DETECTION OF PLASMODIUM FALCIPARUM LACTATE DEHYDROGENASE A PROMISING APPROACH TO QUICK DIAGNOSIS OF MALARIA

To establish a quick and applicable diagnostic method has been a major target in immunological research on malaria. Of all approaches studied, circulating antigen (CAg) detection seems to be the most promising. Scientists have encountered tough difficulties in the analysis and purification of malaria parasite antigen because of its high complexity. Studies showed that plasmadium falciparum (P.f) lactate dehydrogenase (pLDH), as a specific CAg of malaria parasite. is apparently different from that of human erythrocytes (rLDH) both in their physical and biochemical characteristics. and is very easy to be identifed. Consequently, pLDH detection has a great potential to be developed into a method for assessing parasitemia. This paper reviewed the methods for the purification. separation, identification of pLDH and the prospect of its clinical applications as an ideal detector of the presence of malaria parasite in order to speed up this research.

间日疟原虫和恶性疟原虫乳酸脱氢酶基因的序列和重组抗原表位分析

目的对间日疟原虫和恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)基因的序列及重组抗原的表位进行比较分析。方法根据GenBank中已知的pLDH基因序列(登录号为DQ198262和DQ060151)设计特异性引物,体外扩增间日疟原虫和恶性疟原虫LDH的全长基因,对两序列进行比对分析,用SYFPEITHI软件进行表位预测分析。将Pv-LDH和Pf-LDH基因克隆入pET28a表达载体,转化至大肠埃希菌BL21(DE3)株,加入异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,Westernblotting和中和ELISA法鉴定重组蛋白。结果Pv-LDH和Pf-LDH基因的编码区全长均为951bp,编码316个氨基酸,Pf-LDH与参考序列DQ198262完全一致,而Pv-LDH与参考序列DQ060151仅在第666位有一个核苷酸的变异;两者的核苷酸和氨基酸序列的一致性分别为75.1%和90.2%。T细胞表位预测分析结果显示,能识别pLDH抗原表位的人类白细胞抗原(HLA)分子类型共28种,预测的表位数约为180个,相同或相似的表位约占总表位数的75%,Pv-LDH和Pf-LDH特异性表位分别为38个和45个。Westernblotting分析显示,Pv-LDH重组抗原可被疟疾患者血清识别,但反应强度明显低于Pv-LDH重组抗原免疫兔血清。中和ELISA试验结果显示,Pv-LDH抗原对多克隆抗体最高抑制率可达70.3%,而Pf-LDH抗原的最高抑制率仅为30.5%。结论Pv-LDH和Pf-LDH基因的核苷酸序列及其重组抗原均有差异,特异性表位诱导的抗体在整个抗体谱中相对较少。

恶性疟原虫乳酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定

目的 在大肠杆菌中表达恶性疟原虫乳酸脱氢酶 (LDHp)与谷胱甘肽S 转移酶 (GST)融合蛋白 ,测定重组蛋白的免疫活性。方法 采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫 (海南株 )乳酸脱氢酶基因 ,经双酶切后克隆入 pGEX 4T 1表达载体中 ,重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清 ,并用琼脂双向扩散法检测效价 ,ELISA、Western bloting检测重组抗原的免疫活性。结果 得到了重组表达的蛋白抗原 ,表达产物能与兔抗恶性疟原虫血清发生反应 ,并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答 ,免疫琼脂扩散法抗体滴度为 1∶16。结论 LDHp在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。

恶性疟原虫乳酸脱氢酶特异性单克隆抗体的制备

目的制备恶性疟原虫乳酸脱氢酶特异性单克隆抗体.方法克隆、表达恶性疟原虫乳酸脱氢酶基因,并以表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,对所制备的单克隆抗体确定其亚类和效价,蛋白质印迹法(Western blotting) 分析其特异性.结果成功克隆并表达了恶性疟原虫乳酸脱氢酶基因,以重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶蛋白作为免疫源制备单克隆抗体,共筛选了15株能高效分泌效价在 1∶6 400～1∶51 200 特异抗体的细胞株,抗体亚类为IgG1或IgG2.所有抗体均能唯一识别恶性疟原虫虫源蛋白 Mr 33 000组分,而与疫区非疟疾发热病人的红细胞组分无交叉反应.结论以重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶蛋白为免疫源成功制备了能识别天然恶性疟原虫乳酸脱氢酶蛋白的特异性单克隆抗体.

恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的制备及其鉴定

[目的 ]制备抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶 (LDHp)单克隆抗体 (McAb) ,并对其特异性进行鉴定。[方法 ]用纯化的LDHp重组抗原免疫BALB/c小鼠 ,采用杂交瘤技术制备McAb ,筛选分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株 ,测定其免疫球蛋白亚类及其效价 ,ELISA、Westernblot试验分析其特异性。 [结果 ]筛选出 2A5和1H10两株能稳定分泌抗LDHpMcAb的杂交瘤细胞株 ,两株单抗均为IgG2b,2A5和 1H10培养上清的ELISA效价分别为 1∶5 12和 1∶2 5 6 ,腹水效价分别为 1∶2 5 6 0 0和 1∶12 80 0 ,两株单抗与间日疟原虫、红细胞、弓形虫、日本血吸虫等抗原均不发生交叉反应 ,能识别恶性疟原虫 33kDa的虫源蛋白。 [结论

间日疟原虫部分乳酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的克隆并测定我国间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)的部分基因序列并进行生物信息学分析。方法根据PvLDH基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从间日疟原虫基因组DNA中扩增LDH基因,定向克隆入pMD18质粒。阳性质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用生物信息学网站www.ncbi.nlm.nih.gov、www.expasy.ch对获得的基因及其推导的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果PCR扩增得到特异的间日疟原虫LDH基因序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的重组质粒。测序结果表明,获得的间日疟原虫LDH基因全长897bp,编码299个氨基酸。DNAMAN预测PvLDH存在10个潜在抗原表位,均与PfLDH的相应预测表位间有同源序列。同源性分析显示,我国间日疟原虫与SalvadorⅠ株和Belem株间日疟原虫的氨基酸序列同源性为99%,与其它疟原虫LDH的同源性为88%～90%。结论成功克隆了我国间日疟原虫LDH基因,其基因序列与其它疟原虫LDH基因序列有高度同源性。

间日疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的制备及其鉴定

目的研制间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)单克隆抗体,并对抗体特性进行了初步鉴定。方法用纯化的重组PvLDH蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,测定其免疫球蛋白亚类及效价,结合ELISA、Western blot试验分析其特异性。结果共获得5株稳定分泌抗PvLDH重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别为6D1、6D2、5A10、5C7、4A8。5株单抗培养上清的ELISA效价为1∶512～1∶1024,腹水效价为1∶12800～1∶25600,其中5C7、6D1经Western-blot鉴定能与天然的恶性疟原虫和间日疟原虫的LDH发生特异性反应。结论本研究方法成功制备并获得了针对PvLDH的单克隆抗体,为进一步研究疟疾诊断试剂奠定了基础。

恶性疟原虫乳酸脱氢酶的快速电泳法检测及影响因素

目的建立一种敏感、特异的恶性疟快速诊断方法。方法：应用快速电泳法检测恶性疟病人血样中恶性疟原虫乳酸脱氢酶（ＬＤＨ－Ｐ），并对可能影响检测结果的几种因素进行观察。结果：检测４０份恶性疟病人血样，３８份检测出ＬＤＨ－Ｐ，阳性率为９５％，假阴性率为５％；同时检测４０份间日疟病人血样和２０份正常人血样，均为阴性，无假阳性；血样反复冻融可使ＬＤＨ－Ｐ受到破坏，蛋白酶抑制剂对保存血样中的ＬＤＨ－Ｐ保护作用明显；新鲜血样中加否蛋白酶抑制剂，检测结果差异不明显。结论：快速电泳法检测ＬＤＨ－Ｐ诊断恶性疟，方法简便、敏感性和特异性高，具有很好的现场应用价值。检测新鲜血样中ＬＤＨ－Ｐ效果好。

间日疟原虫乳酸脱氢酶编码区全长基因的克隆、序列分析及线性B细胞表位预测

目的克隆中国间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)编码区全长基因,并对其进行生物信息学分析。方法自间日疟原虫抽提RNA,根据已知的PvLDH基因设计特异性引物,采用RT-PCR扩增PvLDH编码基因,将其克隆至pMD18-T载体,经PCR和双酶切鉴定后进行序列测定,利用生物信息学在线工具对序列进行分析并做B细胞表位预测。结果 PCR产物电泳结果显示所克隆的基因为951bp,基因测序结果与GenBank报道的基因序列有一个碱基差异,但编码氨基酸无差异。在线分析预测出12个B细胞表位,与恶性疟原虫乳酸脱氢酶预测表位对比分析,发现一个PvLDH特异性表位。结论成功克隆了我国间日疟原虫乳酸脱氢酶编码区全长基因,并预测出1个PvLDH特异性线性B细胞表位。

疟疾病人血样中特异性乳酸脱氢酶检测的研究

应用直接电泳法和多克隆抗体捕捉法检测恶性疟和间日疟病人血样各４０份，正常对照血样２０份中恶性疟原虫特异性乳酸脱氢酶（ＬＤＨ－ｐ）。结果表明，两种方法检测恶性疟病人血样的阳性率分别为９０％和９５％；而间日疟和正常人血样中皆未检出ＬＤＨ－ｐ的活性。结果还表明，蛋白酶抑制剂可有效地保护ＬＤＨ－ｐ，而反复冻融则可使ＬＤＨ－ｐ受到破坏，检出率降低。应用直接电泳法和多克隆抗体捕捉法，在蛋白酶抑制剂存在的条件下，检测新鲜血样中ＬＤＨ－ｐ是诊断恶性疟的理想方法。

恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)乳酸脱氢酶基因的分子克隆及序列分析

目的 了解恶性疟原虫海南株 (FCC1/HN)乳酸脱氢酶基因全编码区核苷酸序列变异情况。方法 PCR扩增恶性疟原虫海南株 (FCC1/HN)LDH基因全编码区 ,产物经EcoRⅠ +SalⅠ酶切后 ,定向克隆至pGEX - 4T - 1表达质粒 ,采用Sanger双脱氧链末端终止法测序 ,与其它生物LDH进行同源性分析。 结果 成功地扩增了恶性疟原虫海南株 (FCC1/HN)LDH编码基因 ,大小为 95 1bp ,无内含子 ,与Honduras株LDH基因相比 ,两者有 5个碱基不同 ,推导的氨基酸序列有 4个氨基酸残基不同 ,与刚地弓形虫、隐孢子虫和芽孢杆菌的同源性分别为 49.0 6 % (15 6 / 318)、42 .5 8% (132 / 310 )、31.6 1% (98/310 )。与人的LDH -A、LDH -B和LDH -C的同源性分别为 30 .19% (93/ 30 8)、2 9.5 5 % (91/ 30 8)和 33.44 % (10 4/ 311)。结论 FCC1/HN株与Honduras株LDH高度同源 。

用乳酸脱氢酶为靶分子的免疫层析技术检测恶性疟原虫(英文)

目的建立一种免疫胶体金层析(GICA)法用于恶性疟原虫的检测。方法采用杂交瘤技术制备恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDHpf)单抗,利用筛选出来的单抗制成诊断恶性疟原虫的免疫层析条,以镜检和PCR法为对照,用GICA条检测门诊"四热"病人血样,评价其敏感性和特异性,并对其稳定性进行了初步研究。结果筛选出4株抗LDHpf单抗,间接ELISA表明4株单抗仅与恶性疟原虫发生反应,而与间日疟原虫、红细胞蛋白、刚地弓形虫和日本血吸虫不发生交叉反应。Western-blot结果显示4株单抗能识别恶性疟原虫相对分子质量约为33000处的虫源蛋白。以镜检法和PCR法为标准,GICA条检测恶性疟原虫的敏感性分别为88.37%和86.67%,GICA与镜检法的符合率均为91.55%。结论GICA检测恶性疟原虫简易快速、灵敏度高,无需特殊仪器设备,有望成为一种恶性疟原虫快速免疫诊断试剂盒。

噬菌体随机肽库筛选抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶单抗2A5的识别表位

目的利用噬菌体随机肽库技术筛选恶性疟原虫乳酸脱氢酶(pfLOH)抗体2A5的识别表位。方法以抗pfLDH的单抗2A5筛选噬菌体随机12肽库,挑取阳性克隆测定DNA序列,推导其氨基酸序列并进行同源性分析。通过ELISA、竞争抑制试验鉴定获得的噬菌体短肽与单抗2A5之间的结合特性。结果从噬菌体随机12肽库中筛选出21株可与2A5单抗特异结合的噬菌体克隆,其中多数克隆呈现核心序列SQK(R)L,该序列与pfLDH的一级序列具有一定同源性。竞争抑制实验显示,带有核心序列的噬菌体克隆可与pfLDH竞争结合单抗2A5。结论 SQK(R)L是pfLDH单抗2A5特异识别的表位。

间日疟原虫安徽地域株乳酸脱氢酶基因序列同源性分析

采集安徽省蚌埠市区、五河县、怀远县、蒙城县和利辛县2009-2010年的39例间日疟患者血样,分别提取DNA,PCR扩增间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)基因,并克隆测序,以及Blast序列分析。结果显示,克隆的PvLDH基因片段为951 bp。序列分析发现,采自安徽地区的39例间日疟患者血样的PvLDH基因序列之间无差异(登录号为GU078391),与GenBank中其他地域株的PvLDH基因序列同源性均>99%,氨基酸序列仅分别与EJEU60134株和MIA061251株存在1个氨基酸的差异。

恶性疟原虫FCC1/HN株LDH基因的克隆及序列分析

目的 克隆并测定恶性疟原虫海南（ＦＣＣ１／ＨＮ）株ＬＤＮ基因序列，比较ＦＣＣ１／ＨＮ株与国外分离株ＬＤＨ基因序列的差异。方法 根据 ＬＤＨ基困已知序列设计合成一对引物，应用 ＰＣＲ技术从ＦＣＣ１／ＨＮ株基因组 ＤＮＡ中扩增ＬＤＨ基因，并将其克隆入ｐＭＤ１８－Ｔ载体。用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定，并用分子生物学软伴进行不同分离株ＬＤＨ基因序列的同源性比较。结果ＰＣＲ扩增得到特异的ＦＣＣ１／ＨＮ株ＬＤＨ基因片段并构建了ｐＴ－ＬＤＨ重组质粒。恶性疟原虫 ＦＣＣ１／ＨＮ株 ＬＤＨ基因全长 ９５１ｂｐ，编码３１６个氨基酸。序列分析表明，我国恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ株与国外的３Ｄ７、Ｈｏｎｄｕｒａｓ１株ＬＤＨ基因编码氨基酸序列完全一致。结论 成功克隆恶性疟原虫 ＦＣＣ１／ＨＮ株ＬＤＨ基因。序列测定及同源性分析表明，ＦＣＣ１／ＨＮ株与其它分离株的ＬＤＨ基因序列高度保守。

恶性疟原虫乳酸脱氢酶基因的克隆表达及表达产物免疫原性的鉴定

目的:克隆表达恶性疟原虫(Plasmodium falciparum,p.f)海南株(FCC1/HN)乳酸脱氢酶(LDH),并对其免疫原性进行鉴定,为制备抗LDH抗体用于胶体金法快速检测疟原虫奠定基础。方法:应用PCR技术对恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDHpf)基因进行特异性扩增,将扩增产物克隆入表达载体pET-32a(+),重组表达载体经鉴定后诱导表达;重组LDHpf(rLDHpf)经纯化后,免疫家兔制备兔抗rLDHpf免疫血清,间接免疫荧光和Western印迹鉴定表达产物的免疫原性。结果:构建了pET-32a/LDHpf重组表达载体,测序后同源性分析显示p.f不同株间LDH氨基酸序列同源性大于98%,不同种间同源性也在90%以上;间接免疫荧光和Western印迹分析显示rLDHpf具有较好的免疫原性。结论:LDHpf基因高度保守;rLDHpf得到高效表达并具有良好的免疫原性。

乳酸脱氢酶法检测恶性疟原虫融合蛋白-2.9免疫血清体外抑制效果

目的用乳酸脱氢酶(LDH)法检测恶性疟原虫融合蛋白(PfCP-2.9)免疫兔血清体外抑制恶性疟原虫生长的效果。方法将恶性疟原虫起始培养物的原虫率稀释为(0.4±0.1)%,红细胞压积为2%,使用不同浓度恶性疟原虫融合抗原PfCP-2.9免疫兔血清进行恶性疟原虫体外生长抑制试验,40～42h后分别用LDH检测法和传统镜检计数法检测原虫生长抑制率。结果PfCP-2.9免疫兔血清在体外对恶性疟原虫有较强的抑制作用。LDH测定法与传统镜检法测得体外恶性疟原虫抑制率相近(分别为97%和100%),两者差异无统计学意义(P>0.05)。结论LDH法检测恶性疟原虫体外抑制试验是一种简单、可行的实验方法。

间日疟原虫乳酸脱氢酶GST融合表达载体的构建及表达

目的构建间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)融合表达载体,并表达PvLDH的GST融合蛋白。方法将PvLDH基因片段克隆到表达载体pGEX-4T-1中,构建PvLDH/pGEX-4T-1融合表达载体,IPTG诱导表达目的基因,SDS-PAGE电泳分析表达产物,Western blot检测其抗原性。结果成功构建了PvLDH/pGEX-4T-1融合表达系统,在大肠杆菌BL21中以包涵体形式高效表达,表达产物能与恶性疟原虫和间日疟原虫感染患者血清反应,而不与正常人血清反应。结论间日疟原虫LDH蛋白在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物具有良好的抗原性。

薄层色谱法检测恶性疟原虫乳酸脱氢酶的研究

目的建立一种敏感、简便、快速的恶性疟诊断方法。方法应用薄层色谱法检测体外培养的不同虫株恶性疟原虫感染红细胞中的恶性疟原虫乳酸脱氢酶 (LDH-p)。结果该方法的敏感度可达 1 0个原虫 /μl～ 2 0个原虫 /μl血。检测感染期相同、原虫密度均为 5%的恶性疟原虫 FCC-1 /HN株、FCC-1 /AH株、FCC/YN株感染红细胞的最高阳性稀释度不同 ,提示不同虫株恶性疟原虫体内的 LDH可能存在着差异。整个检测过程3 0 min,不需特殊设备 ,费用低廉。结论薄层色谱法检测恶性疟原虫乳酸脱氢酶敏感、简便。

万孚疟原虫检测试剂盒检测卵形疟原虫效果评价及影响因素分析

目的评价万孚疟原虫检测试剂盒（Pf-LDH/Pan-p LDH）对卵形疟原虫的检测效果,并分析原虫密度、疟原虫乳酸脱氢酶（p LDH）浓度和基因多态性等因素对检测结果的影响。方法按照万孚疟原虫检测试剂盒的操作说明书,对经PCR确认的100份卵形疟患者血样进行检测。采用显微镜镜检法计数患者血片的原虫密度,以ELISA法检测血样中的p LDH浓度,以PCR扩增卵形疟原虫LDH（Po-LDH）基因并测序,并分析上述3个因素对检出率的影响。结果万孚疟原虫检测试剂盒对上述100份卵形疟患者血样的总体检出率为70.0%（70/100）。当原虫密度≤500个/μl时,检出率为27.3%;原虫密度〉500个/μl时,检出率为75.0%～75.4%。当p LDH浓度较低时（A值≤0.100）,检出率为6.7%;p LDH达到一定浓度时（A值〉0.100）,检出率为95.1%～100%。Po-LDH基因序列分析结果显示所有卵形疟样本可分为2种亚型,分别为卵形疟原虫curtisi亚种（P.o.curtisi）和卵形疟原虫wallikeri亚种（P.o.wallikeri）。2种亚型的LDH基因同源性为97%,共有24个单核苷酸多态性（SNP）,其中3个SNPs为非同义突变,其余均为同义突变。2种亚型的LDH编码氨基酸序列同源性为99%,共有3个氨基酸的差异。万孚疟原虫检测试剂盒对P.o.curtisi的检出率为73.1%（38/52）,对P.o.wallikeri的检出率为66.7%（32/48）,两者差异无统计学意义（P〉0.05）。结论万孚疟原虫检测试剂盒对卵形疟原虫的检测效果优于大部分同类产品,其检出率与原虫密度、p LDH浓度关系密切,与p LDH基因多态性无关。