水稻抗稻瘟病基因Pi-ta与Pi-ta^2之间的关系

该研究以含抗稻瘟病基因Pi-ta和Pi-ta2的水稻品种Katy和Kaybonnet为供体亲本的4个F2群体(含2516个单株)为材料,利用已建立的Pi-ta显性标记与Pi-ta2微卫星标记进行分子检测,结果发现,所有含Pi-ta基因的单株都具有Pi-ta2,不含Pi-ta基因的单株也无Pi-ta2,这表明,这两个基因紧密连锁或等位;稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)人工接种试验发现所有抗病单株都含Pi-ta基因,而感病单株则无.由此表明,在含2516个单株的F2群体中没有发生抗病基因的重组,这进一步验证这两个抗病基因等位或紧密连锁.

利用分子标记辅助选择聚合水稻抗病基因Pi-ta、Pi-b和Stv-b^i

水稻稻瘟病和条纹叶枯病是长江中下游粳稻稻区两大主要病害,选育抗病品种是防治这两大病害最有效的方法。以同时含有稻瘟病抗病基因Pi-ta和Pi-b的武运粳8号,含有条纹叶枯病抗病基因Stv-bi的镇稻42为基因供体配置杂交组合。利用Pi-ta和Pi-b的基因标记和Stv-bi紧密连锁的分子标记对分离世代进行基因位点的检测,结合田间多代选育、抗性鉴定将3个抗病基因同时转育到高产品种中,选育出高产、优质、多抗水稻新品系74121。利用分子标记辅助选择,为选育多抗水稻新品种提供了一种简单、快捷的选择方法,同时也为水稻抗病育种提供了新的遗传资源。

利用分子标记辅助选择聚合水稻Pi-ta、Pi-b和Wx-mq基因

近年来,优良食味粳稻品种南粳46、南粳5055和南粳9108在江苏等地大面积推广,促进了优质稻米产业的发展。但这些品种均不抗稻瘟病,且缺乏适合在淮北地区种植的中熟中粳型优良食味粳稻品种。本研究以同时携带稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-b的江苏抗病、高产粳稻品种武粳15为母本,携带低直链淀粉含量基因Wx-mq的优良食味粳稻品种南粳5055为父本配置杂交组合进行聚合育种。利用Pi-ta和Pi-b基因的分子标记多重PCR体系以及Wx-mq基因的四引物扩增受阻突变体系PCR检测技术,分别在不同的分离世代对目标基因位点进行检测,结合田间多代选育、抗性鉴定和籽粒胚乳外观鉴定,成功地将Pi-ta、Pi-b和Wx-mq基因聚合于一体,选育出稻瘟病抗性好、食味品质优、产量高的水稻新品系"南粳0051",适合在江苏省淮北地区种植。本研究将三套自主研发的PCR检测体系成功应用于分子标记辅助选择,不仅为水稻多基因聚合育种提供了快捷、高效的选择方法,也为水稻抗病、优质育种创制了新的种质资源。

Pi-ta、Pi-b基因在江苏粳稻穗颈瘟抗性育种中的价值分析

利用稻瘟病抗性基因Pi-ta、Pi-b的功能标记对2009,2010年江苏省粳稻中间试验的部分粳稻品系进行基因型检测,结合穗颈瘟抗性结果,通过关联分析Pi-ta、Pi-b在江苏省粳稻穗颈瘟抗性中的价值。结果表明:Pi-ta、Pi-b基因与江苏省粳稻穗颈瘟的抗性呈正相关,Pi-ta基因2009,2010年的相关系数分别为0.50,0.37;Pi-b基因2009,2010年的相关系数分别为0.55,0.51;Pi-ta、Pi-b基因的联合效应与穗颈瘟抗性正相关系数分别为0.71,0.62。因此,同时携带这2个抗病基因可以大大提高江苏省粳稻穗颈瘟抗性。

水稻抗稻瘟病基因Pi-ta的分子标记辅助选择

利用已建立的水稻抗稻瘟病基因Pi ta显性分子标记对 30个品系和 1 57个来自不同国家的一些水稻品种进行分子鉴定 ,并采用稻瘟病菌菌株ZN57(IC 1 7)和ZN6 1 (IB 4 9)人工接种试验进行致病性测试。结果表明 ,大部分品系和少数水稻品种含抗病基因Pi ta ,且对稻瘟病菌菌株ZN57和ZN6 1表现抗病反应。除此之外 ,利用两对显性分子标记YL1 55 YL87和YL1 83 YL87对 350个杂交F3代株系进行早期筛选 ,得到 1 1 8个抗病基因Pi ta纯合的株系。这些株系田间抗性调查结果表明 ,抗病基因存在与否与田间抗性相吻合。因Pi ta基因与许多其他抗病基因紧密连锁 ,而使含有Pi ta基因的品种具有广谱抗性 ,由此确立了Pi ta基因显性分子标记在育种辅助选择中的应用价值。

云南景洪直立型普通野生稻抗稻瘟病Pi-ta^＋等位基因的克隆与分析

用PCR法从景洪直立紫杆普通野生稻中克隆了抗稻瘟病基因Pi-ta+的4672bp序列,该序列包含完整的编码框、内含子和终止密码子下游的331bp。所克隆的直立型紫杆普通野生稻Pi-ta基因序列的编码区与已报道的日本栽培稻社糯(Yashiro-mochi)和元江普通野生稻相应序列间的同源性分别为99.86%和98.78%。与社糯的Pi-ta基因相比,其编码区有4个核苷酸的差异并导致3个氨基酸残基的改变,而内含子区域有6个核苷酸差异。对该序列进一步分析发现,其推导的氨基酸残基的918位为丙氨酸,属于稀有的抗稻瘟病的Pi-ta+等位基因。景洪直立型普通野生稻Pi-ta+基因因其编码序列和推导的氨基酸序列与社糯有所不同,推测其抗病能力大小和抗菌谱可能与社糯的Pi-ta基因不同。直立型普通野生稻中Pi-ta+等位基因的克隆为进一步利用该基因改良栽培稻抗病能力提供了前期物质基础。

Pi-b和Pi-ta基因在江苏省粳稻中的分布以及与穗颈瘟抗性的关系

利用稻瘟病抗性基因Pi-b、Pi-ta等位基因的显性标记对48份江苏省粳稻品种和618份粳稻新品系进行检测,并结合6个代表性稻瘟病生理小种的穗颈瘟抗性鉴定反应,分析抗性基因在江苏省粳稻中的分布及其与穗颈瘟抗性的关系。结果显示:抗性基因Pi-b和Pi-ta在江苏省粳稻品种和品系中存在广泛分布,其中抗性基因Pi-b的频率明显高于Pi-ta。不同生育类型的品种中,抗性基因Pi-b和Pi-ta在中熟中粳中的分布最少,且pi-b/pi-ta基因组合品种所占比例最高。从基因组合与抗性的关系来看,含单个抗性基因的新品系无论是感病率还是病情指数都明显低于不含Pi-b和Pi-ta抗性基因的品系,且Pi-ta基因的抗性效果要好于Pi-b基因,而同时含有两个抗性基因的新品系其抗性水平又优于只含单个抗性基因的粳稻品系。因此,在育种中选择两个抗性基因互补的粳稻作亲本,在后代群体中进行基因聚合,是提高江苏省粳稻穗颈瘟抗性最快速、有效的方法。

水稻稻瘟病抗性基因Pi-ta的SNP检测方法

针对稻瘟病抗性基因Pi-ta位点上的抗感基因的编码产物仅有1个氨基酸的差异,利用已经建立的检测该基因的SNP方法以及作者在该基因编码序列构建的四引物扩增受阻突变体系PCR,对62份2012年长江上游国家水稻区域试验材料和97份陕西省水稻区域试验材料进行了Pi-ta基因检测,2种分子标记检测结果一致。该方法的检测结果真实可靠,可以用于检测水稻Pi-ta基因位点。

云南野生稻抗稻瘟病Pi-ta基因的检测及分析

以16个不同来源的云南野生稻作为供试材料,用抗稻瘟病Pi-ta基因特异引物(KG2/KG4)进行PCR扩增,并对PCR产物进行克隆、测序及分析。结果表明,16个野生稻中7个品种持有抗稻瘟病Pi-ta基因,其中,来自云南景洪的紫秆普通野生稻中Pi-ta基因的编码区与原始型的抗稻瘟病Pi-ta基因的DNA序列完全相同。可见,云南可能是抗稻瘟病基因Pi-ta的起源地之一。

水稻Pi-ta启动子的克隆及其功能分析

本研究分离了水稻品种日本晴Pi-ta基因的启动子,并构建其GUS融合表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化获得了其转基因植株。以获得的转基因水稻为材料进行GUS组织染色和GUS(β-葡萄糖苷酸酶)酶活性分析,结果表明,GUS基因在根、茎和叶中都有表达,转基因植株在接种稻瘟病菌后GUS活性显著增加。用抗病信号分子水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)处理后,Pi-ta启动子驱动的GUS活性也显著增加。以上结果表明,Pi-ta启动子是一个对稻瘟病菌应答的诱导型启动子,同时Pi-ta启动子还受到SA和MeJA的诱导表达。

云南元江普通野生稻中Pi-ta和Pib同源基因的克隆和分析

用高保真PCR技术从云南元江普通野生稻中克隆了抗稻瘟病Pi-ta同源基因的编码区及Pib基因的部分同源序列。Pi-ta同源基因的编码区序列与报道的栽培稻有99.7%的同源性。根据前人的结果,从元江普通野生稻的Pi-ta基因推导的氨基酸序列中918位点为丝氨酸,属于Pi-ta^-等位基因,不能对含有AVRPita基因的稻瘟病菌产生抗性。与Pi-ta基因相比,元江普通野生稻中的Pib同源基因第一外显子与栽培稻的相应序列间存在较大差异,其中有一段87 bp的DNA序列缺失,而且不能按正常的Pib基因序列的阅读框进行翻译。因此认为,元江普通野生稻不具有基于Pi-ta和Pib基因的抗稻瘟病遗传基础。

宁夏水稻品种抗稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b和Pi9的检测分析

为明确宁夏水稻品种中抗稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b和Pi9的分布情况,为宁夏水稻抗穗颈瘟病的分子标记辅助选择育种奠定基础。利用Pi-ta、Pi-b和Pi9 3个与抗稻瘟病基因紧密连锁的功能标记,对94份宁夏水稻品种进行抗稻瘟病基因的分子检测。结果表明,宁夏水稻品种中含Pi-ta抗性基因的占46.8%,含Pi-b抗性基因的占93.6%,含Pi9抗性基因的占27.7%,同时含有Pi-ta和Pi-b抗性基因的占44.7%,同时含有Pi-ta、Pi-b和Pi9抗性基因的占12.8%。根据报道,Pi-ta、Pi-b基因的联合效应与穗颈瘟抗性正相关系数为0.71,表明从宁夏水稻品种中选育抗穗颈瘟品种是有基因基础的。

利用SSR分子标记检测云南地方稻种抗稻瘟病基因Pi-ta^2的研究

垂直抗性基因Pi-ta2在云南抗稻瘟病育种中具有重要的利用价值。利用与抗稻瘟病基因Pi-ta2连锁的SSR引物OSR32对云南地方稻种二级核心种质中的220份抗性基因Pi-ta2进行了检测,并选择15份材料进行了人工接种鉴定。分子标记检测表明,123份籼稻有25份含有Pi-ta2基因,占20.3%;97份粳稻有51份含有该基因,占52.58%,粳稻比籼稻高;携带Pi-ta2基因的材料分布在云南5个稻区中的29个县,较为广泛,南部边缘和滇东北高原粳稻区分布点较多。结果表明,人工接种鉴定与分子鉴定结果完全相符,验证了SSR引物OSR32鉴定抗稻瘟病基因Pi-ta2的可行性。初步明确了Pi-ta2基因在云南地方稻种资源中的分布情况,对水稻抗性基因发掘和品种布局具有指导作用。

等位基因特异扩增检测水稻抗稻瘟病基因Pi-ta

为明确陕西省主要水稻种质资源中抗稻瘟病基因Pi-ta的存在状况,为稻瘟病抗性育种提供依据。利用在抗稻瘟病基因Pi-ta区域设计的四引物扩增受阻突变体系PCR方法,对陕西省2010-2012年水稻区域试验的327份材料进行Pi-ta基因位点检测。结果表明,4份材料为抗性基因纯合体,40份材料为抗性基因杂合体,276份材料在Pi-ta位点为感性基因纯合体,7份材料未检出条带。检测结果真实可靠,可以作为检测水稻Pi-ta基因位点的有效方法。

黄淮稻区推广水稻品种稻瘟病抗性基因Pi9和Pi-ta的分子鉴定

为明确Pi9和Pi-ta 2个稻瘟病抗性主效基因在黄淮稻区种植水稻品种中的分布状况,利用分子标记对60个水稻品种进行Pi9和Pi-ta抗稻瘟病基因的分子鉴定。结果表明,60个检测品种中31个含有Pi9抗性基因,9个含有Pi-ta抗性基因,郑稻18、豫农粳12号、豫稻16、泰香2号、武香粳14号和武运粳21号等6个品种携带2个抗病基因。黄淮稻区水稻育种Pi9基因利用广泛,Pi-ta基因利用较少,今后应加强Pi-ta及更多主效广谱抗稻瘟病基因的聚合利用。

Genotypic Analysis of Rice Blast Resistance Genes Pi-ta and Pi-b in Japonica Rice Varieties and Lines in Jiangsu Province

Pi-ta and Pi-b, the first cloned rice blast resistant genes, have been wide- ly used in rice blast resistance breeding for their lasting and stable resistance. To define the distribution of Pi-ta and Pi-b in japonica rice in Jiangsu, the genotypes of resistance genes Pi-ta and Pi-b in 40 varieties and 665 new lines were detected using functional markers of Pi-ta/pi-ta and Pi-b^pi-b alleles. The results showed that the resistance alleles of Pi-ta and Pi-b were widely spread in japonica rice varieties, and the distribution frequency of Pi-b was higher than that of Pi-ta. Most of the Lianjing serial varieties didn＇t carry the two resistance genes, but the two resistance genes were widely distributed in Wujing serial varieties. There was no significant dif- ference in distribution frequency of Pi-ta between new lines and commercial vari- eties. However, the distribution frequency of Pi-b in new lines was higher than that in commercial varieties. It was indicated that artificial selection was conducive to the improvement of distribution frequency of Pi-b in rice varieties. Among the 4 genotypes, the distribution frequency of pi-taJPi-b was highest （60.0%）, followed by Pi-ta/ Pi-b （33.5%） and pi-ta/pi-b （3.9%）. The frequency of Pi-taJpi-b was lowest, account- ing for only 2.6%. In terms of source of resistance genes in the four combinations, the resistant allele Pi-ta might be from parents of Wuxiangjing14, Wujing15 or Nanjing44, and Pi-b might come from parents of Wujing13, Wuxiangjing14, Wujing15 or Nanjing44. The analysis on the genotypic frequencies in offspring of the rice vari- eties showed that the resistance genotype of Pi-ta/Pi-b had the highest frequency in the cross combination of Nanjing44//Wujing13/Kantou194.

抗病基因Pi-ta在骨干亲本及其衍生品种的传递

利用Pi-ta的显性分子标记对寒地稻区水稻骨干亲本合江20号及其衍生品种进行Pi-ta抗性基因传递分析。结果表明,抗病基因Pi-ta在亲本合江20号衍生子1代出现的频率为50%,子2代出现的频率为33.3%、子3代出现的频率为7.7%,抗病基因Pi-ta的传递与合江20号衍生系谱一致。抗谱分析表明,Pi-ta抗病基因在子代中出现与衍生品种的抗谱正相关,这可能与后代选择过种中抗病基因的丢失有关,这也可能是决定不同水稻品种的稻瘟病发生程度的主要原因之一。

黑龙江省水稻种质资源抗稻瘟病基因Pi-ta的分子标记检测

为了明确水稻抗稻瘟病基因Pi-ta在黑龙江省种质资源中的分布状况,利用已建立的水稻抗稻瘟病基因Pi-ta显性分子标记对72个黑龙江省主栽品种和优异种质资源进行了分子鉴定。结果表明:合江21、龙粳4号、龙粳10号、龙盾D904、龙花00-485、佳禾早占、龙粳29、龙粳31、龙盾105、龙粳39、垦99639、松粳5号、龙盾306、东农428、东农430、芦苇稻、莲育7-91、龙香稻2号和绥香08-5080共19个品种(系)含有Pi-ta基因。

Pi-ta^+基因和几丁质酶基因双价基因导入水稻的研究

为了提高‘云资粳41’和‘云资粳43’的抗稻瘟病能力,利用农杆菌介导法将二价表达载体pCAMBIA1300-Pi-ta+-Bchi转化到水稻愈伤组织中。经组织培养获得再生苗,再通过氯酚红显色法、PCR检测和抗稻瘟病鉴定法获得抗稻瘟病的转基因植株,为进一步创建持久、广谱抗稻瘟病水稻新材料奠定基础。结果显示:(1)抗性愈伤组织经分化和生根培养后,共获得T0代水稻再生苗137株,其中‘云资粳41’14株,‘中花11’82株,‘云资粳43’41株。(2)经氯酚红显色法和PCR对再生苗检测,‘中花11’、‘云资粳41’、‘云资粳43’的转化苗阳性率分别为66%、43%和55%。证明2个外源基因已经整合到水稻基因组中。(3)对转化阳性植株温室接种稻瘟病病菌66b鉴定结果显示,转基因植株较非转基因植株对稻瘟病的抗性明显增强,而且转Pi-ta+基因和几丁质酶基因双价的水稻植株比转单价Pi-ta+基因或几丁质酶基因的水稻植株抗稻瘟病能力强。(4)氯酚红检测结果存在一定的假阳性,PCR检测结果更真实可靠,但氯酚红显色法方便、快速,结果观察直观,可对大量的转基因植株进行初步筛选。研究表明,转Pi-ta+基因和几丁质酶基因双价基因的水稻植株具有更高的抗稻瘟病能力。

抗病基因Pi-ta在粳稻骨干亲本及其衍生品种中的传递

利用Pi-ta显性分子标记对寒地稻区水稻骨干亲本合江20号及其衍生品种进行Pi-ta抗性基因传递分析。结果表明,抗病基因Pi-ta在亲本合江20号衍生一代出现频率为63%,衍生二代出现频率为33%,衍生三代出现频率为9%,抗病基因Pi-ta传递与合江20号衍生系谱一致。抗谱分析表明,Pi-ta抗病基因在衍生代中出现与衍生品种的抗谱呈正相关,与后代选择过程中抗病基因丢失有关,是决定不同水稻品种稻瘟病发生程度的主要原因之一。