基于PI3K/AKT信号通路探讨益气养阴活血利水方抑制早期糖尿病视网膜病变大鼠微血管周细胞凋亡的作用机制

目的观察益气养阴活血利水方对早期糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)大鼠视网膜微血管周细胞中磷酸肌醇3-激酶蛋白(phosphatidylinositol 3-kiases,PI3K)/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(phospho-alpha serine/threonine-protein kinase,AKT)信号通路相关因子表达的影响,探讨益气养阴活血利水方抑制早期DR视网膜微血管周细胞凋亡的作用机制。方法138只雄性SPF级SD大鼠随机分成空白组(等体积蒸馏水),模型组,羟苯磺酸钙组[150 mg/(kg·d)],益气养阴活血利水方低剂量组[6.2 g/(kg·d)]、中剂量组[12.4 g/(kg·d)]、高剂量组[24.8 g/(kg·d)],每组23只。除空白组外,各组均采用链佐脲菌素腹腔注射并维持10周高血糖状态,诱导早期DR大鼠模型。造模成功后给药4周,取大鼠眼球进行检测。采用HE染色观察视网膜病理变化,采用TUNEL染色检测大鼠视网膜微血管周细胞凋亡,采用免疫组织化学法及RT-PCR法检测PI3K、AKT、Bcl-2相关X蛋白(Bcl2-associated X protein,Bax)、胱天蛋白酶-8(cysteine aspartic acid specific protease-8,Caspase-8)、胱天蛋白酶-3(cysteine aspartic acid specific protease-3,Caspase-3)、细胞凋亡死亡激动剂BID蛋白(apoptotic death agonist BID protein,Bid)在视网膜微血管周细胞中的蛋白和mRNA表达水平。结果与空白组比较,模型组大鼠血糖显著升高(P<0.01),体质量显著降低(P<0.01),视网膜层次结构不清,各层细胞排列疏松,可见大量凋亡细胞,视网膜中PI3K、AKT mRNA表达水平下降(P<0.01),视网膜细胞凋亡数及Bax、Caspase-8、Caspase-3、Bid mRNA表达水平明显升高(P<0.05)。与模型组比较,益气养阴活血利水方中剂量、高剂量组大鼠血糖均降低(P<0.01);羟苯磺酸钙组、益气养阴活血利水方各剂量组大鼠体质量均升高(P<0.01);益气养阴活血利水方各剂量组大鼠视网膜组织层次结构较清楚,细胞排列相对紧密,视网膜微血管周细胞凋亡数下降(P<0.05);益气养阴活血利水方高剂量组大鼠视网膜微血管周细胞中PI3K、AKT蛋白和mRNA表达水平均明显升高(P<0.01),Bax、Caspase-8、Caspase-3、Bid蛋白和mRNA表达水平均明显下降(P<0.05)。结论益气养阴活血利水方可能通过调控PI3K/AKT信号通路,上调PI3K、AKT,下调Bax、Caspase-8、Caspase-3、Bid的表达,抑制早期DR大鼠视网膜微血管周细胞的凋亡,从而发挥其对早期DR视网膜微血管周细胞凋亡的保护作用。

一种新的瘦素抵抗机制:非酒精性脂肪肝瘦素/PI3-K/Akt信号通路的激活缺陷

目的:研究瘦素、瘦素受体(obesity receptor,OB-R)以及PI3-K/Akt信号通路在非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)患者体内的表达.方法:应用免疫组织化学方法研究30例NAFLD患者及对照组肝组织中瘦素,OB-R,PI3-K(p85)及Akt的表达以及其相关性.同时检测空腹血糖、总胆固醇、甘油三酯、C肽和血清瘦素水平等.结果:NAFLD患者肝组织中瘦素,OB-R和PI3-K显著高于对照组(P<0.05),且与血清瘦素水平成正相关.NAFLD患者肝组织中Akt的表达显著低于对照组(P<0.05).此外,PI3-K的表达与瘦素(r=0.365,P<0.05)呈正相关,但与Akt呈负相关(r=-0.854,P<0.01).结论:瘦素的过度表达不能活化NAFLD患者的Akt,瘦素/PI3-K激活Akt的缺陷可能是NAFLD患者瘦素抵抗的一种新机制.

鞘内注射GDNF对神经病理性疼痛大鼠脊髓水平p-Akt表达的影响

目的:探讨神经病理性疼痛大鼠脊髓水平p-Akt的表达变化及鞘内给予胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)后对其表达的影响。方法:实验1:SD雄性大鼠分为对照组和CCI组。CCI组又分为术后1 d组(D1组)、术后3 d组(D3组)、术后7 d组(D7组)和术后14 d组(D14组)。分别于术后1、3、7、14 d测定热缩足潜伏期(thermal withdrawal latency,TWL)后处死并取其脊髓背角,采用Western blot方法测定Akt(p-Akt)蛋白表达情况。实验2:SD雄性大鼠分为对照组、D14'组、D14'+PBS组、D14'+GDNF组。与实验1相同时间点测定TWL,并于第14 d处死,取其脊髓背角,采用Western blot和免疫组化法检测p-Akt表达变化。结果:与对照组相比,CCI组大鼠TWL明显降低(P<0.01);与D14'组和D14'+PBS组相比,D14'+GDNF组大鼠TWL明显升高(P<0.01)。CCI组脊髓组织中p-Akt表达水平于术后3 d开始升高,一直持续到术后14 d(P<0.01);D14'+GDNF组p-Akt表达水平较D14'组和D14'+PBS组显著下降(P<0.05)。结论:大鼠脊髓组织中Akt信号通路可能参与了神经病理性疼痛的发生,鞘内注射GDNF减轻神经病理性疼痛与降低脊髓组织p-Akt的水平有关。

黄芪注射液及其有效成分对乳腺癌细胞增殖和Akt磷酸化的影响

目的:观察黄芪注射液、黄芪甲苷、芒柄花素对 basal-like 乳腺癌细胞株 MDA-MB-468和 MDA-MB-231增殖和磷酸化 Akt(phospho-Akt(?)p-Akt)蛋白表达的影响。方法:用不同浓度的黄芪注射液、黄芪甲苷和芒柄花素对乳腺癌细胞株 MDA-MB-468和 MDA-MB-231进行干预,以不加药物干预的细胞作为空白对照。用甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法观察药物对细胞增殖的怍用。再选取药物抑制细胞增殖的最佳浓度,用细胞内蛋白质印迹法观察对 p—Akt(Thr308)和 p-Akt(Ser473)蛋白表达水平的影响。结果:根据 MTT 比色法实验结果确定黄芪注射液、黄芪甲苷、芒柄花素和黄芪甲苷配伍芒柄花素的最佳浓度,黄芪注射液终浓度为生药含量1 g/mL,黄芪甲苷终浓度为80 μg/mL,芒柄花素终浓度为40 μg/mL,黄芪甲苷:芒柄花素为1:4.干预 MDA-MB-468细胞1d 后,各用药组 p-Akt(Thr 308)和 p-Akt(Ser 473)蛋白表达水平下调,与阴性对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);药物干预2 d 后,各用药组 p—Akt(Thr 308)水平显著下调(P<0.05),其中以芒柄花素组、黄芪甲苷+芒柄花素组下调最为明显;芒柄花素和黄芪甲苷+芒柄花素明显下调 p-Akt(Ser 473)蛋白表达。干预 MDA-MB-231细胞1 d 后,与阴性对照组比较,芒柄花素组和黄芪甲苷+芒柄花素组 p-Akt(Thr 308)蛋白水平有明显的下调;在药物干预2 d 后,黄芪注射液、芒柄花素和黄芪甲苷+芒柄花素组 p-Akt(Thr 308)蛋白水平都有明显下调。各用药组 p-Akt(Ser 473)蛋白水平与阴性对照组比较,差异无统计学意义。结论:黄芪注射液、黄芪甲苷、芒柄花素对乳腺癌细胞株 MDA-MB-468和 MDA-MB-231均有抑制增殖的作用,但抑制作用程度及其浓度存在差异,其抑制细胞增殖的机制可能与下调 Akt 的磷酸化有关。

磷酸化丝／苏氨酸蛋白激酶B在小鼠过敏性气道反应肺组织炎性细胞中的差异表达

目的：探讨丝／苏氨酸蛋白激酶B（Akt）在过敏性小鼠肺组织不同炎性细胞中的活化状况。方法：应用卵蛋白致敏激发BALB／c小鼠制备过敏性气道炎症反应模型，抽取肺泡灌洗液（BALF）进行细胞总数计数和不同炎性细胞分类计数，应用免疫组织化学检测磷酸化Akt（p-Akt）在过敏性小鼠肺组织中不同炎性细胞的表达。结果：过敏性小鼠BALF中总细胞数明显高于正常鼠；分类细胞计数中，正常组以巨噬细胞为主，而过敏性小鼠的嗜酸性粒细胞、淋巴细胞百分比明显升高；免疫组织化学显示p-Akt在过敏性小鼠气道中嗜酸性粒细胞中表达明显高于淋巴细胞和巨噬细胞，而在淋巴细胞中表达明显高于巨噬细胞。结论：Akt在过敏性小鼠的气道炎症中的作用与炎性细胞的种类密切相关，发挥不同的诱导嗜酸性粒细胞和巨噬细胞增多、趋化、释放炎性细胞因子和对抗淋巴细胞凋亡等重要的作用。

CD160在慢性淋巴细胞白血病中的生物学特征研究

目的探讨CD160在慢性淋巴细胞白血病中的表达及临床意义。方法应用流式细胞仪检测22名健康对照者、91例CLL患者、76例B细胞非霍奇金淋巴瘤CD160的表达。同时检测91例CLL患者和22名对照者PTEN、p-Akt的表达。结果22名健康对照1例(4.5%)CD160呈弱阳性。91例CLL患者89例(97.80%)CD160阳性,远高于对照组,差异有统计学意义(χ2=89.38,P<0.01)。CLL患者PTEN蛋白较对照组表达明显减低,p-Akt表达较对照组显著增高,且CLL患者CD160表达水平与p-Akt表达水平呈正相关,而与PTEN表达水平呈负相关。76例淋巴瘤患者5例(6.58%)CD160阳性,分别为4例HCL,1例SMZL。48例MCL患者CD160均阴性。CD160在CLL中的阳性率远高于淋巴瘤,差异有统计学意义(χ2=140.06,P<0.01)。CLL与MCL免疫表型差异主要是CD23与FMC7的阳性率不同,CD160在CLL中的阳性率远高于MCL,差异有统计学意义(χ2=130.51,P<0.01)。四格表诊断性试验分析显示,CD160在CLL中的敏感度为97.80%,特异性为90.79%,准确度为94.61%。CD160在CLL患者高表达与临床预后无关。结论 CD160在CLL细胞中普遍高表达,有助于CLL的诊断和鉴别诊断。

p-AKT、p-mTOR、eIF-4E、Ki67在子宫内膜腺癌中的表达及其临床意义

目的 探讨子宫内膜癌中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）通路的关键因子磷酸化丙氨酸氨基转移酶（phospho-AKRmouseT-cellymphoma oncoprotein,p-AKT）、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）、真核细胞翻译起始因子4E（eukaryotic initiation factor 4E,eIF-4E）及增殖细胞核抗原（nucleoprotein antigen Ki67,Ki67）在子宫内膜腺癌中的表达及其临床意义.方法 采用免疫组织化学染色（SP法）检测56例子宫内膜腺癌、28例子宫内膜不典型增生、19例正常子宫内膜组织中p-AKT、p-mTOR、eIF-4E、Ki67的表达情况并分析其之间的相关性.结果 p-AKT、p-mTOR、eIF-4E、Ki67在对照组、内膜不典型增生组、子宫内膜腺癌组中的表达有增强趋势,且4个检测因子在3组之间的阳性表达差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 子宫内膜腺癌中存在mTOR通路异常高表达.p-AKT、p-mTOR、eIF-4E以及Ki67基因表达的变化参与了子宫内膜腺癌的发生发展,可以作为子宫内膜腺癌发生发展的监测指标.

小鼠皮肤损伤愈合过程中PI3K/Akt通路的作用

目的探讨小鼠皮肤损伤愈合过程中损伤区磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)、磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶(phospho-PI3K,p-PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又称Akt)和磷酸化蛋白激酶B(phospho-Akt,p-Akt)的表达及其随时间的变化规律。方法应用免疫组织化学染色、Western印迹法和real-time PCR技术检测小鼠皮肤损伤不同时间段PI3K、Akt、p-PI3K及p-Akt的变化情况。结果免疫组织化学染色显示,皮肤损伤后,PI3K、p-Akt阳性染色出现在单核细胞和成纤维细胞,峰值出现在组织修复期。Western印迹法显示,各个时间段均有PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt的阳性条带,其中p-PI3K、p-Akt表达的峰值出现在炎症期和增生期,PI3K、Akt表达的高峰出现在组织重建期。real-time PCR结果显示,PI3K m RNA的峰值出现在炎症期和组织重建期,Akt m RNA的峰值出现在组织重建期。结论在皮肤损伤愈合过程中,PI3K、Akt、p-PI3K及p-Akt的表达变化呈现不同的规律性并有较好的时间依赖性,PI3K/Akt通路的表达规律可以用于法医学损伤时间推断。

miRNA-200c通过抑制Akt通路提高胃癌SGC7901/DDP细胞对顺铂的敏感性

目的:研究miRNA-200c对人胃癌耐药SGC7901/DDP细胞顺铂敏感性的影响及其机制。方法:Western blotting检测SGC7901/DDP及其亲代SGC7901细胞E-cadherin、PTEN、p-Akt及总Akt蛋白的表达;瞬时转染miRNA-200c前体(miR-NA-200c precursor,Pre-200c)提高SGC7901/DDP细胞miRNA-200c的表达,MTT法检测转染后SGC7901/DDP细胞对顺铂的敏感性,并分析p-Akt表达的改变;应用Akt通路抑制剂LY94002处理SGC7901/DDP细胞抑制Akt磷酸化,检测处理后细胞对顺铂的敏感性。结果:与SGC7901细胞相比,SGC7901/DDP细胞中p-Akt蛋白的表达量显著增高(1.02±0.09 vs 0.17±0.02,P<0.05),E-cadherin、PTEN蛋白的表达量显著降低(0.10±0.03 vs 0.47±0.06,0.18±0.06 vs 0.87±0.06;均P<0.05)。转染Pre-200c后,顺铂对SGC7901/DDP细胞的IC50显著低于对照组[(7.52±0.19)vs(12.18±0.29)mg/L,P<0.05],细胞中p-Akt蛋白的表达量也显著低于对照组(0.22±0.04 vs 0.69±0.09,P<0.05);LY94002处理后,SGC7901/DDP细胞p-Akt蛋白的表达显著抑制(0.18±0.06 vs 0.66±0.10,P<0.05),顺铂对细胞的IC50显著低于对照组[(6.80±0.28)vs(11.94±1.73)mg/L,P<0.05]。结论:SGC7901/DDP细胞的耐药可能与E-cadherin和PTEN蛋白的表达缺失及Akt通路的异常激活有关,而miRNA-200c提高该细胞对顺铂的敏感性可能是通过抑制Akt通路而发挥作用。

腋窝淋巴结阴性乳腺癌组织中PTEN、p-Akt、P-gp表达及意义

目的进一步探讨磷酸化Akt(p-Akt)、人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(PTEN)及多药耐药蛋白P-糖蛋白(P-gp)在乳腺癌发生、发展中的作用。方法采用免疫组化法检测81份腋窝淋巴结阴性(LNN)乳腺浸润性癌组织标本中p-Akt、PTEN及P-gp表达,采用四格表的χ2检验、确切概率法和Cox比例风险模型分析三者与乳腺癌临床病理因素的关系。结果 LNN乳腺癌组织中p-Akt阳性表达率明显高于癌旁组织(P=0.034);PTEN阳性表达率显著低于癌旁组织(P=0.001);p-Akt过表达与PTEN低表达均与肿瘤分化、雌激素受体(ER)阴性、复发转移和5年生存率有关。P-gp在LNN乳腺癌组织中阳性表达率为39.5%,与肿瘤复发转移显著有关。多因素分析发现,p-Akt和PTEN是影响预后的独立因素,且p-Akt与P-gp表达呈正相关(r=0.548,P=0.045)。结论 p-Akt、PTEN及P-gp均参与了乳腺癌的发生、发展,检测三者水平有助于患者预后判断。

肿瘤抑制基因、磷酸化AKT、细胞周期素D1在肺鳞癌和腺癌中不同的表达及与临床病理因素的相关性

目的探讨AKT信号转导通路中有关蛋白肿瘤抑制基因（PTEN）、磷酸化AKT（p-AKT）及细胞周期素D1（CyclinD1）在原发性肺鳞癌和腺癌中不同的表达意义及与临床病理因素的相关性。方法应用免疫组化的方法，检测原发性肺鳞癌44例、腺癌36例及35例非肿瘤性肺组织标本中PTEN、p-AKT、CycllnD1的表达，并与临床病理因素进行相关性分析。结果p-AKT、CyclinD1在肺鳞癌和腺癌中总的阳性率分别为78．8％、76．3％，均显著高于非肿瘤性肺组织中阳性表达0％（均P〈0．05）。PTEN在肺鳞癌和腺癌中总阳性率为47．5％，显著低于非肿瘤性肺组织中阳性表达94．3％（P〈0．05）。PTEN、P—AKT、CycllnD1在肺鳞癌和腺癌中的表达差异均无统计学意义（均P〉0．05）。PTEN表达与有无淋巴结转移和组织的高分化有关。p-AKT在高中分化腺癌中阳性表达显著高于低分化腺癌的表达。CyclinD1表达与淋巴结转移、鳞癌的低分化有关。在肺鳞癌和腺癌中，p-AKT蛋白的表达均与CyclinD1呈正相关。肺鳞癌中，PTEN表达与P，AKT、CyclinD1呈负相关；肺腺癌中，PTEN表达与p-AKT、CyclinD1均无相关关系。结论在肺鳞癌和腺癌中均存在AKT及其通路的激活。PTEN的失活参与了肺鳞癌和腺癌的发生和发展。在肺鳞癌中，AKT的激活与PTEN的失活有关；在肺腺癌中，PTEN的失活可能不是AKT活化的主要原因。在肺鳞癌和腺癌中可能存在不同的AKT活化机制。

Akt信号通路在紫绀型先天性心脏病患儿心肌慢性缺氧适应中的作用

目的:探讨Akt信号通路在紫绀型先天性心脏病患儿心肌慢性缺氧适应中的意义。方法:收集紫绀型和非紫绀型先天性心脏病患儿共50例,其中紫绀型26例(紫绀组),动脉血氧饱和度(SaO2)60%～89%;非紫绀型24例(非紫绀组),SaO2>95%,均不伴肺动脉高压[肺动脉收缩压<30mmHg(1mmHg=0.133kPa)]。心脏外科手术体外循环前留取右心耳组织,应用Western blot方法检测心肌组织蛋白激酶B(总Akt)和磷酸化蛋白激酶B(Ser473P-Akt)表达水平,免疫组织化学技术检测心肌组织总Akt和Ser473 P-Akt蛋白表达部位与水平。结果:与非紫绀组相比,紫绀组患儿心肌组织Ser473P-Akt蛋白表达水平明显增高(P<0.01),而2组患儿总Akt蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。紫绀组患儿心肌组织Ser473P-Akt蛋白大部分表达在心肌细胞的胞质,胞核亦有微弱表达,而非紫绀组心肌细胞则无明显Ser473P-Akt蛋白表达。2组患儿总Akt蛋白绝大部分也表达在心肌细胞的胞质,胞核亦有微弱表达,但表达部位和水平差异无统计学意义。紫绀组患儿心肌组织Ser473 P-Akt蛋白表达水平与患儿术前SaO2呈负相关(r=-0.771,P<0.01)。结论:Akt信号通路激活可能是紫绀型先天性心脏病患儿心肌慢性缺氧适应的重要信号调控机制之一。

磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/糖原合成酶激酶3β信号通路对胰岛β细胞凋亡调控作用的研究进展

磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/糖原合成酶激酶3β(PI3K/Akt/GSK3β)是胰岛素下游信号转导通路中重要的信号分子,其对于胰岛β细胞数量和功能的维持发挥重要的作用。本文回顾了胰岛素刺激下的PI3K/Akt/GSK3β信号通路的分子机制,及可能在胰岛β细胞凋亡过程中的作用。

克林澳注射液对大鼠脑缺血后神经细胞凋亡及磷酸化Akt蛋白表达的影响

目的动态观察SD大鼠局灶性脑缺血再灌后神经细胞凋亡的变化及磷酸化Akt蛋白的表达并探讨克林澳注射液（简称克林澳）对其保护作用。方法用线栓法制备局灶性大脑中动脉缺血再灌注模型，以尼氏染色观察大鼠脑缺血再灌后皮质存活神经元，末端转移酶介导的缺口末端标记（TUNEL）方法检测神经细胞凋亡，免疫组化（SABC）方法检测磷酸化Akt蛋白表达。结果克林澳组再灌12h后各时间点半暗带区神经元较模型组多（P〈0.01），TUNEL阳性细胞数显著减少（P〈0.01），磷酸化Akt阳性细胞数明显增加（P〈0.01）。结论减少神经元凋亡，上调磷酸化Akt蛋白表达可能是克林澳保护脑缺血损伤的机制之一。

菠萝蛋白酶预处理对大鼠心肌缺血-再灌注损伤的保护作用

目的探讨菠萝蛋白酶(Br)对大鼠心肌缺血-再灌注(I-R)损伤的保护作用。方法 32只雄性SD随机均分4组:A组假手术对照;其他3组开胸穿线阻断左前降支(LAD)冠状动脉30min后再灌注2h建立心肌I-R损伤模型。B组缺血前连续15d腹腔注射磷酸盐缓冲液(PBS)预处理;C组改用含Br的PBS腹腔注射预处理;D组仅结扎LAD30min,I-R2h。连续心电图监测ST段改变,再灌注2h末抽血检测血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)与乳酸脱氢酶(LDH),用伊文思蓝及2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)双重染色方法测定心肌梗死(MI)及缺血面积,TUNEL法测心肌细胞凋亡指数(AI),Westernblot法检测磷酸化蛋白激酶B(P-AKT)表达。结果 C组CK-MB、LDH、MI面积和心肌细胞AI明显小于B、D组,而P-AKT的表达高于B、D组(P<0.01)。结论 Br预处理可通过增加P-AKT的磷酸化而对I-R心肌起保护作用。