.05)。TGF-β1蛋白表达水平,地龙提取物组(1.295±0.042)较模型组(1.521±0.091)明显偏低,比较存在差异且具有统计学意义(P<0.05)。空白组α-SMA、TGF-β1 mRNA相对表达量较模型组低,差异有统计学意义(P<0.05);经地龙提取物干预后,地龙提取物α-SMA、TGF-β1 mRNA相对表达量较模型组α-SMA、TGF-β1 mRNA相对表达量显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论研究结果表明地龙提取物可明显降低肺纤维化组织细胞基质外聚集与沉积的细胞质基质,能调控TGF-β1蛋白与α-SMA蛋白的有效表达,抑制肺纤维细胞增殖及肺组织细胞纤维化速率,加快细胞外细胞基质沉积降解,减缓肺组织细胞纤维化。

复方地龙片联合注射用血塞通治疗急性缺血性脑卒中的临床效果

目的分析复方地龙片联合注射用血塞通治疗急性缺血性脑卒中的临床效果。方法选取2019年11月至2020年11月我院神经内科收治的108例急性缺血性脑卒中患者,以双盲法将其随机分为对照组和研究组,各54例。对照组给予注射用血塞通治疗,研究组在对照组基础上联合复方地龙片治疗。比较两组的临床疗效及治疗前、后神经功能缺损情况、实验室相关指标。结果研究组的治疗总有效率为92.59%,显著高于对照组的77.78%(P<0.05)。治疗后,两组的NIHSS评分均显著低于治疗前,且研究组低于对照组(P<0.05)。治疗后,两组的全血高切黏度、血浆黏度、红细胞比容及纤维蛋白原、胆固醇水平均显著低于治疗前,且研究组低于对照组(P<0.05);治疗后,两组的甘油三酯水平无显著差异(P>0.05)。结论复方地龙片联合注射用血塞通治疗急性缺血性脑卒的效果显著,能够改善脑梗死高凝状态,促使患者神经功能恢复,具有较高的应用价值。

地龙舒腰胶囊的质量标准研究

建立了HPLC法测定地龙舒腰胶囊中薯蓣皂苷的含量。采用C18色谱柱,以乙腈-水(50∶50)为流动相。结果表明,薯蓣皂苷在7.2～720 g/ml范围内线性关系良好,平均加样回收率为103.4%。以亮氨酸和缬氨酸为对照,采用薄层色谱法鉴别了胶囊中的地龙,结果色谱斑点清晰,阴性无干扰。采用UV法对其中双酯型生物碱进行限度检查。结果 3批胶囊中双酯型生物碱均低于0.15%(以乌头碱计)。

柱前衍生化HPLC法测定疏血通注射液及其原药材中糖的含量

目的:测定疏血通注射液及其原药材水蛭、地龙中游离糖和多糖的含量。方法:采用PMP柱前衍生化法,对疏血通注射液及水蛭、地龙药材进行分析,色谱柱为Phenomenex Prodigy ODS-3(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相为20 mmol.L-1醋酸铵-乙腈,梯度洗脱;检测波长为254nm;流速为1.2 mL.min-1。结果:在确定的分析条件下,葡萄糖、甘露糖和半乳糖在测定范围内都有良好的线性,甘露糖的平均回收率为101%,葡萄糖的平均回收率为96.8%,半乳糖的平均回收率为97.3%。结论:该方法简便、准确、稳定,适合用于疏血通注射液及原药材中游离糖和多糖含量的测定。

复方地龙胶囊联合纤溶酶治疗急性脑梗死的临床研究

目的探讨复方地龙胶囊联合注射用纤溶酶治疗血栓性脑梗死的临床疗效。方法选择2019年9月—2020年9月在天津市北辰区中医医院治疗的94例急性脑梗死患者,根据用药的差别分为对照组(47例)和治疗组(47例)。对照组静脉滴注注射用纤溶酶,首次100单位加入生理盐水250 mL,1次/d,然后每次200单位加入生理盐水500 mL,1次/d;治疗组在对照组的基础上口服复方地龙胶囊,0.56 g/次,2次/d。两组患者均治疗10 d。观察两组患者临床疗效,比较治疗前后两组患者NIHSS、FIM、MoCA和MMSE评分及血清学指标同型半胱氨酸(Hcy)、可溶性血管细胞黏附因子1(s VCAM-1)、半乳糖凝集素3(GAL3)、血清趋化因子12(CXCL12)、神经特异性烯醇化酶(NSE)和神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)水平。结果治疗后,对照组总有效率为80.85%,显著低于治疗组的97.87%(P<0.05)。治疗后,两组患者NIHSS评分显著下降,而FIM评分、MoCA评分和MMSE评分均显著升高(P<0.05),且治疗组改善最明显(P<0.05)。治疗后,两组血清Hcy、sVCAM-1、GAL3、CXCL12、NSE、GFAP水平均明显下降(P<0.05),且治疗组患者下降最显著(P<0.05)。结论复方地龙胶囊联合注射用纤溶酶治疗血栓性脑梗死效果良好,可有效促进患者神经功能恢复,提高患者认知能力。