利用重组Pichia pastoris生产腺苷甲硫氨酸

为改造甲醇利用型酵母Pichiapastoris来生产腺苷甲硫氨酸 (SAM ,S adenosyl L methionine) ,我们将一个带有SAM合成酶基因的胞内表达质粒转化入Pichiapastoris菌株GS115 ,经过G418抗性筛选得到一株有两个基因拷贝的转化子。该菌在含有甲醇和甲硫氨酸的培养基中生长 5d后 ,其细胞内的SAM的产量比原始菌株提高了 30余倍。对该菌生产SAM的培养基中的碳源与氮源进行了优化 ,结果显示碳源的控制对该菌SAM产量的影响很大。在试管水平 ,该菌在含有 0 .75 %的L methionine并且碳源和有机氮源经过一定程度优化的培养基中 ,生长 6d后SAM产量达到 1.5 8g L。

高效液相色谱法同时测定Pichia pastoris发酵过程中腺苷甲硫氨酸相关的六种物质

建立了用高效液相色谱同时测定Pichia pastoris菌体中腺苷甲硫氨酸及其代谢相关物质(AMP,腺苷,腺嘌呤,SAH)。采用Hypersil SCX色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),柱温是30℃,流动相是0.5 mol/L甲酸铵(用甲酸调至pH 4.0),流速为2.0 mL/min,检测波长是254 nm。结果表明该方法可以直接从细胞裂解液对六种物质进行分离和定量。该测定方法简便、可靠、准确、灵敏度高,有利于说明Pichia pastoris发酵产腺苷甲硫氨酸过程中的代谢情况。

利用Pichia pastoris生产S-腺苷甲硫氨酸的发酵工艺

在摇瓶中考察了重组Pichia pastoris发酵的诱导剂量,L-甲硫氨酸,以及pH对腺苷甲硫氨酸产量的影响。放大到3.7 L发酵罐和30 L发酵罐后,研究了重组细胞的发酵过程变化,对S-腺苷甲硫氨酸初步纯化。摇瓶中优化后的发酵条件是:每天添加1%甲醇诱导,L-甲硫氨酸为50mmol/L,培养基pH 5.0。培养144 h后SAM产量达到2.32 g/L。3.7 L发酵罐中发酵251 h后细胞浓度为120 g/L,SAM总量为15.18 g。放大到30 L发酵罐中,发酵225.5 h后细胞浓度约为120 g/L,SAM总量为145.05 g。纯化后SAM的纯度为93.5%,回收率为84.5%。

乙型肝炎病毒表面抗原preS2+S基因在Pichia Pastoris酵母系统的分泌表达

拟获得adw2亚型乙型肝炎(乙肝)病毒表面抗原preS2+S基因在PichiaPastoris酵母分泌型表达系统(pPIC9K)的高效表达。实验首先将adw2亚型乙肝病毒表面抗原preS2+S基因重组到分泌型酵母表达载体(pPIC9K)形成表达质粒,电转化酵母细胞KM71,G418筛选多拷贝整合克隆,经甲醇诱导表达并用SDS-PAGE电泳及酶免疫法检测表达产物。经100个克隆筛选获得了表达量较高的表达菌株WC4。该菌株甲醇诱导后细胞上清10倍浓缩SDS-PAGE电泳检测显示,细胞上清中有特异蛋白条带,且第6天表达量最高,表达产物单体分子量为31kD左右。用美国雅培公司AUZYMEMONOCLONAL试剂盒估算表达量为2μg/100OD600细胞。上述结果表明,乙肝病毒表面抗原preS2+S基因在本系统中获得了分泌表达。同时检测了酵母细胞裂解液中特异蛋白质的表达,结果发现,自甲醇诱导后第一天即可检测到表达产物,而且除了第6天细胞外表达量高于细胞内外,其余各天的表达水平均表现为细胞内高于细胞外。以上结果提示,利用分泌型酵母表达系统表达乙肝病毒表面抗原在技术上可行,但表达产量偏低,一些蛋白滞留在细胞内未能分泌到培养基中。

发酵重组Pichia pastoris生产腺苷甲硫氨酸的研究

在 5L发酵罐中对高产S 腺苷甲硫氨酸的重组Pichiapastoris发酵进行了研究。重组菌在 pH5 .0生长 ,然后调为 pH6 .0积累腺苷甲硫氨酸 ,在 30℃、溶氧 5 %及流加甲硫氨酸和尿素的条件下培养 82h后 ,产量达 4 .3g L。

重组Pichia pastoris的发酵条件初步研究

在摇瓶中进行重组Pichiapastoris菌株SIBAS5071发酵条件的研究,考察了碳源、底物、pH、磷酸盐浓度、溶氧量等对该菌细胞生长和产生S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的影响,初步确定的优化条件下发酵3d后,SAM产量可达2.3g/L(118mg/g干细胞)。

抑制剂对Pichia生产S-腺苷甲硫氨酸的作用及机制

S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)是市场前景广阔的高价值氨基酸。为通过削弱胞内SAM消耗而进一步提高其积累量,作者在诱导型和组成型P.pastoris发酵后期添加3种抑制剂。首先考察其作用并比较其差异,然后分析其机制。结果显示,添加S-腺苷高半胱氨酸水解酶抑制剂Aristeromycin有助于SAM积累,但比较而言,其在诱导型酵母中最适添加质量浓度更低,很可能因为甲醇代谢导致的氧化胁迫使细胞对甲基化作用依赖性增强。添加多胺合成抑制剂DFMA有利于SAM积累,但添加过多对细胞生长和抗氧化不利。组成型酵母中添加7.5 g/L乙酸可通过抑制多胺生成而增强SAM积累。3种抑制剂均可有效提高P.pastoris中SAM产量。

猪传染性胃肠炎病毒S基因B和C抗原位点片段在毕赤酵母中的表达

采用基因重组的方法构建了含有猪传染性胃肠炎病毒S基因B和C抗原位点片段的巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris分泌型表达载体pPIC9K-ts,经线性化后采用电穿孔法将其导入毕赤酵母GS115中,大量筛选后获得高效表达外源蛋白的毕赤酵母工程菌株GS115/pPIC9K-ts。表达蛋白经Dot-ELISA检测具有良好的抗原性。本研究为TGE的血清学检测方法的建立提供了必要的物质基础。

甘蓝自交不亲和信号传导中THL1和SRK相互作用的体外检测

在甘蓝自交不亲和信号传导中SRK和THL1之间可能存在相互作用。为进一步证实该相互作用,以甘蓝E1为材料,采用RT-PCR技术扩增了THL1和SRK激酶结构域(记为SRKE1)编码序列,构建了THL1原核表达质粒pET43.1-THL1,SRKE1原核表达质粒pET431-SRKE1和真核表达质粒pPIC9K-SRKE1,分别在宿主菌大肠杆菌BL21和毕赤酵母GS115中进行表达。THL1融合蛋白经胰岛素检测,表明表达的THL1有氧化还原活性。建立了体外检测蛋白质相互作用的新方法,并用该方法对THL1与SRKE1的相互作用进行了检测,结果表明THL1可与SRKE1相互作用并形成稳定的复合体,这为深入分析THL1与SRK相互作用机理提供了理论和技术基础。

毕赤酵母Mut^+和Mut^s重组子表达美洲商陆抗病毒蛋白基因的比较

将N末端信号肽和C末端毒性区域缺失突变的美洲商陆抗病毒蛋白 (pokeweedantiviralprotein ,PAP)基因表达载体pPIC9K P酶切线性化后 ,通过电击转化整合到巴氏毕赤酵母 (Pichiapastoris)GS115菌株细胞中 ,PCR筛选出表型为利用甲醇快速型(Mut+ )的重组子。在相同培养条件下比较Mut+ 重组子和利用甲醇缓慢型 (Muts)重组子在表达缺失突变型PAP方面的异同。结果表明 ,诱导培养 4 8h后 ,Mut+ 重组子表达产物在SDS PAGE胶上可见清晰目的带 ,而Muts 重组子培养 72h才能见到微弱的目的带。抗病毒活性实验表明Mut+ 重组子和Muts 重组子的表达产物均对TMV病毒侵染有明显的抑制作用 。

汉坦病毒S基因毕赤酵母表达系统的构建

目的构建汉坦病毒HTN型和SEO型S基因毕赤酵母表达系统。方法应用RT-PCR法扩增汉坦病毒Z10株和L99株编码核蛋白的S基因,将扩增产物分别与pGEM-T-Easy载体连接,经序列分析后双酶切,分别定向克隆入载体pPICZαΑ和pPICZαC,继而将重组质粒以SacⅠ线性化并电转化入毕赤酵母X33感受态细胞,用Zeocin筛选高拷贝转化子进行鉴定。结果PCR扩增产物约为1290bp,与T载体相连测序结果与Genbank相应序列比较,核苷酸序列同源性分别为99.84%和99.92%,其编码蛋白质二级结构均无改变。定向克隆获得pPICZα-ΑZ10S和pPICZ-αL99S,分别电转化得到巴氏毕赤酵母重组菌株PpX33-Z10S和PpX33-L99S,提取其基因组DNA经PCR鉴定与预期相符。结论成功构建汉坦病毒HIN型和SEO型S基因毕赤酵母表达系统,为进一步研究奠定基础。

利用间隔肽促进S-腺苷甲硫氨酸合成酶在毕赤酵母中的分泌表达

S-腺苷甲硫氨酸(SAM)是所有生物体中都存在的一种重要分子,对维持生物体功能具有重要的作用,已经被广泛地用于治疗肝脏疾病、关节炎和忧郁症等多种疾病。利用巴斯德毕赤酵母KM71构建基因工程菌K/9KM,在AOX1启动子调控下分泌表达达观链霉菌(Streptomyces spectabilis)来源SAM合成酶(MAT)。为促进MAT的分泌,在信号肽Kex2p切割位点后引入间隔肽G-Spacer(NTTEEGEPK),构建重组菌K/GM,其重组蛋白(GM)表达量达到84.7 mg/L,分泌效率提高了92%,MAT比酶活提高了58%。在重组蛋白GM的C端融合表达His-tag,构建重组蛋白GMH表达重组菌K/GMH,GMH的MAT比酶活比GM下降13%,但分泌效率无显著改变。因此,间隔肽G-Spacer对MAT的酶活及分泌有显著的促进作用,而His-tag会降低MAT的酶活力但不影响其分泌效率。所构建的MAT分泌表达基因工程菌K/GMH,在目的蛋白C端融合表达His-tag可减少分离纯化步骤和产物损失,易于酶促转化法生产SAM。

舍格伦综合征A抗原（SSA60）在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达及胶体金快速检测方法的建立

目的在巴斯德毕赤酵母中表达舍格伦综合征A抗原（SSA60）并建立胶体金快速检测方法。方法表达质粒pPIC9k—SSA60用电穿孔法转化酵母菌SMD1168，在MD平板上筛选重组克隆，用G418快速筛选高拷贝转化子，阳性克隆经甲醇诱导表达后，培养上清用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）和斑点免疫金渗滤法（DIGFA）鉴定。结果表达产物SSA60的分子量约60000，高拷贝巴斯德毕赤酵母转化菌的表达水平明显高于低拷贝的，表达量占分泌总蛋白60％以上，产物浓度为600～950mg／L。DIGFA检测85份舍格伦综合征（SS）患者血清和30份正常人血清，抗SSA检测阳性率为95．3％（81／85），特异度为100％（30／30）。与德国欧蒙ENA酶斑点法对比检测的符合率为96．5％（111／115），差异无统计学意义（P〉O．05）。结论SSA60在巴斯德毕赤酵母中获得高效分泌表达，DIGFA简便、快速、准确，可用于临床自身免疫病的诊断。

毕赤酵母发酵产S-腺苷蛋氨酸的甘油-甲醇混合流加策略

在毕赤酵母发酵生产S-腺苷蛋氨酸(SAM)的诱导阶段,以不同甘油-甲醇比例的甘油-甲醇混合培养基进行诱导培养,结果表明以10%(w/v)甘油含量的甘油-甲醇混合培养基进行诱导培养时最有利于SAM的表达,SAM产量达6.09 g/L,比0%甘油含量条件下的SAM产量提高了20.4%。对诱导方式进行优化,先以100%甲醇诱导24 h,然后再连续流加10%(w/v)甘油含量的甘油-甲醇混合培养基,SAM产量可达7.94 g/L,在此基础上,进一步改进诱导方式,SAM产量得到进一步的提高,达到9.80 g/L。

多胺对毕赤酵母合成S-腺苷甲硫氨酸的影响

S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)是一种需求量巨大的活性氨基酸。SAM生产主要是利用过表达甲硫氨酸腺苷转移酶(methionine adenosyltransferase,MAT)的毕赤酵母(Pichia pastoris)进行胞内合成,但较高密度培养条件下甲醇诱导会造成一定程度的细胞死亡。本研究首先揭示甲醇对P.pastoris造成过氧化损伤,然后分析了添加多胺(腐胺和亚精胺)对SAM合成影响及机制。结果揭示多胺可提高H2O2酶活力,从而缓解细胞氧化损伤,此外还改善了MAT酶活力和细胞生长,最终SAM的积累水平提高19.2%。

中心组合优化重组毕赤酵母生产S-腺苷甲硫氨酸用发酵培养基

利用统计学实验设计方法优化了重组毕赤酵母生产S-腺苷甲硫氨酸（sAM）的发酵培养基。采用中心组合设计和响应面分析对诱导相培养基中硫酸铵、甲醇和L-甲硫氨酸三个关键因素的浓度进行了优化，使SAM在全合成培养基上的摇瓶产量提高了60％，达到1．9g／L，并考察了胞内SAM合成酶活性的变化与SAM积累的相关性。

重组毕赤酵母生产S-腺苷甲硫氨酸的甲醇-甘油交替补料发酵的优化

S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)是一种需求量巨大的活性氨基酸,而利用毕赤酵母催化合成SAM是主要生产方法。为提高SAM产率,本文对前期构建的表达源于天蓝色链霉菌SAM合成酶的重组毕赤酵母菌的甲醇-甘油交替补料发酵策略进行了优化。并考察了补加蛋白胨对SAM积累的影响。结果显示最佳策略为控制诱导起始细胞密度170g/L,逐步延长诱导后期甘油流加时间,并添加0.5%蛋白胨。SAM在88 h积累量达14.7g/L,产率提高45.6%,达167.0 mg/L/h。

毕赤酵母合成S-腺苷甲硫氨酸过程谷胱甘肽流量分析与控制

S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)是一种具有广阔应用前景的活性氨基酸,利用毕赤酵母催化合成是SAM主要生产方法,但SAM可被细胞转化为还原型谷胱甘肽(glutathione reduced,GSH),后者可进一步转化为氧化型谷胱甘肽(glutathione oxidized,GSSG)。该研究分析了SAM合成过程中谷胱甘肽总量的动态变化,并基于GSSG/GSH偏移,揭示了胞内氧化还原势与GSH流量变化的相关性。最后添加抗氧化剂维生素C,通过降低胞内SAM→GSH流量及改善细胞活性,进一步提高SAM产率。

重组毕赤酵母发酵生产S-腺苷甲硫氨酸培养条件优化

甲醇营养型毕赤酵母生产S-腺苷甲硫氨酸(SAM)是通过其表达的SAM合成酶催化L-甲硫氨酸(L-Met)和ATP反应而合成的。本文采用全合成培养基,在摇瓶上进行了培养条件的优化,确定了接种量、pH、PTM1、PO43-等初步条件。并根据SAM生物合成的特征,重点对其碳、氮源的影响作了进一步的分析优化。结果表明:当CaSO40.465g/L,K2SO49.10g/L,MgSO4.7H2O 7.45g/L,PO43-0.5mol/L情况下,生长阶段,甘油4%、硫酸铵4.00g/L为最佳;诱导表达阶段,L-Met1.0g/L,甘油与甲醇比例为0.5、硫酸铵8.00g/L为最佳。优化后,SAM产量诱导4d后达1.48g/L,诱导5d后可达1.70g/L(131mg/g干细胞),L-Met的转化率可达40.65%,既利于工艺放大又便于产品的分离纯化。

L-蛋氨酸及甲醇浓度对毕赤酵母摇瓶发酵生产S-腺苷蛋氨酸的影响

利用甲醇传感器及高效液相色谱检测毕赤酵母摇瓶发酵过程的甲醇浓度及S-腺苷蛋氨酸(SAM)浓度,发现L-蛋氨酸浓度及甲醇浓度对毕赤酵母细胞生长及合成S-腺苷蛋氨酸具有影响,据此对摇瓶发酵过程的L-蛋氨酸浓度及甲醇浓度进行优化。优化结果表明:当L-蛋氨酸浓度为7.5 g/L时,最适于SAM积累,产量达到0.83 g/L;进而利用甲醇传感器对发酵过程的甲醇浓度进行检测及控制,考察不同甲醇浓度对SAM产量的影响,毕赤酵母产SAM的最佳甲醇浓度为15 g/L,在此浓度下SAM的产量达到1.41 g/L,比对照实验增加了21%。