Cloning and Expression of pilA Gene of Outer Membrane Protein of Haemophilus parasuis

[Objective] The aim was to clone and express the pilA gene of outer membrane protein of Haemophilus parasuis.[Method] The published pilA gene sequence of HPS was analyzed for primer synthesis,and the genome of serotype 5-type of HPS was used as template for PCR amplification of the pilA gene of HPS;the recombinant expression plasmid was constructed and transformed into E.coli BL21（DE3）after induced by IPTG.SDS-PAGE and Western blot analysis were then carried out.[Result] The molecular weight of expressed protein was consistent with the expected（43 kD）.[Conclusion] The results provided a foundation for the preparation of subunit vaccine and diagnostic reagents.

鸭源致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛pilA基因的原核表达及重组蛋白对强毒攻击的免疫保护作用

根据GenBank中人源大肠杆菌pilA基因序列,用OLIGO6.0设计PCR引物,从鸭源致病性大肠杆菌GH1.2中扩增到pilA基因并将其克隆至pMD18-T载体,经PCR、酶切和DNA测序鉴定后,将鸭源致病性大肠杆菌pilA基因正向插入原核表达载体pET-32a(+)的BamHⅠ和HindⅢ位点间,成功构建了重组表达质粒pET-32a-pilA。重组表达质粒pET-32a-pilA转化表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG诱导,表达出了大小约为36kD的pilA重组蛋白。表达产物用镍柱亲和层析纯化,与等量弗氏佐剂混合制备pilA重组蛋白疫苗,分别在1日龄、8日龄时两次对雏鸭进行免疫,二免后2周测定鸭血清中的ELISA抗体效价,并以109PFU同源菌株GH1.2攻毒,根据攻毒后鸭的死亡率、E.coli分离率和各组织器官的病变等级来判定pilA重组蛋白的免疫保护效果。结果pilA重组蛋白免疫鸭的血清中ELISA抗体效价为1∶12800,全菌灭活苗免疫组的血清ELISA抗体效价为1∶200;同源菌株攻毒后,pilA重组蛋白免疫保护组鸭的死亡率、E.coli分离率和各组织器官的病变程度均比攻毒对照组下降且差异显著或极显著,与全菌灭活苗免组比较差异不显著。表明pilA重组蛋白对同源菌株GH1.2的感染具有一定的保护效果。

副猪嗜血杆菌外膜蛋白pilA基因的克隆与表达

[目的]克隆和表达副猪嗜血杆菌菌毛蛋白pilA基因。[方法]对已发表的HPS的pilA序列进行分析,合成引物,并以HPS血清5型基因组为模板,通过PCR扩增HPS的pilA编码基因,获得目的基因片段;构建重组表达质粒,经IPTG诱导表达至大肠杆菌BI21(DE3)中,进行SDS-PAGE与Western blot检测。[结果]表达的重组蛋白分子质量与预期的43 kD一致。[结论]该研究为制备亚单位疫苗和诊断试剂奠定了基础。

鸡源致病性大肠杆菌1型菌毛pilA基因的PCR扩增、克隆及序列分析

研究选择从四川规模化鸡场分离鉴定的5株优势血清型鸡源致病性大肠杆菌代表株(O89,O119,O141,O127)的1型菌毛pilA基因的PCR扩增片段分别定向克隆到pUC18质粒的多克隆位点,并转化到DH5α株大肠杆菌载体菌中,对目的基因的序列测定结果表明:5个克隆片段均含有1型菌毛pilA基因的全序列,全长459bp,编码信号肽和结构蛋白。用生物软件(DNASTAR)对9株大肠杆菌1型菌毛pilA基因序列、氨基酸序列、菌毛蛋白质二级结构预测及抗原性进行了分析比较,结果显示:鸡源致病性大肠杆菌1型菌毛间具有同源性,1型菌毛间存在一定的相同抗原位点。

鸡大肠埃希菌Ⅰ型菌毛pilA基因的克隆与序列分析

根据已公布的鸡大肠埃希菌pilA基因序列,在其保守区设计一对引物,以提取的3株鸡大肠埃希菌基因组DNA为模板,进行PCR扩增,获得3个克隆片段。经序列测定和分析表明,3株克隆片段均含有Ⅰ型菌毛pilA基因的全序列及完整的开放性阅读框架,片段大小为549bp,编码信号肽和结构蛋白;3株鸡大肠埃希菌分离菌株与其他菌株pilA基因之间核苷酸同源性为87.25%～98.36%,氨基酸同源性为87.36%～98.35%;系统进化分析表明,大肠埃希菌各菌株之间的pilA基因遗传相关性与其宿主来源及血清型之间没有显著的相关性;3株鸡大肠埃希菌I型菌毛间具有一定的结构相似性,并存在一定的共同抗原位点。

鸭源致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛pilA基因序列测定及生物信息学分析

据GenBank中人源大肠杆菌pilA基因序列，由Oligo 6．0设计一对引物，以提取的鸭源致病性大肠杆菌基因组为模板，进行PCR扩增，获得了5株鸭源致病性大肠杆菌的pilA基因，序列测定和生物信息学分析表明：鸭源致病性大肠杆菌pilA基因核苷酸序列长度为549bp，编码182aa，与人源、鸡源及猪源大肠杆菌pilA基因之间核苷酸同源性为87．3％～100．0％，氨基酸同源性为87．5％～100．0％。对不同宿主来源大肠杆菌pilA基因所编码蛋白的二级结构、亲水性、抗原性、抗原表位进行预测分析比较，结果显示Ⅰ型菌毛间具有一定的结构相似性，并存在一定的共同抗原位点；系统进化分析表明，各菌株之间的pilA基因遗传相关性与其宿主来源及血清型之间没有严格的相关性。

地高辛标记大肠杆菌1型菌毛结构基因核酸探针对鸡大肠杆菌分离株的检测

将PCR扩增的鸡大肠杆菌 1型菌毛蛋白结构基因 (pilA)用地高辛标记成核酸探针与分属 2 8个血清型的 50个鸡大肠杆菌分离株进行斑点杂交 ,阳性率达 84% ,用甘露糖敏感血凝试验 (MSHA)检测阳性率为 72 % ,表明核酸杂交比MSHA法更敏感。

禽源致病性大肠埃希菌安徽分离株I型菌毛pilA基因的序列测定与分析

目的探明大肠埃希菌I型菌毛pilA基因在不同宿主来源菌株间的同源性,为利用Ⅰ型菌毛基因诊断和防治大肠埃希菌病提供理论基础。方法以禽源致病性大肠埃希菌安徽分离株基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增Ⅰ型菌毛pilA基因,并进行序列测定与分析。结果 13株不同血清型禽源致病性大肠埃希菌安徽分离株均携带pilA基因,彼此间该基因的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别介于84.9%～99.7%和86.2%～99.2%。pilA基因核苷酸序列在安徽分离株与鸡源参考株、猪源参考株以及人源参考株之间的同源性分别为85.9%～99.7%、85.9%～93.9%和87.5%～100%,氨基酸序列同源性分别为83.1%～99.2%、88.5%～93.8%和90%～100%。系统发育进化树分析显示JD16、JD34、JD11、JD24、YD2、JD8和YD1禽源安徽分离株与人源参考株sPH2的亲缘关系较近,在进化树的同一分支上;GD3、YD5、GD2、YD3、YD5和YD7禽源安徽分离株与鸡源参考株PDI-386和猪源参考株107/86的亲缘关系较近,在进化树中属于同一分支;GD1禽源安徽分离株与鸡源参考株HY1-2和MS2-1的亲缘关系较近,在进化树中属于另一分支。结论大肠埃希菌I型菌毛pilA基因在不同宿主来源菌株及不同血清型菌株之间高度保守,可作为大肠埃希菌病的诊断基因和疫苗候选基因。