牛γ干扰素基因的克隆及在巴斯德毕赤酵母GS115中的表达

利用RT PCR扩增奶牛γ干扰素基因bovIFN γ。测序和序列分析表明,bovIFN γcDNA由501个核苷酸组成,共编码166个氨基酸,N 端的23个氨基酸为信号肽,含有2个潜在的N 糖基化位点。理论相对分子质量为19393.48,理论等电点为9.63。构建转化载体pPIC9K/bovIFN γ,并转化至巴斯德毕赤酵母GS115中,获得重组酵母菌GS115/bovIFN γ。

血管基膜衍生多功能肽基因在毕赤酵母中的表达和活性鉴定

目的:利用PCR技术从含有目的基因的质粒pGEX- 4T- 1 -VBMDMP获得带有SnabI和NotI酶切位点并融合有GST的目的基因片段并测序鉴定,将PCR产物纯化、酶切、回收,克隆到pPIC9K载体,转化入大肠杆菌DH5a扩增,用琼脂糖凝胶电泳,限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定。方法:BglⅡ线性新构建的表达载体pPIC9K- GST- VBMDMP ,然后用原生质体转化法转化毕赤酵母细胞,并用pPIC9K空质粒也转入酵母细胞进行对照。用煮 冻 煮法裂解已转化有目的基因的毕赤酵母细胞提取DNA并行PCR鉴定,获得阳性重组子,行多克隆筛选和表型鉴定。筛选His+ Muts 表型的转化子,在MGY液体培养基中30℃摇床培养,每2 4h从培养基中转移1ml培养基上清于- 70℃保存,并保持培养瓶中培养基的量和培养基中甲醇0 .5 %的浓度不变,8d后行SDS -PAGE检测表达的蛋白,用GlutathioneSepharose 4B亲和层析柱纯化获得GST- VBMDMP融合蛋白;用凝血酶切割GST- VBMDMP并分离获得VB MDMP。结果:发现VBMDMP能够抑制鼠主动脉内皮细胞管状结构的形成;同时(VBMDMP 10mg/kg ,6mg/kg ,2mg/kg)对小鼠Lewis肺癌原发瘤具有显著抑制作用(瘤重抑制率分别为96 .6 % ,82 .1% ,6 1.2 % )。VBMDMP(GST -VB- MDMP 10mg/kg ,6mg/kg ,2mg/kg)对小鼠Lewis肺癌自发性肺转移具有显著抑制作用(自发?