漳州琯溪蜜柚果实黑斑病菌的分子鉴定

2008年从漳州采集到疑似由柑橘球座菌(Guignardia citricarpaKiely)引起的黑斑病症状的溪琯蜜柚(Citrus grandis(Linn.)Osbeck cv.guanxi-miyou)果实。使用柑橘球座菌(G.citricarpa)特异引物对该果实上的病斑进行PCR检测及序列分析。PCR检测结果表明从溪琯蜜柚果实病斑上扩增到约490bp的条带。序列分析结果表明,与已知的亚洲柑橘叶点霉(Phyllosticta citriasiana)、G.citricarpa和G.mangif-erae的相应序列同源性分别为99.8%、98.2%和94.0%。该序列含有部分的内转录间隔区1(ITS1)、5.8S核糖体RNA基因(5.8S rRNA)和部分的内转录间隔区2(ITS2)序列。结果表明,引起溪琯蜜柚果实病害的病原菌并不是G.citricarpa,而是一种新描述的病原菌——亚洲柑橘叶点霉(Phyllosticta citriasianaWulan-dari,Crous&Gruyter),该病原菌引起的病害称为柑橘褐斑病。

柑橘黑斑病新病原亚洲柑橘叶点霉生物学特性

亚洲柑橘叶点霉Phyllosticta citriasiana是近年发现的侵染柚类柑橘的黑斑病病原菌新种,其生物学特性尚不明确,为此测定了培养基种类、光照、温度、pH值等培养条件对该菌菌丝及分生孢子的影响。结果表明：该病菌在燕麦琼脂培养基和含柚叶汁液的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上生长较快,黑暗不利于病菌生长,菌丝适宜生长温度为25-30℃,菌丝最适生长pH值是6-7,菌落在碱性的燕麦培养基上生长有黄色晕圈,试验研究中分生孢子萌发率较低,菌丝致死温度为55℃,分生孢子致死温度为55℃。

琯溪蜜柚黑斑病侵染循环及防治适期研究

琯溪蜜柚黑斑病(pomelo black spot)的病原菌为亚洲柑橘叶点霉Phyllosticta citriasiana。田间系统观察和病原菌侵染试验结果表明,蜜柚黑斑病是一种潜伏侵染病害,上年度被侵染的带菌叶片为次年病害的侵染源,蜜柚花期至幼果期是病菌侵染盛期和病害防治适期。如果错过这两个时期,将难以达到理想的防治效果。

柚黑斑病菌的生长特性及寄主范围测定

【目的】明确‘琯溪蜜柚’黑斑病菌（Phyllosticta citriasiana）的分生孢子萌发和菌丝生长的最佳条件及寄主范围,为了解病害的发生规律及制定防控策略提供理论参考。【方法】测定P.citriasiana分生孢子在疏水性基层表面及不同萌发条件下的萌发率差异;分析菌丝在不同培养条件下的生长速率差异;并采用人工刺伤接种法测定菌丝对28份芸香科植物的致病性。【结果】P.citriasiana分生孢子在水溶液和1%葡萄糖溶液中24 h的萌发率低（8.3%和25.3%）,而48 h的萌发率高（52.7%和61.4%）。0.7 mol·L-1Na Cl溶液对分生孢子萌发具有显著抑制作用,72 h的萌发率仅为16.4%。菌丝在2%山梨醇燕麦培养基（SOA）生长最快,菌落直径达4.9 cm（9 d）,在燕麦培养基基（OA）、马铃薯蔗糖培养基（PSA）和完全培养基（CM）上的生长速率次之。菌丝在25~30℃、黑暗或光照（24 h·d-1）条件下生长快,而在温度≤20℃或≥35℃条件下,菌丝生长速率显著降低或停止生长。菌丝或分生孢子悬浮液经55℃水浴处理15 min后,均失活。人工接种试验表明,P.citriasiana除侵染‘琯溪蜜柚’外,还可侵染柚类的‘龙柚1号’‘龙柚2号’和‘坪山柚’,柠檬类的‘费米耐劳白花2号’柠檬、‘五峰2号’柠檬和‘海南药用’柠檬以及葡萄柚。【结论】连续阴雨天气和25~30℃的气候条件有利于果园中P.citriasiana分生孢子的萌发和菌丝生长,以及病原菌的侵染和传播。在自然条件下部分柚类、柠檬类植物以及葡萄柚是P.citriasiana的潜在寄主,有待进一步的田间调查验证。

琯溪蜜柚黑斑病拮抗细菌分离及鉴定

为获得琯溪蜜柚黑斑病菌Phyllosticta citriasiana的拮抗微生物,从平和琯溪蜜柚园采集土样19份,经室内分离、纯化及筛选,获得了对琯溪蜜柚黑斑病菌具有拮抗作用的18株细菌,其中拮抗作用最强的为菌株BC12,其对黑斑病菌的抑菌率为55.84%。对疮痂病菌Sphaceloma fawcetti、炭疽病菌Colletotrichum gleosporioides、黄斑病菌Mycosphaerella cirri这3种琯溪蜜柚果园常见的病原菌均有不同程度的拮抗作用,表现出一定的抗菌活性。菌落形态观察、生理生化特性测定以及16S r DNA序列分析的结果表明,BC12为短小芽孢杆菌Bacillus pumilus。

柑橘黑斑病菌与柚黑斑病菌对苯并咪唑类杀菌剂的抗性及其分子机制

为了对柑橘黑斑病和柚黑斑病提出更科学的化学防治方法,该文研究了柑橘黑斑病菌和柚黑斑病菌对杀菌剂多菌灵的抗性频率、抗性水平及其抗性分子机制。结果表明:在江西114个柑橘黑斑病菌株中发现了2个多菌灵抗性菌株,抗性频率为1.75%,抗性系数分别为5333.6和379.2;在四川32个柑橘黑斑病菌株中发现了1个多菌灵抗性菌株,抗性频率为3.13%,抗性系数为303.3;在浙江23个菌株和重庆3个菌株中没有出现抗性菌株。在广东收集的54个柚黑斑病菌株中发现了1个抗性菌株,抗性频率为1.85%,抗性系数为13719.5;在广西和福建分别收集的34个柚黑斑病菌株中没有发现抗性菌株。柑橘黑斑病菌和柚黑斑病菌对甲基硫菌灵和多菌灵存在正交互抗性,对嘧菌酯和多菌灵无交互抗性。因此,建议多菌灵可继续在柑橘黑斑病和柚黑斑病防治中使用,鉴于高抗菌株已出现,使用时应与其他作用机制的杀菌剂轮换使用。本实验还发现,柑橘黑斑病菌存在2种抗苯并咪唑类的分子机制,即β-微管蛋白基因上第198位氨基酸位点由谷氨酸突变为赖氨酸(抗性系数为5333.6的菌株)和第200位氨基酸位点由苯丙氨酸突变为酪氨酸(抗性系数为379.2的菌株);而柚黑斑病菌抗苯并咪唑类的分子机制则与β-微管蛋白基因第198位氨基酸由谷氨酸突变为丙氨酸有关。

小串链霉菌XG40菌株发酵条件优化及其次生代谢产物性质研究

为进一步提高小串链霉菌Streptomyces catenulae XG40对琯溪蜜柚黑斑病的生防效果,通过碳、氮源单因子试验、正交试验和发酵条件优化,以菌浓度和抑菌带宽为指标确定其最佳发酵培养基配方和发酵条件。进一步用乙酸乙酯提取菌株XG40发酵液中的活性物质并测定其理化性质。结果表明,菌株XG40最佳发酵培养基配方为玉米粉50 g/L,黄豆粉9 g/L,酵母粉6 g/L,NaCl 0.5 g/L,K_(2)HPO_(4)0.5 g/L,Mg SO_(4).7H_(2)O 0.5 g/L,Fe SO_(4).7H_(2)O 0.01 g/L;最佳发酵条件为初始p H 7.0,温度28℃,装液量100 mL/500 mL,接种量7%,转速160 r/min,发酵时间6 d。菌株XG40发酵液的活性物质对蜜柚黑斑病菌菌丝生长有很强的抑制作用,该活性物质较耐酸碱和短时间(180 min)紫外线照射,耐贮性高,但高温对其抗菌活性有一定的影响。小串链霉菌XG40可为开发针对蜜柚黑斑病的生物农药提供新的原材料,其活性物质抑菌效果良好,稳定易保存,可为进一步开发利用奠定基础。