Combined Toxicity Test of Complex Agents of Metalaxyl and Other Fungicides against Phytophthora parasitica var. nicotianae

[ Objective] To overcome the resistance of Phytophthora parasitica var. nicotianae against metalaxyl and effectively control its damage, new efficient complex agent of metalaxyl was studied and developed. [ Method] The toxieities of nine fungicides against P. parasitica were measured using growth rate method. On this basis, the fungicides with good effects were selected to compound with metalaxyl, and the optimum complex ratio was confirmed. [Result] The toxicity of metalaxyl was the strongest with EC50 of 2. 130 5μg/ml; followed by carbendazim, mancezeb and dimethomorph with EC50 of 2.357 9, 2.639 8 and 2. 778 8 μg/ml. The effect of cyazofamid was the poorest with EC50 of 6. 278 8 μg/ml. The optimum complex ratios of dimethomorph, carbendazim and mancezeb with metalaxyl were 40： 60, 30：70 and 20： 80, and their co-toxicity coefficients were 138.80,124.25 and 115.00, respectively. [ Conclusion] The complex agents had application and promotion value, which could be used to carry out further field trials.

烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var. nicotianae)生理小种鉴定技术研究

1981—1985年从全国8个主产烤烟省30个地、县共采集和分离到烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae)57个分离物,用游动孢子悬浮液接种根及茎基部,试验表明这种接种方法效果为好。用此方法将各分离物接种在常用的Burley_(21)、Burley_(37)、N.nesophila、N.stocktonii等4个鉴别寄主上进行了鉴定试验。通过鉴定,采自全国57个分离物中有44个属于生理小种Ⅰ号,占77.2%;有12个属于生理小种0号,占21.1%,还有个别分离物有待进一步鉴定。

拟氨基多糖抑菌剂K1、K2对烟草黑胫病原菌(Phytophthora parasitica var．nicotianae)的抑制效果研究

采用生长速率法测定了拟氨基多糖类抑菌剂K1、K2对烟草黑胫病原菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae)的抑菌效果。结果表明:K1、K2对烟草黑胫病原菌均有显著的抑制作用,且抑制效果随K1、K2浓度的增大而增强;20 mL/L的K1、K2对烟草黑胫病原菌的抑制率分别为50.58%、84.68%,EC50分别为26.15、4.87 mL/L。

A Preliminary Study on the Resistance to Different Fungicides in Phytophthora parasitica var. nicotianae

[Objective] This study aimed to investigate the resistance to different fungicides in Phytophthora parasitica var. nicotianae. [Method] Under indoor incubation conditions, the resistance to dimethomorph, metalaxyl-mancozeb, propamocarb and ovraclostrobin.dimethomorph in P. parasitica strain isolated from Zhenyuan County in Qiandongnan State was analyzed with colony growth measurement method. [Result] P. parasitica exhibited different levels of sensitivity to four fungicides. To be specific, P. parasitica exhibited the highest resistance to dimethomorph, and ECho reached 1.19 μg/ml. [Conclusion] In Zhenyuan tobacco-growing area, long-term single use of dimethomorph possesses certain resistance risk in prevention and control of black shank disease.

烟草黑胫病菌拮抗内生细菌的筛选和鉴定

为寻找防治烟草黑胫病新途径,2001至2003年,从湖南永州和宁乡等地烟草黑胫病发病严重的田块采集健株,共分离到内生细菌株120株,经测定,8株内生细菌菌株在室内有较强的拮抗作用,这8株内生细菌与烟草黑胫病菌共培结果显示,55y,NN-3,YN-4和YN-10对烟草黑胫病菌抑菌效果均在66%以上.根据内生细菌形态特征和生理生化性状,初步鉴定内生细菌55y为假单胞杆菌属铜绿假单胞菌,NN-3为芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌,YN-4,YN-10为芽孢杆菌属凝结芽孢杆菌,且这4菌株均为烟草内生细菌.

抗菌肽和几丁质酶基因提高烟草对黑胫病菌和赤星病菌的抗性研究

通过农杆菌介导法将加信号肽修饰的人工合成杂合抗菌肽CEMA基因(SPCEMA),苜蓿防御素基因(AFP),苦瓜几丁质酶基因(CHI)以及SPCEMA-CHI、AFP-CHI、AFP-SPCEMA双价基因导入本明烟(Nicotianabenthamiana),并对转基因烟草T0和T1代进行了抗病性检测,比较了不同转基因植株的抗病效果。研究结果表明,转基因烟草对黑胫病菌(Phytoph-thoraparasiticavar.nicotianae)、赤星病菌(Alternariaalternata)的抗性均强于非转基因烟草,病情指数差异达极显著水平,其中转AFP-CHI双价基因烟草具有较强的抗性,与单价转基因烟草的抗性差异达显著水平。但各单价转基因以及双价转基因烟草之间对上述病菌并未表现出显著的抗病性差异。结果表明植物源的抗菌肽基因与几丁质酶基因在抗植物真菌病害中具有协同增效作用。

烟草黑胫病菌研究进展(一)

系统综述了烟草黑胫病菌的发现与命名、分类、生物学特征、分布与为害、致病机理、生理特性及寄主范围等方面的最新研究进展。

烯酰吗啉对我国烟草黑胫病菌的毒力研究

从山东和云南烟区采集分离了20个烟草黑胫病菌phytophthora parasitica vat．nicotianae菌株，采用菌丝生长速率法测定了烯酰吗啉对这些菌株的毒力。结果表明：20个田间菌株的EC50值在0．60-1．28μg/mL之间，与实验室保存的敏感菌株（S）的EC50值（0．32μg/mL）相比，毒力倍数在1．87—4．00之间．均属于敏感菌株。烯酰吗啉对烟草黑胫病菌孢子囊的产生有明显的抑制作用，8．00μg/mL的烯酰吗啉对孢子囊产生的抑制率为100％。通过烯酰吗啉对烟草黑胫病菌继代培养物的毒力比较证明，烟草黑胫病菌对烯酰吗啉存在抗性风险。

防治烟草黑胫病有益内生细菌的筛选及其抑菌作用

为筛选具有防病作用的植物内生细菌,采用常规分离方法从不同生长期的健康烟株的根、茎、叶中分离得到内生细菌127株,平板对峙培养法从中筛选出12株对烟草黑胫病菌具有明显拮抗作用的菌株,它们的抑菌带宽度达到5mm以上。对其进行了皿内拮抗试验、发酵液抑菌试验和温室防病试验。有8个菌株培养液滤液中存在具有抑菌作用的活性成分。其中wy2、wy11、wy4培养滤液的抗菌活性最强(>30%),它们的细菌培养滤液能破坏病原菌菌丝形态,使烟草黑胫病菌菌丝细胞膨大、细胞壁破损、原生质外渗、菌体崩溃、生长缓慢。温室盆栽试验表明wy11对烟草黑胫病的防效最好,为51.7%。此外,内生细菌wy11和cj17发酵液灌根对烟株具有一定促生作用,能提高烟株茎围、叶长、叶宽。以细菌16S rDNA同源性为基础的系统发育分析表明防病促生内生细菌wy11与B.amyloliquefaciens(AB255669)处于同一分支,相似性为99%,初步将菌株wy11鉴定为解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens。

烟草黑胫病拮抗菌的筛选及其生物效应

烟草黑胫病是烟草生产中危害最严重的土传病害之一,生物防治具有抗病和环保的作用,获得高效拮抗菌株是进行生物防治研究的基础。本研究采用平板对峙法,在烟草黑胫病发生严重的田块中选取健康烟株,从其根际土壤中分离筛选到12株对烟草黑胫病病原菌Phytophthora parasitica var.nicotianae具有拮抗效果的菌株,抑菌率59.4%～71.1%。选择抑菌率最高的C-5菌株进行试验。经鉴定C-5菌株为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。抗菌谱试验结果表明:C-5菌株不仅对黑胫病病原菌有较强的拮抗作用,同时对甜瓜?黄瓜枯萎病病原菌和辣椒疫病病原菌也具有拮抗作用。苗期盆栽试验结果表明:利用C-5菌株发酵制备的微生物有机肥能抑制烟草黑胫病的发生,苗期防治率达80%。本文首次报道了多粘类芽胞杆菌菌株对烟草疫霉有拮抗作用。

绿针假单胞菌PL9菌株对烟草疫霉的拮抗作用研究

利用离体拮抗试验和烟草幼苗生物测定法研究了棉花根圈细菌绿针假单胞菌 (Pseudomonascholoraphis)PL9菌株对烟草黑胫病病原菌烟草疫霉 (Phytophthoraparasiticavar .nicotianae)的拮抗作用 ,该菌株对烟草疫霉菌丝体有很强的抑制作用 ,并且可以完全抑制烟草疫霉游动孢子对烟草幼苗的侵染 ,其液体培养物浓缩过滤液也有相同的抑制作用 ,拮抗作用机理研究结果表明 ,其拮抗作用可能与PL9菌株分泌的抗生素类物质有关。为了解PL9菌株在烟草根圈的定殖情况 ,采用全套发光酶基因 (luxCDABE)标记的菌株PL9L进行跟踪 ,结果表明该菌株可以在烟草根圈成功定殖。

广西烟草黑胫病菌对甲霜灵的敏感性检测

【目的】研究广西烟草黑胫病菌对甲霜灵的敏感性,为烟草黑胫病药剂防治提供科学依据。【方法】采用菌落生长速率法对从广西主要烟区采集分离到的196株烟草黑胫病菌株进行对甲霜灵的敏感性测定。【结果】甲霜灵对196株菌株的EC50在0.0691-1.0243μg/mL,平均EC50为0.3618±0.0297μg/mL;来自田林县的菌株TL05为最敏感菌株,EC50为0.0691μg/mL;来自靖西县画洞镇的菌株ZXHD12为最耐药菌株,EC50为1.0243μg/mL;各烟区烟草黑胫病菌对甲霜灵的敏感性有一定差异,其中南丹、田林县的菌株较敏感,而隆林、靖西、德保、富川县的部分菌株较耐药;196株菌株中,敏感型、一般耐药型和耐药型菌株分别占1.53%、66.84%和31.63%。【结论】广西烟草黑胫病菌已对甲霜灵产生不同程度的抗性,甲霜灵作为生产上防治烟草黑胫病的主要药剂具有较大的风险,建议生产上甲霜灵与其他杀菌剂进行轮换使用。

黑胫病菌诱导的烟草SSH文库构建及其分析

黑胫病是危害严重的世界性烟草主要病害之一,探究烟草对黑胫病的抗病机制,可以为该病的综合防治提供理论依据。本研究以烟草黑胫病抗性品种革新3号为材料,利用黑胫病0号生理小种诱导其水平抗性,分别在接种后0.5、1、3、6、10和16d取样,通过抑制差减杂交技术(SSH)构建cDNA文库,获得了960个阳性克隆。利用反向Northern斑点杂交技术对其中240个阳性克隆进行杂交筛选,筛选出57个表达差异明显的基因,序列拼接后获得33条高质量EST,测序及其比对分析表明,革新3号对烟草黑胫病抗性相关基因主要涉及抗病防卫、光合作用、信号传导和能量代谢等方面。进一步基因功能分析显示,病程相关PR1b蛋白、半胱氨酸蛋白、延伸因子1-α、α-微管蛋白、细胞色素P450、精胺合成酶、水通道蛋白、过氧化物酶体膜蛋白、甘氨酸延伸因子等可能参与了烟草与黑胫病菌非亲和互作过程。

短小芽孢杆菌AR03挥发性有机物的抑菌活性及其组分分析

【目的】对分离自烟草根际土壤中的一株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)AR03菌株产生的挥发性有机物进行抑菌活性测定和组分分析。【方法】采用培养皿对扣熏蒸法和凹玻片孢子萌发法测定挥发性有机物对烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae)和赤星病菌(Alternaria alternata)菌落、菌丝生长以及孢子萌发的影响,采用离体叶片接种法测定挥发性有机物对烟草黑胫病和赤星病的防治效果;采用顶空加热法收集抑菌挥发性有机物,对其进行气相色谱-质谱(GC-MS)检测,并结合保留指数(retention index,RI)和内标(internal standard,IS)1-十五烯对其组分进行定性和定量分析。【结果】短小芽孢杆菌AR03菌株分泌的挥发性有机物对供试的两种病原真菌均具有一定的抑制作用,表现为经处理后的烟草黑胫病菌菌丝生长稀疏缓慢变粗、分支增多且扭曲、断裂;赤星病菌菌丝生长畸形,其上不产生分生孢子梗,内含物大部分聚集成团导致菌丝干瘪、缢缩。对峙培养2、4、6和8 d时,挥发物对黑胫病菌和赤星病菌菌丝生长的抑制率分别为56.21%和59.23%、64.75%和59.86%、66.13%和61.10%、67.04%和70.00%;对黑胫病菌游动孢子和赤星病菌分生孢子的抑制作用表现为延迟萌发且萌发后的芽管生长缓慢;黑胫病菌产生孢子囊数明显减少,赤星病菌分生孢子各分隔处的细胞畸形肿胀成泡状。离体叶片抗病测定结果显示,挥发性有机物抑制黑胫病菌和赤星病菌病斑在叶片的扩展,对峙熏蒸40 h时,对照叶片黑胫病的发病率为92.50%,圆形坏死病斑直径是25.10 mm,经挥发物处理后叶片发病率为70.83%,病斑直径为9.45 mm,对黑胫病斑扩散的抑制率为62.35%;对峙熏蒸80 h时,对照叶片赤星病的发病率为88.33%,病斑扩散为近圆形的褐色坏死斑,平均直径为8.32 mm,经挥发物处理后赤星病的发病率为60.80%,病斑扩展较慢,平均直径为2.85 mm,挥发物对赤星病斑扩散的抑制率为65.75%。SPME GC-MS分析表明,AR03菌株胞外分泌7种组分挥发性物质,均为C15H24结构的倍半萜烯类化合物,分别是二氢姜黄烯、(E)-β-金合欢烯、γ-姜黄烯、α-姜烯、π-红没药烯、β-倍半萜水芹烯和γ-E-红没药烯;AR03培养1 d后,其中β-倍半萜水芹烯相对含量最高,为80.64%,其次为(E)-β-金合欢烯和α-姜烯,相对含量分别为7.20%和6.67%;随着AR03培养时间的延长,各组分种类相同,但相对含量差异较大,除二氢姜黄烯含量保持基本不变外,其他组分含量呈递减趋势,培养至第6天时,各组分含量下降超过50%。【结论】短小芽孢杆菌AR03菌株能够产生具有较强抑菌活性的挥发性有机物,有潜力作为开发抗真菌代谢物和新药物的重要微生物资源。

抗烟草黑胫病菌的植物源杀菌剂的筛选研究

以烟草黑胫病菌为供试菌种,对7种植物的95%乙醇提取物进行离体生物测定筛选。结果表明,相对其它植物,中草药F和中草药H对烟草黑胫病菌有显著的抑菌活性。进一步毒力测定表明,中草药F和中草药H提取物对烟草黑胫病菌的3 d后的EC50值分别为1.53和0.79 g.L-1,5 d后的EC50值分别为1.32和0.59 g.L-1。

烤烟品种K326内生细菌分离、抗黑胫病菌株筛选及种群组成分析

从烤烟品种K326的不同生长时期分离内生细菌1000株,以烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae)为靶标,共筛选出168株拮抗菌,这些内生细菌对黑胫病菌的抑菌率在12.54%～50.14%之间。苗期和团棵期的内生菌含量较高,但在开花和成熟期时降低了一个数量级,而拮抗菌数量呈上升趋势。对168株拮抗菌的16SrRNA基因序列进行RFLP分析,共产生10种带型。根据RFLP带型选取39株进行16S rRNA基因序列测定和系统发育分析。结果表明,这168株生防内生细菌归于2大类群:Firmicutes和Actinobacteria。Firmicutes类群中的芽孢杆菌属(Bacillus)是优势属,共6种RFLP带型,150个菌株,包括Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum,Bacillus tequilensis,Bacillus methylotrophicus,Bacillus cereus,Bacillus thuringiensis和Bacillus aryabhattai。Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum和Bacillus methylotrophicus的出现频率最高,共126株,占该属总菌株数的78.75%。其余18个菌株分属于4个种:即Brevibacillus formosus,Brevibacillus parabrevis,Pseudomonas umsongensis和Pseudomonas aeruginosa。

柠檬草精油对烟草黑胫病的抑制活性研究

研究了5种常见植物精油的抗烟草黑胫病活性,确定了植物精油的种类与浓度,为烟草黑胫病防治的精油药剂的开发与应用提供理论依据。采用菌丝生长抑制法和茎秆接种法,分别评价了植物精油对烟草黑胫病的体外和体内抑菌活性。结果表明,在体外条件下,柠檬草精油对烟草黑胫病的抑制效果最好,具有浓度梯度抑制效应,最低抑菌浓度为320μg/mL;在体内条件下,柠檬草精油640μg/mL时对烟草黑胫病预防与治疗效果最佳,病情指数分别为16.67和56.79,相对诱导效果分别为81.93%和38.44%,与甲霜灵190μg/mL无显著性差异。柠檬草精油具有优越的体外和体内抗菌活性,是有潜力的生物抗菌剂和杀菌剂,有望在今后的烟草黑胫病菌防治中进一步开发利用。

烟草黑胫病拮抗内生细菌的分离、鉴定及防效测定

采用常规分离方法从健康烟株的根、茎、叶中分离得到内生细菌269株,从中筛选出7株对烟草黑胫病病原菌具有明显拮抗作用的菌株,它们的抑菌半径达到6 mm以上。菌株05-4004、05-2501培养液滤液中存在具有明显抑菌作用的活性成分。致病性试验中,发现菌株701-1在人工接种条件下有致病能力或潜在致病性,选择余下6株拮抗细菌进行了温室盆栽试验,以05-4004、05-2002两株烟草内生细菌对烟草黑胫病的防效最好,分别为46.6%、45.2%。促生试验中,NB培养液和清水对照的种子发芽率分别为84.3%、82.7%,而经过05-2002和05-4004除菌滤液浸种后,发芽率分别提高到93.5%和93.7%。经过05-4004、05-2002灌根处理后,株高、叶长、叶宽、有效叶片数、叶面积明显增加。证明菌株05-2002、05-4004同时还具有一定的促生作用。以细菌16S rDNA同源性为基础的系统发育分析表明05-4004和Bacillus pumilus(EU366363)、Bacillus safensis(AY030327)处于同一分支,相似性为100%,05-4004鉴定为芽孢杆菌属。

烟草黑胫病菌株亲缘关系的RAPD分析

从２２０个ＲＡＰＤ（ＲａｎｄｏｍＡｍｐｌｉｆｉｅｄＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡｓ）随机引物中所选出的多态扩增性强的２１个引物对来源不同的刀个烟草黑胫病菌株进行全基因组ＤＮＡ遗传多样性分析和指纹构建。选用引物对受试菌株进行ＲＡＰＤ－ＰＣＲ扩增，共产生２４３条ＤＮＡ标记图带，其中１９１条为多态性图带，多态检测率为７８．６％。利用ＵＰＧＭＡ（ＵｎｗｅｉｇｔｈｔｅＰａｉｒ－ｇｒｏｕｐ ＭｅｔｈｏｄＷｉｔｈＡｒｉｔｈｍｅｔｉｃ Ａｖｅｒａｇｅ）软件对受试菌株间的遗传距离进行聚类分析构建系统树状图，受试对个菌株被划分为５个遗传聚类组即（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ）。结果证明供试菌株具有丰富的遗传多样性，虽各自的遗传背景差异显著，但其亲缘关系相近，遗传聚类组的划分与菌株的地理来源未有明显的相关性。

芸薹属植物提取液与异硫氰酸酯类制剂对烟草疫霉菌的抑制作用

为寻找有效防治烟草黑胫病的生物材料,采用生长速率法和抑菌圈法测定了3种芸薹属植物提取液和3种异硫氰酸酯类制剂对烟草疫霉菌菌丝的抑制作用。结果表明:(1)与对照相比,不同浓度的芸薹属芜菁、芥菜和油菜提取液均显著抑制烟草疫霉菌菌丝的生长,EC_(50)值分别为11.39、9.18和5.88 mg/mL,油菜提取液对烟草疫霉菌菌丝生长的抑制效应最佳。(2)与对照相比,不同浓度的异硫氰酸烯丙酯(AITC)和甲基异硫氰酸酯(MITC)制剂也均显著抑制烟草疫霉菌菌丝的生长,EC_(50)值分别为2.07和4.44 mg/L,AITC对烟草疫霉菌菌丝生长的抑制效应最佳;而异硫氰酸苯酯(PITC)对烟草疫霉菌菌丝生长无明显的抑制作用。可见,3种芸薹属植物和2种异硫氰酸酯类制剂(AITC和MITC)对烟草疫霉菌具有较好的生防效应。