小麦硬度主效基因Pina和Pinb的克隆和序列分析

籽粒硬度是小麦品质改良的重要目标性状。根据已报道的谷类作物中硬度主效基因 Pina和 Pinb的 DNA序列 ,设计了两对简并引物 ,以我国软质小麦品种京 4 11基因组 DNA为模板 ,进行 PCR扩增 ,分别获得了约 4 5 0 bp的Pina和 Pinb基因的全长特异性片段。将其克隆到 p GEM- 3Zf(+)上 ,重组子和酶切鉴定正确后 ,进行序列测定和分析。结果表明 ,与国外已克隆的软质小麦 Heron中 Pina基因相比较 ,京 4 11中 Pina与其核苷酸同源性为 98.9% ,氨基酸的同源性为 98% ,其全长为 4 4 7bp,编码 14 9个氨基酸残基 ,具有谷类作物中 Pina所特有 19个氨基酸的信号肽序列和 WWKWWK的色氨酸结构域。同样 ,与国外已克隆的软质小麦 Heron中 Pinb基因相比较 ,京 4 11中 Pinb与其核苷酸同源性为 99.8% ,氨基酸的同源性为 99.3% ,其全长为 4 4 7bp,编码 14 9个氨基酸残基 ,具有谷类作物中 Pinb所特有 19个氨基酸的信号肽序列和 KWWK的色氨酸结构域。硬度主效基因的分离克隆为进行我国小麦品种硬度的基因工程改良奠定了基础。

Pina和Pinb融合基因表达载体的构建及其在硬粒小麦中的转化

【目的】构建Pina、Pinb融合基因表达载体,验证Pina和Pinb基因的功能,为利用转基因技术改良小麦籽粒质地提供理论依据和基础材料。【方法】以软质小麦京411作为Pina和Pinb基因的供体,将Pina、Pinb基因融合后,与基础质粒pG4AB上的Ω和poly(A)等增强基因表达的调控序列及pAHC25上的Ubiqutin启动子和bar基因表达盒相连接,构建Pina、Pinb融合基因植物高效表达载体。利用基因枪转化硬粒小麦幼胚,并对硬粒小麦幼胚再生体系进行探索。【结果】在构建完成Pina、Pinb融合基因植物高效表达载体pFUBPaPb的基础上,转化硬粒小麦幼胚16000多枚,经biolaphos筛选、PCR鉴定和斑点杂交鉴定,得到再生植株2390株,35株为阳性植株。共得到T1代籽粒356粒,对种子量较多的16个单株籽粒进行蛋白表达分析,有2株检测到基因表达产物,其籽粒SKCS硬度值比受体品种分别降低了10和12。培养基SD2适于硬粒小麦幼胚愈伤组织的诱导,MS+8mg·L-1玉米素可获得较为理想的再生频率。【结论】Pina和Pinb的共同表达降低了硬粒小麦籽粒硬度,具有软化籽粒质地的功能。

CIMMYT新型人工合成小麦Pina和Pinb基因等位变异

八倍体人工合成小麦由硬粒小麦（Triticum turgidum subsp．durum）与粗山羊草（Aegilops tauschii Coss．）杂交产生，是研究小麦进化过程中基因变异的重要材料。以国际玉米小麦改良中心（CIMMYT）提供的57份由野生二粒小麦（T．turgidum subsp．dicoccoides）与粗山羊草杂交产生的新型人工合成六倍体小麦为材料，用单籽粒特性测定仪和Pina、Pinb特异性PCR引物对其籽粒硬度变异以及控制籽粒硬度的主效基因Pina和Pinb的分布情况进行了研究。结果表明，这些材料的SKCS硬度值变异较大，从10．5到42．6，其中15-30的占78％。共有Pina-Dla、Pina-Dlc、Pinb-Dlh和Pinb-Dlj4种等位变异型，基因型为Pina-Dla／Pinb-Dlj的8个，占14％；基因型为Pina-Dlc／Pinb-Dlh的49个，占86％。方差分析表明，基因型Pina-Dla／Pinb-Dlj与Pina-Dlc／Pinb-Dlh对籽粒硬度的影响差异不显著，但父本粗山羊草和母本野牛二粒小麦以及二者间的互作对籽粒硬度有显著影响，说明除Pina和Pinb外，还有其他微效基因影响籽粒硬度的形成。

小麦Pinb基因启动子区CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建

CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术已经逐渐成熟并在多种植物中得到成功应用,促进了基因功能的研究。小麦籽粒硬度是决定小麦加工品质的重要性状,Pinb是控制籽粒硬度的关键基因之一。本研究以小麦Pinb基因为对象,联合采用常规PCR和Golden Gate cloning技术,构建了包含小麦Pinb基因启动子区双靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体。将重组载体转入小麦原生质体中进行sgRNA活性的检测,在两个靶点位置均发生了突变,编辑效率分别为4.57%和4.37%,基因编辑类型包括碱基替换和碱基缺失。该研究为在小麦中实现Pinb基因的定点突变奠定了基础,对其功能研究和小麦品质改良均具有重要意义。

二角山羊草Pinb基因的克隆与表达分析

根据已报道的小麦Pinb基因的保守序列,设计合成了1对特异性引物,对二角山羊草(Aegilops bicornis,SS)的基因组DNA进行Pinb基因扩增、克隆、序列分析,发现了1个新型Pinb等位基因,基因长360bp,编码119个氨基酸残基,对应于麦类作物PinB成熟蛋白结构区域,具有其特有的WPTKWWK色氨酸结构域和10个半胱氨酸所形成的5个二硫键结构。与软粒小麦cv.Capitole的Pinb-D1a相比较,其核苷酸和氨基酸同源性分别为93.1%和91.6%。RT-PCR证实了Pinb基因在籽粒胚乳中的表达。研究结果表明,二角山羊草中包含着与小麦差异较大的籽粒硬度控制基因,为栽培小麦品质改良提供了丰富的遗传资源。

Pina^m-Pinb^m-Gsp^m串联三基因表达载体的构建及其在普通小麦中的转化

籽粒硬度是小麦品质改良的重要目标性状之一,主要由5D短臂上的Hardness(Ha)位点的两个主效基因,即Puroindoline a(Pina-D1)和Puroindoline b(Pinb-D1)控制,同时受基因Grain Softness Protein-1(Gsp-1)的影响。本研究以一粒小麦(T.monococcum)DV92作为Pinam、Pinbm和Gspm基因的供体,将三基因各自完整的表达盒串联连接到载体pGEM-TEasy上,构建Pinam-Pinbm-Gspm三基因串联的表达载体。利用基因枪介导的转化方法转化普通小麦科农199幼胚,共轰击5608个小麦幼胚愈伤,经Biolaphos(化学除草剂)筛选,获得933株再生植株,经PCR检测,鉴定出11株阳性植株,有关转基因小麦的籽粒硬度还需进一步实验验证;本实验实现了串联三基因在普通小麦中的遗传转化,为利用基因枪介导的遗传转化方法改善小麦籽粒硬度提供了可行性。

籽粒硬度Pinb基因反义表达载体构建及遗传转化

籽粒硬度是小麦品质改良的重要目标性状。利用含有Ubi启动子、Bar表达盒的基础质粒pAHC25,构建了含有Pinb基因的植物反义表达载体pAHantipB,其中pAHantipB载有小麦籽粒硬度Pinb基因的反向序列,可用于小麦遗传转化,利用花粉管通道法将其转入软质小麦品种京411,获得1株转基因植株,T1代转基因植株抗性筛选及PCR检测结果表明,转化率为0.17%。基因组DNA斑点杂交证实了外源基因在受体小麦基因组中的整合。

粗山羊草(Aegilops tauschii)中Pinb基因的克隆和表达分析

puroindoline a(Pina)和puroindoline b(Pinb)是控制小麦籽粒硬度的主效基因。根据已报道的小麦Pinb基因的保守序列,设计合成了一对特异性引物,对粗山羊草Aegilops tauschii(DD)的基因组DNA进行Pinb基因扩增、克隆和序列分析,发现了一个新型Pinb等位基因。该基因长447 bp,编码148个氨基酸残基,具有麦类作物PinB蛋白所特有的WPTKWWK色氨酸结构域和10个半胱氨酸所形成的5个二硫键结构。与软粒小麦cv.Capitole的Pinb-D1a相比较,该基因含有14个氨基酸变异位点,其中包括一个紧邻色氨酸结构域的变异位点(Val66Phe),其核苷酸和氨基酸同源性分别为93.3%和90.5%。RT-PCR和Western Blot证实了Pinb基因在籽粒胚乳中的表达。Southern Blot分析结果表明,粗山羊草中Pinb基因为单拷贝。研究结果表明,粗山羊草中包含着与小麦差异较大的籽粒硬度控制基因,对此基因的进一步研究将加深对小麦籽粒硬度形成分子机制的了解。

Pinb基因启动子生物信息学分析及载体构建

运用生物信息学预测并分析小麦硬度基因Pinb的启动子,利用无缝克隆构建胚乳特异表达载体.采用生物信息学软件预测Pinb基因5’端上游调控区3056bp序列进行启动子预测与分析,克隆启动子,利用无缝克隆技术构建Pinb基因的胚乳特异表达的重组质粒,重组质粒经测序鉴定构建正确.Pinb基因5’上游-3060bp至-4bp区域内存在启动子活性,在-2419bp至-500bp间启动子活性分值均在0.8以上,其中-550bp至-500bp区启动子片段分值最高,达到0.99.在-2862bp处和-362bp处各有一个转录起始位点.在-544bp处有一个CAAT盒信号,在-541bp处有一个TATA盒信号.在-2362bp至-2256bp、-1704bp至-1559bp和-537bp至-361bp处各有一个CpG岛.取最有可能的757bp(-803bp至-47bp)启动子片段构建重组质粒(LBLV232),质粒经酶切和测序验证正确.最终,成功构建Pinb基因启动子报告基因表达载体,为系统研究该基因启动子活性提供前期基础.

小麦籽粒硬度蛋白PINA和PINB的电泳分离方法比较

试验以4个硬度不同的小麦品种为材料,采用单籽粒蛋白提取法分离了Puroindoline蛋白,并进一步通过改进的SDS-PAGE和A-PAGE方法对Puroindoline a(PINA)和Puroindoline b(PINB)蛋白进行分离。结果表明,A-PAGE的分离效果要远好于SDS-PAGE,不仅能更好地将两个蛋白分开,且具有省时、省力、操作简便等优点。

Pina^m、Pinb^m和Gsp-1~m基因表达载体构建及遗传转化

子粒硬度是小麦重要的品质性状之一,对小麦的磨粉及加工品质有重要影响。子粒硬度主要受位于染色体5D短臂上Hardness(Ha)的两个主效基因Puroindoline a(Pina)和Puroindoline b(Pinb)的调控及基因Grain Softness Protein-1(Gsp-1)的影响。从一粒小麦(Triticum monococcum)DV92中克隆基因Pinam、Pinbm和Gsp-1m,并构建以Bar基因为筛选标记的重组质粒PC186-Pinam、PC186-Pinbm、PC186-Gsp-1m,通过基因枪介导法将它们分别转入普通小麦科农199中。经过PCR和RT-PCR鉴定,Pinam、Pinbm和Gsp-1m基因分别获得2株转基因阳性苗,结果表明转入基因能在小麦中表达,但有关转基因小麦的子粒硬度还需进一步验证。本研究完成了单基因在普通小麦中的遗传转化。

小麦puroindoline及其相关基因分子遗传基础研究进展

籽粒硬度是重要的小麦品质性状之一,对小麦的磨粉品质和加工品质有重要影响。控制籽粒硬度的主效基因puroindoline位于5D染色体的短臂上,可分为Pina和Pinb2种类型。Pina和Pinb紧密连锁,编码区均为447个碱基,没有内含子,共同形成小麦籽粒硬度的分子遗传基础。目前,普通小麦和山羊草中均已发现多种puroindoline变异类型,其中引起小麦籽粒硬度大幅度升高的Pina-D1b类型的分子机制为从编码区第23个碱基开始缺失15380个碱基。Puroindoline除了对小麦籽粒硬度有重要影响之外,对其它品质性状也有重要影响,不同puroindoline变异类型之间小麦品质具有一定差异。另外,与puroindoline紧密连锁的Gsp-1基因变异类型更为丰富,但对籽粒硬度没有明显的调节作用。最近发现的与puroindolineb高度同源的基因Pinb-2v具有4种类型,分别位于小麦7A、7B和7D染色体上,可能对籽粒硬度具有微效的调节作用。本文通过对puroindoline的分子特征和突变类型以及相关功能进行分析和总结,旨在为中国小麦品质的基因工程改良提供参考。

山东小麦籽粒硬度演变规律研究

利用单籽粒谷物特性测试仪和PCR扩增、酶切及DNA测序技术,结合改良的friabilin提取及电泳分析方法,对山东省431份农家品种、63份历史品种和29份当前主栽品种的籽粒硬度分布以及Pina和Pinb等位变异类型进行研究,以探讨山东小麦籽粒硬度的演变规律。农家品种、历史品种和当前主栽品种中硬质麦比例分别为75.6%、12.7%和27.6%,混合麦分别占20.4%、19.0%和13.8%,而软质麦分别占3.9%、68.3%和58.6%。农家品种中共有6种基因型,Pina-D1b/Pinb-D1a和Pina-D1a/Pinb-D1p分别占硬质麦的38%和59.6%。历史品种中有4种基因型,8份硬质麦中Pina-D1b/Pinb-D1a占37.5%,Pina-D1a/Pinb-D1b占37.5%,而Pina-D1a/Pinb-D1p只占25.0%。当前主栽品种中,8份硬质麦全部是Pina-D1a/Pinb-D1b类型。长芒透垅白等3个品种的Pinb基因的核苷酸序列发生了双突变,起始密码子下游96bp处碱基C突变为A,而且在265bp处发生了A碱基的缺失,将其命名为Pinb-D1aa。

俄罗斯小麦籽粒硬度及puroindoline基因等位变异的分布

小麦籽粒硬度是重要的品质性状之一,对小麦加工品质具有重要影响。为了合理引进种质资源,培育高品质小麦品种,本研究利用小麦硬度指数测定仪JYDB100×40对引进俄罗斯小麦品种的籽粒硬度进行检测,利用STS标记和变温PCR对控制籽粒硬度基因puroindoline的主要等位变异进行分析。结果显示：208个俄罗斯引进小麦品种硬度指数范围为45.6~79.2,硬质麦品种为190个（91.35%）,混合麦品种为18个（8.65%）。Pina基因有Pina-D1a、Pina-D1b和杂合Pina-D1a/Pina-D1b共3种类型,所占比例分别为87.02%、10.10%和2.88%。Pinb基因有Pinb-D1a、Pina-D1b、Pinb-D1c和双位点突变Pinb-D1bc 4种类型,所占比例分别为37.02%、55.77%、3.85%和3.37%。统计结果显示：携带PinaD1b＋Pinb-D1a基因小麦籽粒硬度指数显著大于Pina-D1a＋Pinb-D1b,Pina-D1a＋Pinb-D1a和PinaD1a＋Pinb-D1bc。其他puroindoline等位变异之间没有显著差异。俄罗斯硬质麦种质资源丰富,是改善我国小麦籽粒硬度和品质的重要遗传材料。

我国南部麦区小麦硬度基因多态性初步分析

籽粒硬度是小麦重要的加工品质性状,直接影响磨粉品质和食品加工品质。决定籽粒硬度的蛋白是分子量为15kD的Friabilin蛋白,由多种成分组成,其主要成分是两种富含色氨酸(Trp)的蛋白质Puroindoline a和Puroindoline b(Pi-na和Pinb),分别由位于5DS染色体Hardness(Ha)位点的基因Pina和Pinb编码。本研究选取了我国长江流域和黄淮麦区南部、西南麦区和南方冬麦区104份小麦品种,分别用Pina和Pinb特异的引物通过PCR分子检测基因的有无和长度的多态性。结果表明,在检测的104种小麦中,有6个品种无Pina目标条带,7个品种无Pinb条带,12个品种既无Pi-na也无Pinb,属于双缺失类型。本实验条件下,无论Pina还是Pinb,PCR产物长度均无明显变化。推测,大多数硬质小麦均是由Pina或Pinb基因的单核苷酸变化、较小的插入或缺失突变引起的。本研究为进一步筛查Pina和Pinb基因突变奠定了基础。

小麦籽粒硬度及其分子遗传基础研究回顾与展望

籽粒硬度是最重要的小麦品质性状之一,是市场分级和定价的重要依据。随着硬度测试方法的日趋完善,其分子遗传基础的研究逐步加快。硬度主要受位于5D染色体短臂上一个主效基因和多个微效基因控制,Pina和Pinb是形成小麦籽粒硬度的基础。PINA蛋白的缺失或编码PINB蛋白的基因突变均造成小麦胚乳质地变硬。中国目前该项研究较少,与国外相比仍有很大差距,本文着重阐述了小麦胚乳结构及硬度的生化和遗传基础,旨在为我国小麦籽粒硬度的研究提供理论依据。

陕西历代小麦品种籽粒硬度演变规律研究

利用单籽粒谷物特性测试仪和PCR扩增方法对170余份陕西省历代和当代主要小麦品种(系)的籽粒硬度及基因Pina和Pinb等位变异进行了研究,以揭示陕西省小麦品种换代过程中籽粒硬度的演变规律。其中,历代品种(系)材料51份,硬质麦占39.22%,混合麦占60.78%;Pina-D1b等位基因类型为9.80%,Pinb-D1b等位变异类型为47.06%;当代小麦品种(系)119份,硬质麦占38.66%,混合麦占61.34%;Pina-D1b等位变异类型为17.65%,Pinb-D1b等位变异类型为39.50%;Pina基因所占比例为14.29%,Pinb基因所占比例为63.03%;陕西省历代小麦品种硬度平均数呈先降后升趋势,总体呈现逐渐上升。