傅里叶红外光谱法鉴别部分胡椒属生药的研究

利用共有峰率和变异峰率双指标,以胡椒属七种药用植物的红外指纹图谱为依据,计算出所测样品的共有峰率和变异峰率。建立了胡椒属七种药用植物共有峰率和变异峰率双指标序列,结果揭示了胡椒属七种药用植物的亲缘关系。中药海风藤与石南藤、大叶蒟根茎的共有峰率均在77%以上,变异峰率均在30%以下,此三种胡椒属药用植物亲缘关系较近;海风藤与胡椒根茎、十八症根的共有峰率在61%左右,亲缘关系稍远;海风藤与蒌叶根茎的共有峰率仅为44%。亲缘关系较远。利用红外二阶导数谱图,可以鉴别中药海风藤及其伪品石南藤、十八症根、大叶蒟根茎、胡椒根茎等品种。傅里叶红外光谱法可以对样品进行无损处理,不需要对药材进行复杂的提取分离过程即可提供化合物的官能团、类别、氢键等信息。该法能从整体水平分析谱图特征峰,具有分析速度快,重现性好,非破坏性和样品量小,制样简单,专属性强,节约成本,保护环境等优点。可以解决中药海风藤因资源短缺,伪品较多,鉴别困难等问题,也可为临床用药的安全、有效提供保障。傅里叶红外光谱法为胡椒属药用植物亲缘关系的探讨和真伪鉴别提供了一种新方法。符合中药向综合分析和整体分析发展的趋势。

海风藤对局灶性脑缺血治疗作用的实验研究

目的 :探讨海风藤提取物对老龄大鼠局灶性脑缺血的治疗作用。方法 :建立光化学诱导的老龄大鼠局灶性脑缺血模型 ,利用TTC染色、HE染色、TUNEL标记、原位分子杂交观察海风藤提取物对缺血灶大小、血脑屏障、缺血灶周围坏死细胞、凋亡细胞及P5 3基因表达变化的影响。结果 :海风藤治疗组大鼠局灶性脑缺血后血脑屏障破坏明显减轻 ,缺血灶周围坏死细胞、凋亡细胞及P5 3阳性细胞的数量较未干预组显著减少 ,梗死灶直径也有减少的趋势。结论 :海风藤具有抵抗缺血后神经细胞DNA损伤 ,减轻迟发性神经元死亡及神经细胞坏死 ,对缺血性脑组织有保护作用。

海风藤提取物对老龄大鼠缺血性脑损伤保护作用研究

目的 探讨海风藤提取物在老龄大鼠局灶脑缺血后可能的脑保护作用。方法 建立光化学诱导的老龄大鼠局灶性脑缺血模型 ,利用 TTC染色、HE染色、原位末端标记观察海风藤提取物对缺血灶大小、血脑屏障、缺血灶周围坏死细胞、凋亡细胞的影响。结果 海风藤提取物可显著减轻局灶性脑缺血后血脑屏障的破坏 ,减少缺血灶周围坏死细胞、凋亡细胞数量 ,并具有减少梗死灶直径的趋势。结论 海风藤具有抵御缺血后血脑屏障破坏 ,减少缺血灶周围神经细胞坏死及迟发性神经元死亡 ,发挥缺血性脑保护作用。

海风藤提取物对脑缺血再灌注模型大鼠神经细胞凋亡和线粒体膜电位变化的干预作用

目的观察脑缺血再灌注2h后大鼠神经细胞凋亡和线粒体膜电位的变化及海风藤提取物的干预作用。方法应用线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞再灌注模型,流式细胞术分别观察假手术组、模型组、二甲基亚砜组和海风藤组缺血灶周神经细胞凋亡和线粒体膜电位的变化。结果与模型组神经细胞凋亡率(72.7%±6.5%)和线粒体膜电位(0.117±0.011)比较,海风藤组神经细胞凋亡率(47.0%±3.8%)明显下降(P<0.01),线粒体膜电位(0.182±0.023)明显升高(P<0.01);而假手术组神经细胞凋亡率(5.8%±1.8%)和线粒体膜电位(0.331±0.016)与模型组比较差异均有显著性(P<0.01)。结论海风藤可以减轻脑缺血再灌注后早期神经细胞凋亡,并对线粒体膜电位有稳定作用,可以保护缺血脑组织。

单细胞凝胶电泳技术检测大鼠脑缺血再灌注后DNA损伤及海风藤提取物的干预作用

目的用单细胞凝胶电泳技术(SCGE)检测局灶性脑缺血再灌注(I/R)大鼠神经细胞DNA损伤及海风藤干预作用。方法应用线栓法建立Wistar大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)再灌注模型,单细胞凝胶实验技术分别观察假手术组、模型组、二甲基亚砜(DMSO)组、海风藤提取物治疗组缺血灶周神经细胞DNA损伤的变化。结果与假手术组比较,模型组和DMSO组DNA损伤率6～72h明显增加,但海风藤组DNA损伤率与其他组比较24、72h有明显下降(P<0.01,P<0.05)。结论海风藤可以减轻I/R后神经细胞DNA损伤,对缺血脑组织有保护作用。

HPLC测定海风藤药材中海风藤酮的含量

建立了HPLC法测定海风藤药材中海风藤酮含量的方法,采用Hypersil ODS2柱（4.6×250mm,5μm）,甲醇-水（70∶30）为流动相,流速为1.0mL/min;检测波长280nm;海风藤酮在116~1160μg/mL范围内线性关系良好,回归方程为Y=4561.1X-10927（r=0.9994）,平均回收率为99.83%,RSD=1.08%（n=6）。用本方法测得海风藤酮在风藤、石南藤和山蒟中的含量分别为0.25%,0.0057%和0.0014%。

扦插季节、基质与外源激素处理对细叶青蒌藤扦插繁殖的影响

[目的]研究扦插季节、基质与外源激素处理对细叶青蒌藤扦插繁殖的影响。[方法]在福建沙县进行细叶青蒌藤扦插试验,分析不同扦插季节、基质与外源激素剂处理对细叶青蒌藤扦插繁殖的影响。[结果]扦插季节、基质与外源激素处理对细叶青蒌藤扦插生根率、成苗率及新梢长度均有极显著差异性影响(P<0.01);提高穗条生根率的优劣顺序为春季>秋季、冬季>夏季,秋季与冬季间无显著性差异(P>0.05);提高穗条成苗率的优劣顺序为春季>秋季>冬季>夏季;促进穗条新梢生长的优劣顺序为秋季>春季>夏季>冬季;提高穗条生根率、成苗率与促进新梢生长的基质优劣顺序为80%泥炭土+20%珍珠岩>黄心土>河沙;提高穗条生根率、成苗率与促进新梢生长的优劣顺序为50 mg/kg ABT2号生根粉>空白对照(清水)>200 mg/kg ABT2号生根粉。[结论]建议生产中选用80%泥炭土+20%珍珠岩混合基质,选用50 mg/kg ABT2号生根粉进行穗条处理,不宜在5~7月的夏季进行扦插繁殖。

穗条年龄、粗度与插穗切口处理对细叶青蒌藤扦插繁殖的影响

[目的]探索穗条年龄、粗度与插穗切口处理对细叶青蒌藤扦插繁殖的影响。[方法]在福建沙县进行细叶青蒌藤扦插试验，研究穗条年龄、粗度与插穗切口处理对细叶青蒌藤扦插繁殖的影响。[结果]穗条年龄、粗度与切口位置与方法对细叶青蒌藤扦插繁殖的成苗率及新梢长度均有着极显著性差异性影响（P〈0．01）。1～2年的穗条的成苗率与梢长显著优于3～4年穗条的扦插繁殖效果（P〈0．05）；3～4年穗条的成苗率与梢长显著优于5年以上穗条的扦插繁殖效果（P〈0．05）。大于0．20cm粗度穗条扦插繁殖的成苗率与新梢长度显著优于小于0．20cm粗度穗条（P〈0．05）。节下1．5～2．5cm的插穗切口位置效果优于2．5～3．5cm的，单削斜口处理效果优于平剪处理。切口位置因素效应均大于切口处理因素，双因素的交互作用不显著（P〉0．05）。[结论]该试验进行了细叶青蒌藤扦插繁殖的穗条年龄、粗度、切口处理方面的研究，发现在节下1．5～2．5cm进行单削斜口的穗条处理结合效果最好。

海风藤提取物对Aβ_(1-42)寡聚体诱导阿尔茨海默氏病模型鼠认知功能障碍干预的可能机制

目的:探讨海风藤提取物(kadsura ohwi extract,PKO)对Aβ_(1-42)寡聚体(AβO)诱导阿尔茨海默氏病(Alzheimer disease)模型大鼠认知功能障碍干预的可能机制。方法:健康雄性SD大鼠36只,随机数字表法分为6组:正常对照组(Control组)、假手术组(Sham组)、载体组(高密度脂蛋白和轻乙基哌嗪乙磺酸组)、AβO组、AβO+海风藤组(AβO+PKO组)、AβO+DMSO组。采用微渗泵向侧脑室持续灌注AβO法制作动物模型。应用水迷宫实验观察大鼠的学习记忆功能变化,电镜下观察海马CA1区神经细胞超微结构,免疫印迹法(Western blot)检测NF-κB,TLR4表达,酶标记免疫吸附法(ELISA)检测TNF-α的表达。结果:水迷宫实验结果显示,与Control组、Sham组和载体组比较,AβO组、AβO+DMSO组和AβO+PKO组逃避潜伏期显著延长、穿越平台的次数显著减少、时间比率和路程比率也显著减低(P均<0.05);与AβO组、AβO+DMSO组比较,AβO+PKO组逃避潜伏期显著缩短、穿越平台的次数显著增加、时间比率和路程比率也显著增高(P均<0.05)。电镜下Control组、Sham组、载体组海马CA1区神经细胞超微结构未见明显异常,AβO组和AβO+DMSO组均见到大量凋亡神经细胞,存活的神经细胞线粒体、内质网、终池结构呈现不同程度的损伤。AβO+PKO组可见少量凋亡神经细胞,细胞肿胀轻,细胞器较完整,存活的神经元细胞较多。WB、ELISA结果显示,AβO组、AβO+DMSO组与Control组、Sham组、载体组相比,TLR4、NF-κB、TNF-α表达均显著增多,A0O+PKO组TLR4、NF-κB、TNF-α表达较AβO组、AβO+DMSO组减少(P均<0.05)。偏相关分析显示,TLR4、NF-κB、TNF-α与穿越平台次数均呈负相关(P均=0.00),TLR4、NF-κB、TNF-α之间均为正相关(P均=0.00)。结论:PKO通过降低朋0诱导的TLR4、NF-κB、TNF-α表达,减轻细胞损伤的机制,改善AD模型鼠认知功能。

海风藤化学成分及神经保护活性研究

目的对海风藤Piperis kadsurae藤茎的化学成分进行研究,并对分离的化合物进行初步的神经保护活性筛选。方法运用硅胶、ODS、和Sephadex LH-20等柱色谱以及反相制备型HPLC等各种现代色谱分离技术进行系统的分离纯化,利用波谱学方法确定化合物结构。同时采用MTT和RTCA法,以白藜芦醇作为阳性对照,对化合物进行体外神经保护活性实验。结果从海风藤藤茎的二氯甲烷和醋酸乙酯提取物中分离得到22个化合物,分别鉴定为puberulin(1)、(-)-acuminatin(2)、dihydrocarinatin(3)、海风藤酮(4)、山蒟素C(5)、3-羟基苯甲酸苄酯(6)、2-羟基苯甲酸苄酯(7)、cherrevenol D(8)、trans-2,3-diacetoxy-1-[(benzoy1oxy)methyl]-cyclohexa-4,6-diene(9)、(3R,4R)-4-O-acetyl-5-(benzoyloxymethyl)cyclohexa-1,5-diene-3,4-diol(10)、(-)-sootepoxidechlorohydrinA(11)、香草醛(12)、细辛醛(13)、β-细辛醚(14)、α-细辛醚(15)、胡椒内酰胺D(16)、焦谷氨酸甲酯(17)、三羟基异黄酮(18)、去氢木香内酯(19)、木香内酯(20)、spathulenol(21)、β-谷甾醇(22)。化合物2、4、19、21对体外神经保护的半数效应浓度(median effective concentration,EC_(50))分别为11.1、27.3、32.9、29.3μmol/L。结论化合物3、6~8、19~20为首次从胡椒属植物中分离得到,化合物15、21为首次从海风藤中分离得到。其中化合物4的^(13)C-NMR波谱数据为首次报道。化合物2、4、19、21对Aβ_(25-35)诱导PC-12细胞损伤具有显著保护作用。

海风藤提取物对AD模型大鼠学习记忆的影响

目的 研究寡聚体Aβ1-42与纤丝状Aβ1-42对大鼠行为学不同程度的影响及应用海风藤干预后AD模型大鼠行为学是否发生变化.方法 采用微渗泵向侧脑室持续灌注寡聚体Aβ1-42或纤丝状Aβ1-42法制作动物模型.术后寡聚体Aβ1-42＋海风藤组和纤丝状Aβ1-42＋海风藤组大鼠每天腹腔注射10％海风藤提取物,寡聚体Aβ1-42＋二甲基亚枫（dimethyl sulfoxide,DMSO）组和纤丝状Aβ1-42＋DMSO组大鼠每天腹腔注射2.5％ DMSO,共5周.应用水迷宫实验观察大鼠的学习记忆功能变化.结果 （1）水迷宫实验结果显示,寡聚体Aβ1-42组的平均潜伏期为（89.40±7.20）s,长于纤丝状Aβ1-42组（65.00±10.89）s;纤丝状Aβ1-42＋海风藤组潜伏期为（34.00±11.26）s,短于纤丝状Aβ1.＋DMSO组（60.6 ＋6.95）s和纤丝状Aβ1-42组；寡聚体Aβ1-42＋海风藤组的潜伏期（65.33±8.89）s,短于寡聚体Aβ1-42组和寡聚体Aβ1-42＋DMSO组（85.60±6.02）s;寡聚体Aβ1-42组大鼠经过平台位置的次数（3.00±0.71）、在靶象限的时间比率（0.23±0.02）和路程比率（0.23 ±0.04）少于纤丝状Aβ1-42组（0.25±0.01,0.26±0.03,6.00±1.58）;纤丝状Aβ1-42＋海风藤组的此三项指标多于纤丝状Aβ1-42＋DMSO组和纤丝状Aβ1-42组；寡聚体Aβ1-42＋海风藤组的此三项指标多于寡聚体Aβ1-42组和寡聚体Aβ1-42＋DMSO组.以上对比具有统计学意义（P＜0.05）.结论 寡聚体Aβ1-42对大鼠行为学的影响较纤丝状Aβ1-42对大鼠行为学的影响大；海风藤干预能部分改善Aβ1-42组大鼠的学习记忆能力.

海风藤提取物对激活的小胶质细胞IL-1β和TNF-α表达的影响

目的研究海风藤提取物对不同聚集状态的β淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)诱导小胶质细胞中炎性因子白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达的影响。方法体外培养小鼠小胶质细胞株BV2,制备寡聚体和纤丝状Aβ1-42,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度的海风藤提取物对BV2细胞活力的影响;BV2细胞分为4个实验组,分别采用寡聚体Aβ1-42、寡聚体Aβ1-42+海风藤提取物、纤丝状Aβ1-42、纤丝状Aβ1-42+海风藤提取物干预48 h,并设空白对照组,应用实时荧光定量PCR测定各组IL-1β和TNF-α的表达水平。结果海风藤提取物在10～80 g/L范围内对细胞活性无影响;实时荧光定量结果显示,4个实验组的小胶质细胞表达IL-1β和TNF-α的水平均高于空白对照组。寡聚体Aβ1-42+海风藤提取物组IL-1β和TNF-α的表达水平低于寡聚体Aβ1-42组,纤丝状Aβ1-42+海风藤提取物组IL-1β和TNF-α的表达水平低于纤丝状Aβ1-42组。结论炎性指标IL-1β和TNF-α的表达增高证明寡聚体和纤丝状Aβ1-42均能激活小胶质细胞;IL-1β和TNF-α的表达降低,表明海风藤提取物可以抑制寡聚体和纤丝状Aβ1-42对小胶质细胞的激活。

海风藤对活化的新生大鼠小胶质细胞的影响作用

目的研究海风藤提取物对纤丝状和寡聚体p淀粉样蛋白（B—amyloid，Ap）诱导的活化新生大鼠小胶质细胞可能的影响。方法原代培养新生大鼠小胶质细胞，分别用纤丝状A[325—35、寡聚体A^25-35、纤丝状A[325-35＋海风藤提取物、寡聚体A[325-35＋海风藤提取物干预小胶质细胞，并设立空白对照组。干预48h后，以CD68作为小胶质细胞活化的特异性抗原标志，利用免疫细胞化学染色方法，对小胶质细胞的活化率进行检测，并比较不同处理组间的差异。结果四个实验组的小胶质细胞CD68表达阳性率均高于空白对照组（5．1％，P〈0．05）。纤丝状AB＋海风藤提取物组CD68表达阳性率（52．1％）低于纤丝状AB组（60．8％，P〈0．05）。寡聚体A[3组（71．2％）和寡聚体A[3＋海风藤提取物组（67．0％）的CD68表达阳性率无明显差异（P=0．101）。结论纤丝状和寡聚体AB均能激活小胶质细胞；海风藤提取物能够抑制纤丝状Ap对小胶质细胞的激活作用，对寡聚体Ap的激活作用无明显影响。

海风藤提取物对Aβ寡聚体激活的小胶质细胞释放炎性因子的抑制作用

目的探讨Aβ寡聚体(Aβo)激活小胶质细胞释放相关炎性因子的作用及海风藤提取物对该过程的影响。方法取Wistar乳鼠的大脑皮层,进行小胶质细胞原代培养、分离、纯化并鉴定;采用醇提取法制备海风藤提取物,将提取物与DMSO按4∶1混合后加生理盐水并用0.22μm微孔滤膜过滤;将纯化后的小胶质细胞按相同密度种植于48孔板,分为空白对照组、Aβo组、Aβo+海风藤提取物组和Aβo+DMSO组;采用酶联免疫吸附法(ELISA)分别测定培养基上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β1(TGF-β1)的浓度。结果与空白组对照相比,经Aβo处理的小胶质细胞产生的炎性因子明显增加;Aβo+海风藤提取物组的炎性因子浓度低于Aβo组(P<0.05)。结论 Aβo能激活小胶质细胞并导致其释放大量炎性因子,而海风藤醇提取物能抑制该过程中炎性因子的释放。