甲醇毕赤酵母Pichia methanolica的高效电转化方法

采用电穿孔的方法对甲醇毕赤酵母进行外源DNA的转化。通过调整参数,对影响电转化效率的主要因素进行探索,建立了质粒pMETA-Lip对甲醇毕赤酵母PMAD16的高效电转化方法。结果表明,当采用对数生长中期的菌体制备感受态细胞、质粒DNA浓度为30μg/mL、采用0.2cm电转杯、电压为600 V时,转化率达到最大值,为57个转化子/μg质粒DNA。经抽样鉴定所得到的转化子均为阳性克隆。为外源基因在甲醇毕赤酵母中的表达奠定了基础。

鸡白细胞介素-2基因在Pichia methanolica酵母中的表达

鸡白细胞介素-2(chIL-2)是近年来新发现的一种禽类细胞因子.为建立用甲醇型酵母Pichiamethanolica(P.methanolica)表达鸡白细胞介素-2基因(chIL-2)的新途径,将chIL-2基因插入到P.methanolica分泌型表达载体pMETαA构建了重组PMAD11表达菌株(pMETαA/rchIL-2).经SDS-PAGE、Western印迹测定,证实chIL-2基因在P.methanolica中表达成功,rchIL-2的分子量约为16kDa,其表达量占分泌总蛋白的35%.

猪乳铁蛋白基因克隆及其在P.methanolica系统中的表达研究

为了研究猪乳铁蛋白(PLF)基因克隆及其在酵母(P.methanolica)系统中的表达,试验从泌乳15 d的约克夏母猪乳腺组织中提取总RNA,应用RT-PCR技术扩增猪乳铁蛋白基因,获得1条长为2 115 bp的目的片段,将目的基因克隆到酵母表达载体pMET-B中,采用电转化法转化P.methanoli-ca感受态细胞PMAD11;选取Ade+MutS重组子进行诱导培养,产物纯化后进行SDS-PAGE和West-ern-blot分析及其他生物学特性分析。结果表明:rPLF在P.methanolica表达系统中表达,表达产物的分子质量约为78.0 ku;在第144小时时表达量最高,最佳pH值为7.0,最佳铁离子浓度为100μmol/L;重组PLF对大肠杆菌ATCC25922有抑菌效果,而且抑菌效果随着浓度的升高随之增强。

木质素过氧化物酶基因(LipH8)的克隆及在甲醇毕赤酵母中的表达

以黄孢原毛平革菌 (Phanerochaetechrysosporium)RNA为模板 ,克隆LipH8基因片段 ,研究LipH8基因在甲醇毕赤酵母中的表达。构建了甲醇酵母表达质粒pMETA_LipH8载体 ,并将其线性化后用电穿孔法导入PichiamethabolicaPMAD16 ,部分阳性克隆的PCR结果表明LipH8基因已经整合到甲醇毕赤酵母染色体上 ,经摇瓶培养筛选出表达水平较高的酵母工程菌株。胞外木质素过氧化物酶活力达 932U L。

杂色云芝漆酶基因在甲醇毕赤酵母中表达条件研究

重组甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)工程菌PMAD16/pMETA-Lcc1能分泌表达杂色云芝重组漆酶。本文通过对其发酵条件的研究,找出瓶发酵表达漆酶的最适培养条件:在BMMY培养基中添加0.2mmol/L的Cu2+,装液量为25mL/250mL三角瓶,接种量体积之比为45:25,0.5%甲醇诱导,20℃条件下瓶培养5d,漆酶最高酶活力达1192U/L。

弓形虫SAG1成熟蛋白编码区基因在甲醇酵母中的初步表达

目的 分析弓形虫主要表膜蛋白SAG1在甲醇酵母高效表达系统表达的可行性。方法 在 5′端和3′端引物分别引入EcoRⅠ和SpeⅠ酶切位点 ,PCR扩增SAG1成熟肽编码区基因 ,定向克隆到甲醇酵母分泌型表达质粒pMETαA中 ,构建不带 6个组氨酸尾序列的重组质粒。重组质粒被PacⅠ酶切下表达盒 ,氯化锂化学法转化腺嘌呤营养缺陷型毕赤甲醇酵母株PMD11和PMD16 ,通过腺嘌呤营养缺陷型选择培养基YPD筛选酵母重组子 ,并利用MM/MD选择培养板分析外源基因表达盒整合到重组酵母染色体中的方式。筛选甲醇利用野生型的重组酵母 ,用甲醇诱导表达 ,并分析SAG1的表达水平 ,从中筛选高表达转化子。结果 获得了经非同源重组整合到酵母染色体上的能有效利用甲醇作为唯一碳源的PMD11和PMD16转化株。在甲醇诱导后第 3天 ,细胞裂解液SDS PAGE检测开始出现分子量与目的蛋白预测分子量相同的蛋白带 ,但PMD11重组株中的该蛋白随培养时间延长而减少 ,而PMD16重组株中的目的蛋白量未见减少。上清中有 4 0kDa和 2 7kDa的两种蛋白 ,后者的量大于前者 ,并与SAG1成熟肽的大小一致 ,PMD16株的表达量大于PMD11株 ,总蛋白量约 35 μg/ml。 结论 弓形虫SAG1基因可在甲醇酵母表达系统中表达 ,但PMD11宿主菌会降解外源蛋白 ,而缺失了蛋白酶的PMD16?

漆酶基因的克隆及在甲醇毕赤酵母中的表达

以白腐菌杂色云芝RNA为模板,通过RT-PCR获得不带自身信号肽漆酶Lcc1基因的cDNA片段。构建了重组表达载体pMETαA-Lcc1,并将其线性化后用电穿孔法导入Pichia methabolica PMAD16,PCR结果表明Lcc1基因已经整合到甲醇毕赤酵母染色体上。经摇瓶培养筛选出表达水平较高的酵母菌株,漆酶酶活力达78U/L。

甲醇毕赤酵母表达木质素过氧化物酶的研究

将含有黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosprium)木质素过氧化物酶基因的甲醇毕赤酵母工程菌进行了鉴定和筛选,筛选得到木质素过氧化物酶活力高的菌株PMLIP08。确定了一步法发酵的最优葡萄糖浓度,优化其发酵培养条件,结果表明葡萄糖的添加量为10g/L时,发酵条件为pH3.0,诱导温度24℃,培养时间12h,甲醇添加量1.1%,诱导时间72h后发酵液中酶活可达4888U/L。

Reteplase基因的克隆及在甲醇毕赤酵母中的表达

进行了组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)突变体Reteplase(r-PA)基因的克隆,并在甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)中实现了胞外表达。以基因工程菌株里氏木霉(Trichoderma reesei)306染色体DNA为模板,通过PCR技术克隆了r-PA基因,将扩增产物克隆到pMD18-T载体上并进行了序列测定。测序结果表明:克隆到的基因序列长1.1 kb,与已发表的Reteplase基因同源性达99.91%,其编码的氨基酸顺序一致。文中还构建了甲醇毕赤酵母分泌性表达载体pMETαA-r-PA,用PacⅠ单酶切将pMETαA-r-PA线性化后,采用电转化的方法将其导入甲醇毕赤酵母PMAD16中,PCR和表型鉴定表明,筛选到Reteplase基因已经整合到甲醇毕赤酵母染色体上的阳性克隆。经摇瓶初步培养及以甲醇为唯一碳源诱导表达,胞外Reteplase表达水平最高达27.93mol/(s.L)。

黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶基因在甲醇毕赤酵母中的表达

将编码黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶(lip)的cDNA克隆到酵母整合型质粒pMETA上,电转化Ade缺陷型甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)PMAD16,通过MD平板及PCR方法筛选和鉴定重组子。重组子发酵液经SDSPAGE分析和木质素过氧化物酶活力测定等方法鉴定,表明带自身信号肽的黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶基因(lip)在甲醇毕赤酵母中得到表达。优化其发酵培养条件,以藜芦醇为底物进行酶活测定,其酶活可达932U/L。相应发酵指数为12.94U/h·L。比出发菌株提高了24.18%。

甲醇毕赤酵母电转化条件的研究

采用电转化的方法,将携带有tPA355基因的DNA片段转化进甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)。通过调整参数,对影响电转化效率的主要因素进行探索,建立了质粒pMETα-tPA355对甲醇毕赤酵母PMAD16的高效电转化方法。

毕赤嗜甲醇酵母工程菌高密度培养表达黑曲霉菊粉内切酶的研究

目的:对毕赤嗜甲醇酵母工程菌inu-26高密度培养表达黑曲霉菊粉内切酶的条件进行优化,找出最佳的外源蛋白表达条件。方法:在摇瓶优化培养的基础上进行发酵罐高密度培养,优化最佳产酶条件。结果:以葡萄糖为碳源、微量元素添加量100～200mL/L、甲醇浓度1g/L、pH6.0～7.0、诱导时间96h时酶的表达量最高;摇瓶模拟高密度培养表明影响酵母生长的最主要因素葡萄糖和硫酸铵的最佳浓度分别为20～45和11.5g/L;利用培养基F1进行高密度培养优于其他培养基,工程菌生长符合指数生长曲线,细胞生长延迟期为1.36h,比生长速率μ为0.4846h-1。结论:以葡萄糖为碳源,采用葡萄糖-甲醇混合诱导和100%甲醇单一诱导相结合,在菌体鲜重约为280g/L时连续诱导96h,菌体生长良好,不会出现自溶,且酶的表达量最高,为摇瓶培养的3倍多,酶活最高可达540 U/mL。

鸡白细胞介素-2在毕赤酵母中的表达

将鸡白细胞介素-2(ChIL-2)基因插入酵母分泌型表达载体pPIC9K构建重组表达载体pPIC9K/ChIL-2,通过电转化构建毕赤酵母(Pichia methanolica)GS115甲醇利用型重组表达菌株.经SDS-PAGE与Western blot分析,证实ChIL-2基因在重组GS115中成功表达出约16 ku与14 ku两条特异性条带,这与天然ChIL-2相对分子质量大小一致,提示ChIL-2可能为糖基化蛋白质.

去信号肽的木质素过氧化物酶基因在甲醇毕赤酵母中的表达

研究了LipH8基因在甲醇毕赤酵母中的表达.以黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)RNA为模板,克隆LipH8基因片段.构建了甲醇酵母表达质粒pMETαA-LipH8载体,并将其线性化后用电穿孔法导入PichiamethabolicaPMAD16,部分阳性克隆的PCR结果表明LipH8基因已经整合到甲醇毕赤酵母染色体上,经摇瓶培养筛选出表达水平较高的酵母工程菌株.胞外木质素过氧化物酶活力达1933U/L.