piRNA hsa_piR_016187调控椎管内神经鞘瘤细胞增殖的实验研究

目的:探究PIWI相互作用RNA(PIWI-interacting RNA,piRNA)hsa_piR_016187对椎管内神经鞘瘤细胞增殖的调控作用及作用机制。方法:利用piRNA测序分析神经鞘瘤组织和对应的肿瘤旁正常组织中piRNA的表达情况,利用实时荧光定量PCR检测piRNA的表达,利用CCK-8检测和克隆增殖实验检测piRNA hsa_piR_016187对神经鞘瘤增殖的影响,利用双荧光素酶报告基因和Western blot检测piRNA hsa_piR_016187对胰岛素样生长因子2表达的调控作用。结果:piRNA hsa_piR_016187在神经鞘瘤组织中表达降低,piRNA hsa_piR_016187可以抑制神经鞘瘤细胞的增殖,双荧光素酶报告基因结果表明piRNA hsa_piR_016187可以和IGF23’-UTR区结合,Western blot检测显示过表达piRNA hsa_piR_016187抑制IGF2的表达,抑制piRNA hsa_piR_016187的表达促进IGF2的表达。结论:piRNA hsa_piR_016187通过调控IGF2的表达抑制神经鞘瘤细胞的增殖。

缺氧后处理通过piRNA-005854调控衰老心肌细胞自噬发挥保护心肌作用

背景:缺血后处理是减轻缺血再灌注损伤的有效方式之一,近年来被越来越广泛地应用于临床实践,但其具体分子机制还有待研究。目的:探讨piRNA-005854在衰老心肌细胞缺氧后处理中的作用及机制。方法:体外给予心肌细胞8 mg/mL D-半乳糖9 d诱导其衰老,β-半乳糖苷酶染色观察心肌细胞的衰老情况;衰老后细胞给予缺氧/复氧处理和缺氧后处理,ELISA检测心肌损伤标志物肌酸激酶同工酶MB以及乳酸脱氢酶水平;Western blot检测衰老心肌细胞中自噬相关蛋白LC3Ⅱ、p62和ULK1及其磷酸化ULK1的表达;qRT-PCR检测piRNA-005854的表达水平;进一步用piRNA-005854 inhibitor及piRNA-005854 mimics转染衰老心肌细胞并进行缺氧后处理,Western blot检测LC3Ⅱ、p62和ULK1及其磷酸化ULK1的表达。结果与结论:①D-半乳糖诱导9 d后心肌细胞出现明显衰老;②与正常氧组比较,缺氧/复氧组肌酸激酶同工酶MB以及乳酸脱氢酶水平增加(P<0.01);LC3Ⅱ/Ⅰ表达升高、p62表达降低、ULK1磷酸化水平升高、piRNA-005854表达升高(P<0.01);③与缺氧/复氧组比较,缺氧后处理组肌酸激酶同工酶MB以及乳酸脱氢酶水平明显减少(P<0.01);LC3Ⅱ/Ⅰ表达明显降低(P<0.05)、p62表达升高(P<0.01)、ULK1磷酸化水平降低(P<0.05)、piRNA-005854表达降低(P<0.01);④转染piRNA-005854 inhibitor后,LC3Ⅱ/Ⅰ表达降低(P<0.01),p62表达明显升高(P<0.05),ULK1磷酸化水平明显降低(P<0.01);转染piRNA-005854 mimics后,LC3Ⅱ/Ⅰ表达显著升高,p62表达降低,ULK1磷酸化水平明显增加(P<0.01);⑤结果表明,piRNA-005854介导的ULK1依赖性自噬水平降低是衰老心肌细胞缺氧后处理发挥保护作用的可能机制。

piRNA DQ725559通过抑制心肌细胞铁死亡通路抗心肌缺血再灌注损伤的作用

为探究心肌缺血再灌注损伤(Ischemia-reperfusion Injury,IRI)与铁死亡关系,寻找相关Piwi相互作用RNA(Piwi-interacting RNA,piRNA),利用小鼠乳鼠原代心肌细胞缺氧/复氧(Hypoxia/Reoxygenation,H/R)构建心肌细胞IRI模型,通过细胞生存率反映诱导铁死亡最佳H/R时间点,筛选铁死亡相关piRNA,检测铁死亡相关指标变化。研究结果显示,缺氧18 h/复氧6 h后,心肌细胞铁死亡和IRI呈现关联,抑制DQ725559的表达会加重心肌细胞铁死亡和IRI,过表达DQ725559会减轻心肌细胞铁死亡和IRI。研究结果表明,DQ725559可通过调节心肌细胞铁死亡通路发挥IRI调控作用,过表达DQ725559可成为RNA治疗心血管疾病新策略。

piRNA在肝脏相关疾病中的研究进展

piRNA是一类平均长度为24~31个核苷酸的内源性非编码RNA,在多种人类组织中特异性表达,与PIWI蛋白结合形成piRNA/PIWI复合物,在多个生理病理过程中发挥重要的调节作用。本文就piRNA生物结构、生物学功能及在肝脏相关疾病中的作用进行综述,为挖掘piRNA的潜在价值,并将piRNA应用于该类疾病的早期识别、早期诊断及治疗提供参考。

piRNA在肿瘤中的研究进展

PIWI蛋白相互作用RNA(PIWI-interacting RNA,piRNA)是一类长度18~31 nt的非编码RNA。这类RNA可以通过沉默转座子来维持基因组的完整性,并具有调控下游靶基因的转录和全基因组的DNA的甲基化状态的作用。近年来,研究发现piRNA在肿瘤中的异常表达与肿瘤的预后显著相关。piRNA主要通过影响基因组完整性等方式参与包括肿瘤在内的多种疾病的发生和发展过程。本文重点围绕近年来取得的研究进展,对肿瘤相关piRNA分子机制进行深入阐述,旨在为肿瘤精准诊疗提供新思路。

piRNA-5938可调控心肌细胞凋亡和线粒体分裂

背景:心肌细胞凋亡在心肌缺血再灌注损伤中扮演了重要角色。最新研究表明生殖系统调控分子PIWI相互作用RNA(PIWI-Interacting RNA,piRNA)参与了心脏病理过程调控,然而在心肌细胞凋亡中的作用尚未阐明,尤其涉及线粒体途径的机制尚不清楚。目的:探究piRNA-5938对心肌细胞凋亡和线粒体分裂的调节作用及分子机制。方法:深度测序检测正常和缺血再灌注模型小鼠及大鼠心脏中piRNA的表达丰度,实时荧光定量PCR法验证结果。分别用双氧水和缺氧再复氧条件构建心肌细胞凋亡模型,实时荧光定量PCR法检测piRNA-5938的表达水平。合成piPNA-5938特异性拮抗剂转染心肌细胞,再用双氧水处理,TUNEL法检测细胞凋亡情况,MitoTracker法检测线粒体分裂情况。RNAhybrid软件预测与piRNA-5938相互作用的microRNA。结果与结论:①与假手术组比,缺血再灌注小鼠心脏中422种piRNA表达水平改变,其中289条上调,133条下调;piRNA-5938的表达显著增加(P<0.01);②双氧水诱导心肌细胞凋亡后piRNA-5938的表达水平显著上调,且呈浓度依赖性(P<0.05);③缺氧再复氧诱导心肌细胞凋亡后piRNA-5938表达显著增加(P<0.01);④与阴性对照组比,敲低piRNA-5938后,双氧水诱导的心肌细胞凋亡率明显降低(P<0.05);⑤敲低piRNA-5938后,双氧水诱导的心肌细胞线粒体分裂明显得到改善(P<0.05);⑥piRNA-5938与线粒体分裂调控分子miR-324和miR-668序列能很好地互补配对,且具有高度保守性;⑦提示piRNA-5938调控了心肌细胞凋亡和线粒体分裂,并且可能通过miR-324或miR-668发挥作用。

精浆piRNAs在人群中的差异表达及其作用机制的初步探索

目的:研究piRNAs在男性患者精浆中的差异表达;构建动物模型,初步探讨piRNAs在精子发生过程中的作用。方法:收集患者的精浆样本进行测序,获得差异表达的piRNAs,利用RT-qPCR检测piRNAs在不同类型精子症中的相对表达量,探讨piRNAs对男性不育的诊断意义。另外,在小鼠模型中,通过组织病理学、RNA-protein pull-down及Western印迹等实验,初步探讨piRNAs在精子发生过程中的作用机制。结果:通过RT-qPCR对245例男性患者精浆样品进行检测,发现hsa_piR_000478在畸形精子症中高表达,且通过绘制ROC曲线,发现hsa_piR_000478对畸形精子症的诊断具有辅助意义(AUC=0.7549);小鼠模型中将hsa_piR_000478及其同源序列piR_mmu_54800729转染进小鼠生精小管,发现实验组小鼠精子活力降低、畸形率升高,且睾丸结构破坏;进一步通过分子生物学实验,发现piRNAs与能量代谢相关通路相关,其通过提升细胞糖酵解水平,干扰精子正常发生。结论:hsa_piR_000478对男性不育的诊断具有一定的辅助意义;在睾丸生精微环境中,piRNAs可能通过影响糖酵解相关通路,干扰精子发生。

妊娠期糖尿病子代脐血外泌体piRNA表达谱分析

目的探究piRNA在正常妊娠和妊娠期糖尿病(GDM)孕妇子代脐血外泌体中的表达情况,并分析其与子代糖代谢紊乱的潜在关系。方法收集正常孕妇子代和GDM孕妇子代脐血各5例,提取外泌体总RNA,采用转录组测序检测两组样本中piRNA的表达情况,设定筛选条件筛选出差异表达的piRNA,预测其靶基因,并进行功能和信号通路分析。结果在脐血外泌体中鉴定到114个已知piRNA。与正常妊娠组相比,GDM组中存在显著差异表达的piRNA共有7个,共靶向4693个基因。生物信息学分析表明,这些piRNA靶基因主要富集于胰岛素信号通路、Hippo、TGF-β、mTOR、FoxO和Wnt信号通路。结论在正常孕妇与GDM孕妇子代脐血外泌体中piRNA存在差异表达,piRNA影响子代糖代谢的具体机制有待深入研究。

piRNA-102526参与缺氧/复氧诱导心肌细胞焦亡作用及机制研究

为探究piRNA-102526与心肌细胞焦亡的关系,体外构建小鼠乳鼠原代心肌细胞缺氧/复氧模型,设置3 h、6 h、9 h、12 h、24 h缺氧时间梯度及6 h复氧条件,检测小鼠乳鼠原代心肌细胞焦亡水平。利用qRT-PCR检测piRNA-102526表达水平,Western Blotting检测焦亡相关蛋白(GSDMD、Caspase-1、IL-1β、ASC)表达,PI染色和LDH活性检测细胞死亡。研究结果显示,小鼠乳鼠原代心肌细胞缺氧6 h/复氧6 h,细胞焦亡相关蛋白表达水平最高。抑制piRNA-102526表达,小鼠乳鼠原代心肌细胞焦亡加剧,过表达piRNA-102526,小鼠乳鼠原代心肌细胞焦亡减少。这表明,piRNA-102526能通过Caspase-1参与经典焦亡通路,调节小鼠乳鼠原代心肌细胞焦亡过程。

piRNA-001184在多发性骨髓瘤中的表达及其与CTGF、CDKN2A基因甲基化的相关性研究

目的探讨piRNA-001184在多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)中的表达及其与CTGF、CDKN2A基因甲基化的相关性。方法选取2020年8月至2022年12月于内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院就诊的69例MM患者纳入实验组,收集同期18例缺铁性贫血患者纳入对照组。应用荧光定量聚合酶链反应检测患者的piRNA-001184表达水平,采用Pearson线性相关分析piRNA-001184与CTGF、CDKN2A表达水平的相关性。结果实验组患者的piRNA-001184表达水平显著高于对照组[(21.56±6.19)vs.(10.60±2.45),t=7.388,P<0.001]。不同病程患者的piRNA-001184表达水平比较差异有统计学意义(F=110.977,P<0.001),表达水平依次为初发组>复发组>缓解组。不同国际分期系统(international staging system,ISS)患者的piRNA-001184表达水平比较差异有统计学意义(P<0.05),表达水平依次为Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期。piRNA-001184表达水平与CTGF、CDKN2A基因表达水平均呈正相关(P<0.05)。结论MM患者piRNA-001184表达明显上调。监测piRNA-001184可能对MM的诊断、分期及预后判断有参考价值。

高血压病患者血浆中piRNAs表达谱分析

目的:采用PIWI-RNA(piRNA)表达谱技术筛选原发性高血压病患者与正常健康人群血浆中差异性表达的piRNAs;运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对表达谱中差异表达的piRNAs进行验证;选取一个高表达piRNA并分析与高血压病患者临床资料的关联性,为探索piRNA作为高血压发病的重要环节奠定理论基础。方法:收集5例高血压病患者和5例健康人血浆中的总RNA,运用piRNA表达谱技术检测两组中piRNAs的表达情况,设定筛选条件筛选出差异表达的piRNAs。在72例高血压患者及72例对照者血浆样本中应用qRT-PCR技术对5个表达上调和5个表达下调的piRNAs进行验证,并明确其表达情况。收集高血压病患者的临床资料,分析piR-37390与临床病例资料的关联性。结果:piRNA表达谱结果显示,与健康人群组相比,高血压病患者血浆中差异表达的piRNAs有4845种,其中2322种piRNAs表达上调,2523种表达下调。当设定P值<0.01且差异倍数>3倍条件后选出5个高表达的piRNAs和5个低表达的piRNAs,再应用qRT-PCR实验验证1种表达上调的piRNA(piR-37390)以及2种表达下调的piRNAs(piR-43926和piR-45076),P值均<0.05。统计学分析piR-37390与高血压病患者临床资料的关系,得出piR-37390表达与高血压病级别(P=0.000)、HDL-C(P=0.001)、肾素(P=0.032)和醛固酮(P=0.028)密切相关(均P<0.05),与血管紧张素Ⅱ几乎有关联(P=0.053),但是与患者年龄、性别、BMI、TG、LDL-C、COR和ACTH均无关联(均P>0.05)。结论:本实验收获了高血压病患者血浆中piRNAs表达谱特征,并验证了高血压病患者血浆中piR-37390表达上调;piR-37390与高血压病的发生可能有关联,参与或促进了高血压病的形成;为piRNAs作为高血压病的形成和治疗奠定理论基础,提供了新的思路。

piRNAs在法医学体液鉴定中的能力评估

本文探究9个非编码Piwi-interacting RNA(piRNA)分子在法医常见体液中的表达差异,利用统计学方法评估靶标分子的体液区分能力,为法医学中常见体液(斑)鉴定提供方法补充。研究收集120份法医常见的人源体液样本(包括外周血、月经血、精液、唾液和阴道分泌液),采用实时荧光定量PCR法检测5种体液中靶标piRNAs分子的表达,并用Genorm、NormFinder、BestKeeper软件和ΔCt四种方法评估3种内参的稳定性,分析其在各体液中的相对表达量ΔCq的差异性,筛选出9个可用于体液区分的标记分子。针对当前法医唾液和阴道分泌液区分的难点问题,本研究利用多分子组合建立支持向量机分类模型(support vector machine,SVM)实现唾液和阴道分泌液的鉴定。此外,通过检测模拟案件样本中piRNAs的相对表达量变化评估该类小分子的稳定性。本研究筛选出9个可用于体液斑迹鉴定的标记分子,利用其中3个piRNAs分子piR-33151、piR-31662、piR-31925组合,建立起SVM分类模型可用于唾液和阴道分泌液的有效鉴别,准确性可达100%。3个分子在室内晾干12个月或紫外照射48 h的样本中仍可检测出。本研究结果表明:piRNAs分子在不同体液中的相对表达具有显著性差异,具有鉴别法医学中常见体液类型的能力,建立的分类模型可高效准确地区分唾液、阴道分泌液,具有较大的应用潜力。

双荧光素酶报告技术验证piRNA-DQ566704对smad2基因的靶向调控

目的通过双荧光素酶报告技术验证piRNA-DQ566704对smad2基因的靶向调控作用。方法从小鼠肝星状细胞基因组中获取smad2基因的3′UTR序列,分别合成包括piRNA-DQ566704结合位点在内的smad2基因的3′UTR的野生型(WT)和突变型(MUT)基因片段,构建野生型(pGL6-miR-smad2-3′UTR-WT+pRL-TK)和突变型(pGL6-miR-smad2-3′UTR-MUT+pRL-TK)smad2双荧光素酶报告基因载体。将smad2野生型与突变型双荧光素酶报告基因载体分别与piRNA-DQ566704 mimic、piRNA-DQ566704 inhibitor和阴性对照(NC)等各组共转染293T细胞,检测各组相对荧光素酶活性,观察piRNA-DQ566704对smad2基因表达的影响。通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)和Western blot验证小鼠肝星状细胞转染piRNA-DQ566704 mimic、inhibitor、mimic NC后,小鼠肝星状细胞中smad2 mRNA和smad2蛋白的表达。结果携带piRNA-DQ566704 mimic和smad2-3′UTR-WT的构建体的相对荧光素酶活性明显下降(P<0.001),而对smad2-3′UTR-MUT的构建体的相对荧光素酶活性无抑制作用(P>0.05)。在小鼠肝星状细胞中过表达piRNA-DQ566704后,mimic组smad2 mRNA和smad2蛋白的表达明显降低(P<0.001)。结论piRNA-DQ566704可以靶向调控smad2基因的表达,smad2是piRNA-DQ566704的直接靶基因。

siRNA、piRNA与缺血性心脏病的相关研究进展

人类基因转录组序列之中,既存在编码蛋白质的RNA序列,也存在许多小片段的非编码RNA序列。随着深入研究人类基因组以及基因功能,我们对小分子非编码RNA功能的认识也在逐步加深。这些RNA不但参与生命活动的一些基本过程,如细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化以及细胞代谢等,而且与人类许多疾病,尤其与缺血性心脏病的发生发展关系密切。本文就小分子非编码RNA(siRNA、piRNA)在缺血性心脏病中的相关研究进展进行综述,以期为更好地治疗缺血性心脏病提供新思路。

piRNA通路在生精过程中的作用

piRNA是一类特异性与Argonuat蛋白家族中的PIWI蛋白相互结合形成piRNA沉默复合体(piRNA-induced silencing complex,piRISC)而在生物体内发挥重要作用的非编码小RNA,主要作用于生殖系统。piRNA通路不仅通过抑制转座子,还通过泛素化降解、调控mRNA表达、基因甲基化修饰等方式来发挥在生精过程中的特定作用。本文拟对piRNA通路在生精过程中的作用进行综述。

piRNA通路与精子发生的研究进展

与PIWI蛋白相互作用的RNA(piRNA)是一类动物生殖系细胞特异性表达的小分子非编码RNA。本文从piRNA分子、PIWI蛋白及其他相关蛋白3个方面系统概括了piRNA通路。发现piRNA通路不仅通过抑制转座子机制,还可以通过调控翻译、生殖系干细胞的维护、RNA的降解、基因防御等方面来影响精子发生。因此对piRNA通路在精子发生中的最新研究进展进行了综述。

线虫体内新piRNA研究

PIWI-interacting RNAs(piRNA)是一类內源性小RNA,负责抵御转座子和转基因对基因组的入侵.已发现1.6万多种piRNA,在piRNA上游存在保守序列,根据上游序列特征可以预测新的piRNA.将线虫同步化培养至L4时期,分别提取野生和prg-1突变样本中的小RNA,并对其进行高通量测序.基于piRNA上游保守序列特征,在野生线虫L4时期中,发现了967种新piRNA,这些新piRNA在prg-1突变后表达消失.新piRNA的基因座集中分布在四号染色体的2个piRNA簇内,首位碱基以U为主.与已发表的成虫发育时期的PRG-1免疫共沉淀数据比对,发现有153种piRNA存在于与PRG-1免疫沉淀的数据中.同时还发现一些只在野生线虫中表达的non-21nt小RNA,它们与已知piRNA的基因座相同,推测这些non-21nt小RNA可能是其piRNA前体加工的产物.总之,通过小RNA测序,在线虫中发现了一些新的piRNA.

鹌鹑piRNAs和Piwil1基因克隆及表达研究

【目的】目前,国内外尚无有关禽类piRNAs及其结合蛋白Piwi的研究报道,开展禽类小分子RNA及其结合蛋白的研究将为小分子RNA的遗传特性、发生和消失机理以及转基因鸡等研究提供基础依据。【方法】以鹌鹑为研究对象,通过构建cDNA文库和TA克隆测序的方法从睾丸组织中获得piRNAs序列和Piwil1基因的CDS序列,同时采用Q-PCR技术分析了鹌鹑不同生命阶段不同组织中piRNAs和Piwil1基因的表达规律。【结果】从鹌鹑睾丸组织中克隆了13个piRNAs序列和Piwil1基因的CDS序列;Q-PCR结果表明piRNAs和Piwil1基因在鹌鹑不同生命阶段不同组织中均有不同程度地表达。【结论】鹌鹑piRNAs长度与哺乳动物相似;Piwil1基因与红色原鸡有较高的同源性,包含PAZ和Piwi结构域,无信号肽剪切位点,推测其属于Piwi家族蛋白,可能通过降低结合RNA的能力或者影响其它转录因子与结构基因启动子的亲和性发挥调控作用;在睾丸组织中,piRNAs和Piwil1蛋白的表达量均是随着个体的不断发育而增加,推断在禽类中piRNAs可能与Piwi蛋白相互作用共同调控精子的发生过程。

小RNA家族的新成员-piRNA

microRNA(miRNA)和small interfering RNA(siRNA)在真核生物生命活动的基本过程中发挥着重要的调节作用。随着对siRNA和miRNA研究的不断深入,最近科学家在研究大鼠雄性精子时发现哺乳动物睾丸内存在另一种新型的小RNA分子,该分子在精子发生过程中起着重要的生理调节作用,该种小分子RNA被命名为piRNA,在功能、分布和分子特征等方面piRNA较miRNA和siRNA存在着显著的不同,对piRNA深入研究有望揭示出机体内在的基因表达调节机制。

精浆piRNA对精子DNA完整性及辅助生殖技术结局的影响

目的通过检测男性不育症患者精浆中存在的睾丸特异piRNA与精子DNA损伤程度的关系,探讨其对精子DNA完整性及辅助生殖技术(ART)结局的影响。方法分析149例男性不育症患者精液质量及精子DNA完整性;按精子DNA碎片指数(DFI)将不育症患者分为:A组(DFI≤15%)、B组(15%<DFI<30%)、C组(DFI≥30%),采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Q-PCR)检测各组患者精浆中piRNA-013423和piRNA-023386的表达量,比较各组患者受精率、卵裂率、优胚率、生化妊娠率及临床妊娠率的差异。结果与A、B组比较,C组的精子密度、前向活动精子、精子活动率、正常形态率均明显下降(P<0.05),A、B两组比较,B组精子活动率下降(P<0.05)。A、B、C三组中,C组患者piRNA-013423、piRNA-023386表达均低于A、B组(P<0.01);C组患者受精率、卵裂率、优胚率、生化妊娠率及临床妊娠率均低于A、B组(P<0.01)。结论男性不育症患者存在精子DNA不同程度的损伤,精浆中piRNA的水平与精子DNA完整性有关,DNA完整性差的患者精浆piRNA表达降低,且影响ART临床结局。提示piRNA可能通过某些信号通路调控精子DNA损伤,但具体机制需要下一步深入研究探讨。