IL-10在Plasmodium yoelii 17XL和Plasmodium chabaudi AS疟原虫混合感染宿主病理损伤中的作用研究

为探讨IL-10在致死型约氏疟原虫(Plasmodium yoelii 17XL,P.y17XL)和夏氏疟原虫(Plasmodiumchabaudi AS,P.cAS)混合感染宿主病理损伤中的作用,用P.y17XL、P.cAS和P.y17XL+P.cAS分别感染DBA/2小鼠,计数红细胞感染率;感染后第3、5、8、10、12和19天分别尾静脉取血,肝素抗凝后短暂离心,采用高纯度DNA提取试剂盒抽提DNA,实时定量PCR检测虫负荷水平;感染后第0、1、3、5、8、10、12和15天制备脾细胞悬液,ELISA检测脾细胞培养上清中IL-10水平。实验结果发现,P.y17XL单独感染和混合感染小鼠IL-10水平在感染后第5天和第8天分别达峰值,随后开始下降至正常水平,小鼠虫血症均达中等水平,存活率100%;相比P.cAS感染小鼠IL-10在感染后第3天突然出现高水平升高并且维持时间较长;于感染后第8天达峰值,是同天P.y17XL单独感染和混合感染小鼠IL-10水平的2倍,虫血症水平较高,小鼠全部死亡。同时实时定量PCR结果发现,混合感染小鼠,于感染后3～12 d P.y17XL增殖占优势,而感染后15～19 d则P.cAS增殖处于优势状态。表明以IL-10为核心的免疫调节网络与疟疾感染过程中病理损伤密切相关。同时提示混合感染小鼠应答模式与P.y17XL感染小鼠的应答模式相同。

BALB/c小鼠感染不同疟原虫CD4^+ Th应答和凋亡特点的比较研究

探讨不同疟原虫感染BALB/c小鼠的免疫应答特点。BALB/c小鼠经腹腔注射致死型约氏疟原虫(P.y17XL)和夏氏疟原虫(P.cAS)感染的红细胞,计数红细胞感染率;ELISA动态检测感染小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4水平;流式细胞术检测脾中CD4+T细胞凋亡数量。约氏疟原虫(P.y17XL)感染早期,小鼠原虫血症持续上升;IFN-γ和IL-4分泌水平仅在感染后第3天出现一过性有意义的升高,而且峰值较低;脾中CD4+T细胞大量凋亡,小鼠全部死亡;而夏氏疟原虫(P.cAS)感染小鼠,原虫血症上升缓慢;IFN-γ分泌水平在感染后第5天达峰值;IL-4分泌水平在感染后第10天达峰值,且峰值较高维持时间较长;脾中CD4+T细胞凋亡细胞于感染后8 d出现有意义升高,小鼠全部存活。抗疟保护性免疫有赖于Th1和Th2型免疫应答的有效建立和协调过渡,感染期间CD4+T细胞凋亡的时相和数量可能是影响免疫应答的强度或引起宿主免疫抑制的原因,从而影响宿主疟原虫感染的结局。

夏氏疟原虫感染早期易感和抵抗小鼠树突状细胞亚群和表型的变化特点

目的探讨夏氏疟原虫（Plasmodium chabaudi chabaudi AS）感染早期,树突状细胞（Dendritic cells,DCs）亚群和表型的变化特点。方法感染易感的DBA/2和抵抗的BALB/c小鼠,制备感染前和感染后第3、5、8d小鼠脾细胞悬液,采用流式细胞分析技术检测2种小鼠脾细胞悬液中髓样DCs和浆样DCs的数量以及表面表达MHC Ⅱ类分子和CD80分子的DCs的百分含量。结果 DBA/2小鼠和BALB/c小鼠分别呈现以髓样DCs和浆样DCs为主的增殖模式。2种小鼠表达MHCⅡ类分子和CD80分子的DCs数量在感染后3~5d明显升高,并于感染后第8d达到最高水平,然而感染后第8d,BALB/c小鼠表达MHCⅡ类分子和CD80分子的DCs的数量明显低于DBA/2小鼠。结论感染早期,DBA/2和BALB/c小鼠在DCs亚群的增殖模式、成熟表型特征性分子的表达水平上存在显著差异。

致死型夏氏疟原虫感染BALB/c小鼠CD4^+ CD25^+ Foxp3^+调节性T细胞在Th2免疫应答极化中的作用研究

为探讨CD4+ CD25+ Foxp3+调节性T细胞(Treg细胞)在疟疾感染过程中对Th2极化的调控作用,利用Treg细胞消除的致死型夏氏疟原虫(Plasmodium chabaudi chabaudi AS,P.c chabaudi AS)感染鼠疟模型进行研究。结果显示,对照组小鼠在感染后8 d原虫血症达到峰值40.5%,随后迅速下降,于感染后18 d小鼠自愈。相比,Treg细胞消除组于感染后10 d,原虫血症水平迅速上升至32%,随后小鼠相继死亡。在感染后8～10 d,Treg细胞消除小鼠脾脏CD4+ CD25+ Foxp3+细胞占CD4+细胞百分比含量明显低于对照组。同时,血清疟原虫特异性抗体IgG1和IgG2a水平均明显降低。结果提示,P.c chabaudi AS感染中CD4+ CD25+ Foxp3+细胞参与调控Th2型免疫应答的极化,进而干预疟原虫清除。

旋毛形线虫预感染对夏氏疟原虫感染BALB/c小鼠Th细胞变化的影响

为研究预感染旋毛形线虫后BALB/c小鼠抵御夏氏疟原虫攻击感染的能力,实验组(TPC)分别在小鼠感染旋毛形线虫1 w(TPC1)和3 w(TPC3)后感染夏氏疟原虫,对照组(PC)单独感染夏氏疟原虫,观察小鼠原虫血症及体重的变化,并采用Real-Time RCR扩增法分析转录因子T-bet和Gata-3表达水平的消长。与PC组相比,TPC1组原虫血症峰值降低,T-bet表达水平升高,Gata-3表达水平降低;TPC3组原虫血症出现时间推迟,峰值升高,T-bet表达水平降低,Gata-3表达水平升高;TPC组体重均下降,TPC组与PC组均于感染后25 d左右自愈。旋毛虫预感染使小鼠对疟原虫的抗感染能力增强,但混合感染并不影响宿主最终清除疟原虫的能力。

夏氏疟原虫感染过程中调节性B细胞的表达变化

调节性B细胞(regulatory B cells,Bregs)是近年来发现的通过分泌IL-10发挥免疫调节作用的B细胞,其在疟疾免疫应答中的作用尚不清楚。利用血液阶段夏氏疟原虫(Plasmodium chabaudi AS,P.c AS)感染的BALB/c小鼠,观察了感染过程中Bregs数量变化及其表面分子表达情况。结果显示,BALB/c小鼠感染P.c AS后红细胞感染率逐渐升高,于感染后第9天达到30%,多数小鼠死亡。脾组织细胞因子IL-10 mRNA水平在感染后显著升高,感染后第5天达到高峰,感染后第8天仍为正常小鼠的10倍左右。CD4+细胞中IL-10+细胞百分比和绝对数量在感染后第5天达到峰值,于感染后第8天回落至正常水平;而CD19+细胞中IL-10+细胞(Bregs)百分比在感染后持续上升,在感染后第8天达到CD19+细胞的5%左右;感染后第5天,脾中CD4+IL-10+细胞绝对数量高于CD19+IL-10+细胞,至感染后第8天,CD19+IL-10+细胞绝对数量显著高于CD4+IL-10+细胞(P﹤0.01),约90%Bregs为CD5-细胞。结果提示,P.c AS感染过程中Bregs显著活化,是感染1周后IL-10的主要产生细胞。

CD4^+CD25^+T细胞在夏氏疟原虫感染鼠中的应答差异

为探讨CD4+CD25+调节性T细胞(Treg细胞)在夏氏疟原虫感染过程中的活化特点及其与疾病进展的相关性,用夏氏疟原虫分别感染BALB/c和DBA/2小鼠,Giemsa染色制备薄血膜,镜检计数红细胞感染率;以流式细胞术检测脾细胞悬液中Treg细胞百分含量;ELISA测定脾细胞培养上清IFN-γ水平。BALB/c小鼠原虫血症于感染后第8d达到峰值34.4%后迅速下降,于感染后第15d左右小鼠自愈;其IFN-γ水平和Treg细胞百分含量均在感染后第5d明显增加后开始下降(P<0.01);DBA/2小鼠原虫血症于感染后第9～11d一直维持在峰值38%左右,并在感染后约第10d小鼠死亡;其IFN-γ水平在感染后第3d明显升高后迅速回落(P<0.01),Treg细胞百分含量在感染后的前8d平稳升高,但于感染后第8～11d出现骤然上升。结果提示,CD4+CD25+调节性T细胞数量异常变化与宿主感染结局呈密切相关性。

夏氏疟原虫感染的红细胞膜表面抗原Pc90的cDNA特征 I．cDNA文库的构建及阳性克隆的筛选

目的：构建夏氏疟原虫早期滋养体的ｃＤＮＡ文库，并从中筛选出表达Ｐｃ９０的阳性克隆。方法：采用ＧＴＣ／ＣｓＣｌ法提取ＲＮＡ，ｃＤＮＡ克隆入λ－ＺＡＰ噬菌体，用抗Ｐｃ－ＨＣＰＭ血清３次筛选并经抗Ｐｃ９０单克隆抗体复筛，阳性克隆经体内剪接后行限制性内切酶酶切分析。结果：该ｃＤＮＡ文库有１．９×１０６个重组体。用抗Ｐｃ９０－ＨＣＰＭ的多克隆抗体筛选后，得到１６个阳性克隆，其长度分别为：０．６ｋｂｐ，１．４ｋｂｐ，１．６ｋｂｐ，２．２ｋｂｐ以及２．５ｋｂｐ。其中仅２．２ｋｂｐ和２．５ｋｂｐ克隆与抗Ｐｃ９０单克隆抗体反应呈阳性。限制性内切酶酶切分析表明，２．２ｋｂｐ，２．５ｋｂｐ和１．６ｋｂｐ的克隆具有不同的特征。结论：２．２ｋｂｐ和２．５ｋｂｐ的克隆极有可能表达Ｐｃ９０蛋白。

夏氏疟原虫感染早期易感和抵抗小鼠树突状细胞细胞因子的分泌特点

目的探讨在夏氏疟原虫(Plasmodiumchabaudi chabaudi AS,P.c.chabaudi AS)感染早期,树突状细胞(Den-dritic cells,DCs)调控Th1细胞免疫应答的相关机制。方法用P.c.chabaudi AS感染易感型DBA/2和抵抗型BALB/c小鼠,计数红细胞感染率;感染前和感染后3、5、8d制备脾细胞悬液,磁珠分选、纯化DCs并体外培养;ELISA方法检测DCs培养上清中IL-12p40、IL-10和TGF-β1的水平。结果 DBA/2小鼠DCs培养上清中IL-12p40的水平在感染后3-8天明显升高,BALB/c小鼠DCs培养上清中IL-12p40的水平在感染后5-8d出现有意义的升高,但其水平均明显低于DBA/2小鼠;两种小鼠DCs培养上清中IL-10与TGF-β1的分泌水平在感染后5-8d明显升高,但DBA/2小鼠DCs培养上清中IL-10与TGF-β1的分泌水平明显低于BALB/c小鼠。结论 P.c.chabaudi AS感染早期,DBA/2和BALB/c小鼠在DCs细胞因子的分泌模式上存在显著差异。

夏氏、伯氏鼠疟原虫实验感染状况比较

用夏氏、伯氏疟原虫血传感染小鼠，采尾血制薄血片，姬氏染色，计１万个红细胞内疟原虫感染数。结果不同虫种同等数量或同虫种不同数量原虫其红细胞感染率不同，均有高度显著性差异。昆明鼠对夏氏疟原虫不敏感；对伯氏疟原虫敏感度高，易接种成功。血传伯氏疟原虫以１０５红细胞感染数为宜，其红细胞感染率高，原虫密度上升速度较快，动物不易死亡。

夏氏疟原虫感染的红细胞膜表面抗原Pc90的cDNA特征 Ⅱ．免疫阳性克隆Pc90-1的DNA序列分析及其在大肠杆菌中的表达

目的：对表达Ｐｃ９０的ｃＤＮＡ克隆进行鉴定和分析并在大肠杆菌中予以表达。方法：将２．５ｋｂｐ的克隆（Ｐｃ９０－１）分别双向经外源性核酸酶Ⅲ删除，以制备亚克隆，末端终止法测序，并在大肠杆菌中表达。结果：经ＤＮＡ序列分析，这个克隆全长２５８１ｂｐ，翻译大约６１ｋＤａ的蛋白（５３２个氨基酸），开放阅读框到１５９６ｂｐ，随后是２个连续的终止码。值得注意的是３－末端的非翻译区相对较长。Ｐｃ９０－１在第１００到３５５个氨基酸之间有一个明显的重复区。将Ｐｃ９０－１的各亚克隆在大肠杆菌中表达，仅得到一约３５ｋＤａ的融合蛋白。Ｐｃ９０－１的ＤＮＡ序列与其它已知序列无同源性。Ｐｃ９０－１的酸性等电点及潜在的磷酸根结合位点均与前人报道的Ｐｃ９０的特征相符。结论：Ｐｃ９０－１可能表达Ｐｃ９０蛋白。

约氏疟原虫和夏氏疟原虫混合感染宿主免疫应答特点与病理损伤的相关性研究

目的探讨致死型约氏疟原虫(Plasmodium yoelii 17XL,Py17XL)和夏氏疟原虫(Plasmodium chabaudi AS,PcAS)混合感染宿主免疫应答特点与病理损伤的相关性。方法分别用Py17XL、Pc AS和Py17XL+PcAS感染BALB/c小鼠,计数红细胞感染率;于感染后0、1、3、5、8、10、12和15d处死小鼠,取脾,制备脾细胞悬液,培养后采用ELISA检测脾细胞上清中IFN-γ和IL-4水平;分别于感染后3、5、8d尾静脉取血,肝素抗凝,短暂离心后采用高纯度DNA提取试剂盒抽提DNA,实时荧光定量PCR检测虫负荷。结果 Py17XL单独感染和Py17XL与PcAS混合感染小鼠IFN-γ水平分别在感染后第3d和5d升高,PcAS单独感染第5d小鼠IFN-γ水平是相同时间点Py17XL和混合感染小鼠的3倍;Py17XL单独感染和混合感染小鼠IL-4水平分别在感染后第3d和8d升高,PcAS感染小鼠于感染后第10d达峰值(P<0.01),此后回落,但仍维持在较高水平。PcAS感染小鼠原虫血症水平上升缓慢,于感染后第9d红细胞感染率达峰值,随后迅速下降,于感染后第14d自愈,小鼠生存率为100%;Py17XL感染小鼠原虫血症水平迅速升高,于感染后第5d红细胞感染率高达(50.57±9.12)%,小鼠于感染后第5d及次日全部死亡;混合感染小鼠原虫血症水平迅速升高,感染后第5d达峰值,第9d小鼠全部死亡。实时荧光定量PCR检测混合感染小鼠以Py17XL增殖占优势。结论抗疟保护性免疫依赖Th1和Th2型免疫应答的有效建立和协调过渡,免疫应答的模式与宿主病理损伤的程度密切相关。同时提示混合感染的BALB/c小鼠应答模式与Py17XL感染BALB/c小鼠的应答模式相同。