广地龙分子鉴定及与赤子爱胜蚓在不同提取方法下蚓激酶效价比较

目的探讨COI条形码鉴定和区分广地龙基原参环毛蚓和赤子爱胜蚓的适用性,探讨提取方法和物种对蚓激酶效价的影响。方法提取参环毛蚓和赤子爱胜蚓DNA,PCR扩增COI片段后进行测序和NCBI数据库比对。利用匀浆法和电击法获取参环毛蚓和赤子爱胜蚓蚓激酶粗提液。冷冻干燥后用生理盐水分别稀释成相同浓度,在纤维蛋白平板上测定和比较蚓激酶效价。结果COI条形码技术能够区分参环毛蚓和赤子爱胜蚓。提取方式相同,参环毛蚓蚓激酶效价高于赤子爱胜蚓。物种相同,电击法获得的蚓激酶效价均更高。结论序列比对结果与已知物种信息一致,使用电击法获取参环毛蚓蚓激酶具有更高效价。

基于UPLC-Q-TOF-MS/MS和HPLC的广东产广地龙鲜、干品主要化学成分分析

比较广东产的鲜、干广地龙化学成分差异,测定广地龙中次黄嘌呤、黄嘌呤、尿嘧啶的含量,建立广地龙质量评价标准。采用超高效液相色谱-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS/MS)技术分析鲜、干广地龙中主要化学成分,高效液相色谱法(HPLC)测定鲜、干广地龙次黄嘌呤、黄嘌呤、尿嘧啶的含量。结果表明,通过文献及实验室建立的数据库比对,干广地龙解析得56个化合物,其中11种游离氨基酸类,16种有机酸类,核苷类9种,9种二肽类及环二肽类,11种含氮类及其他类;鲜广地龙解析得到48个化合物,其中11种游离氨基酸类,17种有机酸类,10种核苷类,8种二肽类及环二肽类,2种含氮类及其他类。次黄嘌呤、黄嘌呤、尿嘧啶分离效果较好,标准曲线在线性范围线性良好(r=0.9999),平均加样回收率在98.36%~99.82%,相对标准偏差在0.25%~3.1%。本实验采用的UPLC-Q-TOF-MS/MS技术为鉴定鲜、干广地龙化学成分提供快速、高效的定性分析方法,HPLC法建立简单且快速、准确地测定次黄嘌呤、黄嘌呤、尿嘧啶定量方法。该研究为鲜、干广地龙的化学成分研究以及质量控制提供科学依据。

不同炮制工艺制备广地龙可溶性蛋白对HaCaT细胞的影响

目的以鲜广地龙及其不同炮制品包括净制品、炒制品及低温炮制品为研究对象,进一步考察不同炮制工艺对广地龙中可溶性蛋白含量、种类及HaCaT细胞增殖的影响。方法采用Bradford法和SDS-PAGE法,检测广地龙不同炮制品中蛋白质的含量和种类;用CCK-8法进行活性筛选,测定其对HaCaT细胞增殖的影响结果4种广地龙炮制样品可溶性蛋白含量由高到低排序为:鲜品>低温炮制品>净制品>炒制品。鲜品的蛋白条带数目最多,主要集中在27.75~145.07KD低分子量区;低温炮制品与鲜品的蛋白质主带基本一致,净制品和炒制品低分子量区蛋白条带数目明显少于其他两种炮制品。不同广地龙样品给药48 h,净制品组HaCaT细胞基本死亡,炒制品组HaCaT细胞全部死亡,鲜品组和低温炮制组均能促进HaCaT细胞增殖,且鲜品组促细胞增殖效果更显著。结论广地龙中促进HaCaT细胞增殖的主要活性成分是存在于低分子量区的蛋白质,其促增殖活性与蛋白质的含量和种类呈正相关。

HPLC测定不同产地广地龙中次黄嘌呤的含量

目的:测定不同产地广地龙中次黄嘌呤的含量。方法:采用反相高效液相色谱法,色谱柱:Inertsil ODS- EP柱,流动相:水-甲醇-四氢呋喃(93:7:0．05),流速:1．0 mL／min,检测波长254 nm。结果:次黄嘌呤的平均回收率为98．6％,方法精密度(RSD)为0．50％(n=6)。结论:该法可用于不同产地广地龙中次黄嘌呤的含量测定。

HPLC法测定各沪产地龙和广地龙中次黄嘌呤、黄嘌呤、尿嘧啶和尿苷的含量

目的测定各种沪产地龙与广地龙中次黄嘌呤、黄嘌呤、尿嘧啶、尿苷的含量,建立地龙药材质量评价的方法。方法用0.9%生理盐水超声提取地龙,SORBAX SB-Aq色谱柱（250 mm×4.6 mm,5μm,Aglient Co.,Ltd）,流动相：5mmol/L磷酸二氢钾（pH 2.9）,流速1mL/min,检测波长254nm,柱温30℃,进样量10μL,采用HPLC法,同时测定次黄嘌呤、黄嘌呤、尿嘧啶、尿苷4种核苷类成分的含量。结果次黄嘌呤的线性范围为0.500 0-100.00μg（r=0.999 9）,平均回收率99.37%,RSD=1.36%（n=6）;黄嘌呤的线性范围为0.500 0-100.00μg（r=0.993 1）,平均回收率91.57%,RSD=1.40%（n=6）;尿嘧啶的线性范围为0.500 0-100.00μg（r=0.999 9）,平均回收率95.31%,RSD=1.64%（n=6）;尿苷的线性范围为0.500 0-100.00μg（r=0.999 9）,平均回收率100.21%,RSD=1.98%（n=6）。结论该方法重复性、回收率好,可用于测定地龙与广地龙中次黄嘌呤等4种核苷类成分的含量。

参环毛蚓脂类挥发性成分分析

为了分析参环毛蚓(Pheretimaaspergillum)的脂类成分,我们采用不同溶剂索氏提取法、从该药材得到三种组分,用GC-MS法进行测定,确定了36种化合物的结构。在这三种组分中,乙醚组分中的11种成分均为脂类,不饱和脂肪酸的含量最高,占27.70%,如油酸、亚油酸、花生四烯酸和花生三烯酸。丙酮组分的脂类成分8种,占35.75%,不饱和脂肪酸只有亚油酸一种;乙醇组分的脂类成分13种,占72.09%,没有发现不饱和脂肪酸。本研究确定了参环毛蚓脂肪酸,尤其是不饱和脂肪酸的化学组成,为该中药化学物质基础的研究与药物的开发利用提供了依据。

重金属镉对参环毛蚓胃肠道上皮细胞超微结构损伤的研究

目的:研究不同浓度重金属镉离子胁迫下对参环毛蚓胃肠道结构的影响。方法:采用不同浓度镉离子胁迫参环毛蚓染毒、HE组织切片染色、光学显微镜及透射电镜下观察参环毛蚓胃肠道超微结构损伤的变化。结果:随着镉离子浓度的增加,参环毛蚓的肠道粘膜上皮细胞有大量溶酶体增生,高尔基复合体增生、扩张呈大泡状,微绒毛、纤毛排列不整齐、紊乱,当镉离子浓度达到30mg/kg时,参环毛蚓肠粘膜上皮细胞微绒毛出现萎缩,纤毛细胞出现溃疡坏死病灶,核膜解体、核质外溢,最后导致坏死。结论:参环毛蚓胃肠道粘膜上皮细胞超微结构的受损程度,是随土壤重金属的污染量而定。在较低重金属浓度条件下,参环毛蚓肠上皮细胞是以溶酶体增生、存积一定量的重金属元素的方式来应对其毒害作用,也可视为肠上皮细胞对有毒异物的一种应答反应,为可逆性损伤;而在较高重金属浓度条件下,肠上皮细胞是以微绒毛和线粒体损伤为主,核膜解体、核质外溢,最后导致坏死,为不可逆性损伤。由此推断,参环毛蚓对重金属的高耐受性或富集作用是通过其肠上皮细胞的这种特性来实现的。

参环毛蚓肠道内源性纤维素酶的分离纯化及酶学性质分析

通过对参环毛蚓肠道组织提取液进行DEAE阴离子交换及凝胶过滤层析，获得参环毛蚓单一的内源纤维素酶的活性组分．根据AlpHaEaseFC^TM软件计算出该组分分子质量约为45ku，命名为Cxl．羧甲基纤维素钠（sodium carboxymethylcellulose，CMC）法对Cxl进行酶学性质分析．分析结果显示：对于底物羧甲基纤维素钠，Cxl的米氏常数（Km）为0．289mg/mL，Vmax为0．446U·mL^-1·min^-1，反应最适温度为55℃，最适pH为6．0，在40～60℃、pH5．0～8．0具有较好的热稳定性和pH稳定性，其相对酶活力都能保持在55％以上．Ag^＋和Ba^2＋对Cxl起显著激活作用，K^＋、Zn^2＋、Mg^2＋、Ca^2＋、NH^4＋、Ni^2＋、Na^＋、Pb^2＋部分抑制酶活性，Cu^2＋离子对Cxl有完全抑制作用，而Fe^2＋对酶活力无明显影响．

广地龙特异性PCR分子鉴定

【目的】筛选出对广地龙具有特异性鉴别意义的PCR引物,建立一种快速、准确鉴别广地龙基原真实性的方法。【方法】收集药典收载的4种地龙原动物以及市场常见地龙混淆品6种,从Gen Bank数据库中下载有关蚯蚓的12Sr RNA基因序列,采用通用引物对10种样本PCR扩增后进行测序,依其序列间差异设计3对非保守区特异性引物,筛选对广地龙具有特异性扩增的引物。【结果】引物12St/12Sf对广地龙产生特异性扩增,当退火温度提升至64℃时,其反应表现出高度特异性,仅广地龙具有良好的单一扩增带,而其他样品在同样的条件下无扩增带。所得特异性引物在15种市售广地龙药材中验证结果良好,与传统形态学鉴定结果基本一致。【结论】引物12St/12Sf可作为广地龙物种鉴定的特异性标记物,可以实现广地龙近缘多个物种快速而又准确的鉴定,且不受实验材料的完整性、加工干燥等因素的影响。

地龙及其注射液指纹特征谱研究

采用薄层扫描法建立了地龙药材及其注射液的指纹特征谱,为控制其质量提供了依据。

十三种神经递质和神经肽在参环毛蚓神经系统的分布:免疫细胞化学研究

选择生活在我国的环节动物门典型代表参环毛蚓 (Pheretimaaspergillum)为研究对象 ,使用 13种抗体 ,运用免疫细胞化学染色技术 ,在光学显微镜下观察神经递质和神经肽阳性细胞的形态与分布。研究发现在参环毛蚓脑 ,ACTH阳性神经细胞、AVP阳性神经细胞、calcitonin阳性神经细胞、CCK阳性神经细胞、glutamate阳性神经细胞和NPY阳性神经细胞染色浓重 ,分布密集 ,位于脑的后侧半 ,尤其特别的是在calcitonin阳性大神经细胞内含有粗大密集的分泌颗粒。β EP阳性神经细胞染色较淡 ,OT阳性神经细胞染色也较深 ,但分布稀疏 ,calbindin D、CGRP、GABA、SOM、VIP呈阴性反应 ;在咽下神经节与腹神经节 ,仅有少量AVP阳性神经细胞、glutamate阳性神经细胞和NPY阳性神经细胞散在分布 ;在肠神经系统 ,β EP阳性神经细胞、CGRP阳性神经细胞、SOM阳性神经细胞、VIP阳性神经细胞染色较深 ,分布散在 ;另外 ,在肠上皮 ,CGRP阳性上皮细胞、cal citonin上皮细胞和VIP阳性上皮细胞呈强阳性反应 ,分布于阴性上皮细胞之间。结果表明参环毛蚓神经系统存在着在其它环节动物所观察到的神经递质和神经肽 :ACTH、VIP、β endorphin、CCK、NPY、CGRP ,亦存在着文献从未报道过的神经递质和神经肽 :calcitonin、AVP、OT、glutamate、SOM ,其?

广地龙中琥珀酸的毛细管电泳电导法测定

目的 建立毛细管电泳电导法测定广地龙中琥珀酸含量的方法。方法 以1．0mmoL／L Tris-10mmoL／L H3BP3-0．5％四乙烯五胺-0．025mmol／L十六烷基三甲基溴化铵为分离介质，使用未涂层融硅毛细管柱（50cm×75μm），分离电压-10kV，电导检测器检测。结果 琥珀酸的线性范围5．00～80．0μg/mL（r=0．9998），平均加样回收率98．4％，RSD=2．2％。结论 该法操作简便，快速。

参环毛蚓中纤溶活性蛋白酶研究

分离纯化参环毛蚓中纤溶活性蛋白酶,并对其活性及氨基酸序列进行分析。采用凝胶层析等方法进行蛋白质的分离纯化,SDS-PAGE法进行分子质量的测定,纤维平板法测定纤溶活性,氨基酸自动分析仪分析氨基酸组成,并对一个具有纤溶活性的蛋白酶进行了序列分析。分离纯化得到4种酶,其中EQY-4活性较强,其N-端序列为:Gln-Ile-Gly-Gly-Thr-Asn-Ala-Ser-Pro-Gly-Glu-Phe-Pro-Pro-Gln-Leu-Ser-Gln-Thr。与文献报道中赤子爱胜蚓及粉正蚓中分离得到的蛋白酶对比,主要序列相近,但也有不同。

参环毛蚓细胞原代培养灭菌方法的研究

【目的】选择最佳灭菌方法,建立参环毛蚓细胞原代培养实验体系。【方法】通过4因素和3水平的正交试验法考察不同浓度比例抗生素组合液对参环毛蚓细胞的灭菌效果,比较不同抗生素种类和浓度对参环毛蚓细胞原代培养的影响。【结果】以抗生素组合液200 U/mL青霉素钠+400μg/mL硫酸链霉素+300 U/mL硫酸庆大霉素+5μg/mL两性霉素B对组织块的灭菌效果最佳,10 d污染率为0%,且细胞能保持较好活性,并贴壁生长。【结论】组合式灭菌法是参环毛蚓细胞原代培养的最佳有效灭菌方法,且操作简捷易行。

地龙HPLC指纹图谱分析方法的研究

目的:建立地龙药材指纹图谱的测定方法。方法:采用HPLC法测定地龙药材0.9%生理盐水提取液的指纹图谱。结果:建立了地龙药材HPLC指纹图谱,确定了9个色谱峰为其共有峰。结论:利用地龙药材指纹图谱可以对地龙药材的质量进行全面控制。

参环毛蚓对土壤含水量及pH值因子的选择研究

目的考察参环毛蚓对土壤含水量、pH值二因子的选择性，建立其生活所需要的土壤含水量、pH值单因子数学模型。方法在养殖槽内设置不同土壤含水量、pH值区域，由参环毛蚓选择适宜的生活区域。结果参环毛蚓生活适宜的土壤含水量为18.2%-24.6%，pH值为3.7-5.5。结论参环毛蚓选择在湿度适中，偏酸性的土壤中生活；高湿及较干燥，强酸性和碱性的土壤不适宜其生活。

高效毛细管电泳法测定广地龙饮片中琥珀酸的含量

目的测定广地龙饮片中琥珀酸的含量。方法采用高效毛细管电泳法，以未涂层融硅毛细管（50cm×75μm）为分离柱，1mmol／L三（羟甲基）氨基甲烷·10mmol／LH38O3-0．5％四乙烯五胺-0．025mmol／L溴化十六烷基三甲胺（pH=11．45）体系为电泳介质，采用重力进样，进样时间15s，进样高度20cm，分离电压10kV。结果该方法的线性范围为5．00～80．00μg／mL，平均回收率为98．41％，RSD=2．21％（n=9），广地龙饮片（产地：广西）中的琥珀酸含量为0．8mg／g。结论方法可行，重现性好，能有效地控制广地龙饮片的质量。

地龙蛋白组分Ⅲ对鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤血管密度和MMP-9表达的影响

目的观察地龙蛋白组分Ⅲ对鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤血管密度和MMP-9表达的影响。方法裸鼠接种HNE1细胞形成移植瘤,至肿瘤体积达1cm×1cm×1cm后,随机分为地龙组和对照组,分别于腹腔注射地龙蛋白组分Ⅲ和生理盐水,连续用药20天,然后处死动物,测量鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤的体积重量,并制备组织切片,显微镜下计数瘤旁血管密度,免疫组化S-P法检测组织中金属基质蛋白酶9的表达活性。结果地龙组用药处理后,与对照组进行比较,地龙组裸鼠移植瘤的体积和重量均明显降低(P<0.05),瘤旁血管密度明显减少(P<0.05),金属基质蛋白酶9表达明显减弱(P<0.05)。结论地龙蛋白组分Ⅲ可能通过抑制金属基质蛋白酶9的表达活性和抑制瘤旁微血管的生长而抑制鼻咽癌细胞的转移潜能。

参环毛蚓不同部位细胞原代培养及鉴定

目的：筛选出参环毛蚓体内细胞培养的最佳部位,为建立参环毛蚓细胞原代培养方法提供实验基础。方法：分别提取参环毛蚓的皮、肠道、嗉囊、前列腺细胞进行培养,观察其细胞生长。结果：参环毛蚓的表皮和肠道细胞经培养后,细胞均有生长,并发现肠道细胞生长良好,5~6天后基本达到融合,细胞呈多边鹅卵石样,透明度及折光性强。另发现参环毛蚓的嗉囊、前列腺等部位的细胞没有增长迹象。结合形态学鉴定,原代培养及传代的细胞98%以上为肠上皮细胞。结论：参环毛蚓的肠道是建立细胞系的首选材料,采用此方法分离培养的肠上皮细胞数量多,均一性生长佳,可重复性强。

神经营养因子受体TrkA、TrkB、TrkC和TrkE在参环毛蚓体内的分布

高亲和性神经营养因子受体Trk ,广泛存在分布于哺乳动物神经组织。研究表明 :随着动物进化程度的降低 ,亚型Trk受体的类型有所减少 ;在低等动物 ,关于环节动物 (Annelida)Trk受体存在与否、分布如何尚未见报道。以我国环节动物门典型代表参环毛蚓 (Pheretimaaspergillum)为研究对象 ,运用免疫细胞化学染色技术 ,在光镜下观察TrkA、TrkB、TrkC和TrkE阳性细胞和纤维的形态与分布。发现Trk存在于参环毛蚓的神经系统和非神经组织。各亚型分布有所差异 ,TrkA阳性神经细胞存在于咽下神经节和肠神经系 ,阳性神经纤维存在于腹神经索和肠神经系 ;TrkB阳性细胞存在于非神经组织的肠上皮 ;TrkC阳性神经细胞存在于脑、咽下神经节和肠神经细胞 ,阳性神经纤维存在于围咽神经环、腹神经索和肠神经系 ;TrkE阳性神经细胞存在于脑、阳性神经纤维存在于咽下神经节和腹神经索。上述研究结果表明 :Trk存在于进化程度较低的环节动物 ,Trk在进化上具有悠久的历史。各亚型Trk受体的不同分布提示不同部位的神经细胞受不同神经营养因子的作用。