柑橘黑斑病菌生物学特性研究

本文测定了不同培养基、温度、pH、光照条件对柑橘黑斑病菌柑橘叶点霉(Phyllosticta citricarpa)菌丝生长和孢子萌发的影响,以明确其生物学特性。结果表明,该菌最适生长的培养基为燕麦片琼脂培养基(OA);菌丝最适生长温度为25～30℃,最适pH为5～7;在12h光暗交替条件下生长最好,全黑暗条件下生长最慢。分生孢子萌发最适温度为25℃,最适pH为6,以在0.2%葡萄糖溶液中的萌发率最高。菌丝和分生孢子在55℃水浴处理10min均失活。

柑橘叶点霉菌ISSR-PCR反应体系的优化

为了获得最优柑橘黑斑病病原菌柑橘叶点霉菌ISSR-PCR反应体系,利用单因素试验法对反应体系中的5个因素(Mg2+、d NTP、引物、Taq DNA聚合酶和模板DNA)分别设置了不同的浓度梯度进行反应体系的优化。结果表明,在20μL反应体系中,含有1.5 mmol/L的Mg2+、0.15 mmol/L的d NTP、0.3μmol/L的引物、25 ng DNA模板、0.5 U Taq DNA聚合酶为最优。利用优化的ISSR-PCR反应体系对不同地理来源的21株柑橘叶点霉菌菌株进行扩增。结果表明,已建立的体系稳定可靠。柑橘叶点霉菌ISSR-PCR反应体系的建立为利用ISSR分子标记技术对柑橘叶点霉菌进行遗传分析奠定了基础。

柑橘黑斑病菌的分子检测技术研究

为了快速区分柑橘黑斑病菌、亚洲柑橘叶点霉菌、首都叶点霉菌和中国柑橘叶点霉菌,在ITS1和18S区域设计了针对柑橘黑斑病菌、首都叶点霉菌和中国柑橘叶点霉菌的上游引物,以ITS4作为下游引物,并对所设计引物的特异性和退火温度进行了筛选,对引物的灵敏度进行了验证,并进行了果园疑似病斑的检测。结果表明,在退火温度为60℃时,引物Pc1/ITS4仅能从柑橘黑斑病菌中扩增出593 bp的特异性条带,引物Pct4/ITS4仅能从首都叶点霉菌中扩增出551 bp的条带,引物Pcc1/ITS4仅能从中国柑橘叶点霉菌中扩增出706 bp的条带,不能从柑橘常见病害病原菌中扩增出任何条带。特异性引物的灵敏度检测结果表明,引物Pc1/ITS4和Pct4/ITS4的检测灵敏度为200 pg,引物Pcc1/ITS4的检测灵敏度为20 pg。筛选的特异性引物Pc1/ITS4可以对果园疑似柑橘黑斑病病斑进行检测。因此,利用设计的特异性引物Pc1/ITS4、Pct4/ITS4和Pcc1/ITS4,结合简单的病原菌基因组DNA提取方法,可以在短时间内完成对病原菌的分子检测。

柑橘黑斑病菌与柚黑斑病菌对苯并咪唑类杀菌剂的抗性及其分子机制

为了对柑橘黑斑病和柚黑斑病提出更科学的化学防治方法,该文研究了柑橘黑斑病菌和柚黑斑病菌对杀菌剂多菌灵的抗性频率、抗性水平及其抗性分子机制。结果表明:在江西114个柑橘黑斑病菌株中发现了2个多菌灵抗性菌株,抗性频率为1.75%,抗性系数分别为5333.6和379.2;在四川32个柑橘黑斑病菌株中发现了1个多菌灵抗性菌株,抗性频率为3.13%,抗性系数为303.3;在浙江23个菌株和重庆3个菌株中没有出现抗性菌株。在广东收集的54个柚黑斑病菌株中发现了1个抗性菌株,抗性频率为1.85%,抗性系数为13719.5;在广西和福建分别收集的34个柚黑斑病菌株中没有发现抗性菌株。柑橘黑斑病菌和柚黑斑病菌对甲基硫菌灵和多菌灵存在正交互抗性,对嘧菌酯和多菌灵无交互抗性。因此,建议多菌灵可继续在柑橘黑斑病和柚黑斑病防治中使用,鉴于高抗菌株已出现,使用时应与其他作用机制的杀菌剂轮换使用。本实验还发现,柑橘黑斑病菌存在2种抗苯并咪唑类的分子机制,即β-微管蛋白基因上第198位氨基酸位点由谷氨酸突变为赖氨酸(抗性系数为5333.6的菌株)和第200位氨基酸位点由苯丙氨酸突变为酪氨酸(抗性系数为379.2的菌株);而柚黑斑病菌抗苯并咪唑类的分子机制则与β-微管蛋白基因第198位氨基酸由谷氨酸突变为丙氨酸有关。