葡萄霜霉菌糖基水解酶基因的表达模式与功能分析

【目的】克隆葡萄霜霉菌(Plasmopara viticola)糖基水解酶(glycosyl hydrolase,GH)基因(PvGH),分析其特征以及在葡萄霜霉菌侵染葡萄叶片过程中的表达模式,研究其抑制/促进烟草叶片程序性细胞死亡(PCD)以及影响烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)侵染的能力,为深入探究调控寄主植物免疫的机制提供理论依据。【方法】以葡萄霜霉菌Pv5-27菌株作为试材,采用RT-PCR方法扩增获得8个PvGH基因全长,并对其基因及编码蛋白进行生物信息学分析;利用酵母信号肽诱捕系统(SST)验证PvGH的分泌活性;利用实时荧光定量PCR技术检测葡萄霜霉菌侵染葡萄叶片过程中PvGH的表达模式;同时利用农杆菌介导的PVX病毒表达系统在本氏烟上瞬时表达PvGH效应蛋白,分析其对INF1和BAX触发的烟草PCD的抑制能力以及促进烟草疫霉侵染的能力。【结果】8个PvGH基因序列与通过全基因组预测的序列完全一致,长度为1 092—1 392 bp,分别编码364—464个氨基酸,与其他卵菌同源蛋白相似性高达60.62%—86.36%。8个PvGH均不含跨膜结构域,其二级结构差异较大,三级结构与其他蛋白三级结构相似性较低,呈现非常独特的三级结构。使用SingalP 5.0软件对编码的蛋白进行信号肽预测,发现它们均含有20—26 aa的信号肽,但通过SST验证结果显示PvG09279和PvG13517并不具有分泌特性。保留、缺失或者替换信号肽的8个PvGH均可抑制BAX触发的本氏烟PCD,并促进烟草疫霉的侵染,表明PvGH效应蛋白发挥其毒力不依赖于信号肽。PvGH在葡萄霜霉菌侵染初期表达上调,进一步表明其在病原菌与寄主互作中的重要作用。【结论】在侵染寄主过程中,葡萄霜霉菌分泌的PvGH通过抑制寄主PTI反应参与致病过程。

云南省葡萄霜霉病菌群体遗传结构的SSR分析

为明确云南特色葡萄产区葡萄霜霉病菌的群体遗传结构,本研究采用7对SSR分子标记对采自云南3个地区的155株葡萄霜霉病菌进行了群体遗传多样性研究,并分析了病原菌群体遗传结构与地域之间的关系。7对引物共检测出41个等位基因,114种基因型,病原菌群体的Shannon’s信息指数和Nei’s无偏基因多样性指数分别为0.942和0.600。分子方差分析和群体连锁不平衡分析显示,不同群体间存在相当大的遗传变异。遗传分化系数、基因流以及Structure分析表明,元谋群体与宾川、寻甸两群体之间均具有较高的基因交流,宾川和寻甸两群体间则存在一定的遗传分化。上述结果表明,云南葡萄霜霉病菌群体存在较高水平的遗传多样性,且群体遗传结构与地理距离之间存在一定相关性。

中国4省份葡萄霜霉病菌群体对烯酰吗啉的抗性及适合度

为明确我国山西、山东、河北和云南省葡萄霜霉病菌对烯酰吗啉的抗性以及田间病菌群体的适合度,本研究采用Taqman-MGB技术检测了2020年-2021年采自上述4省份292株葡萄霜霉病菌对烯酰吗啉的抗性频率;采用叶盘法测定了田间抗性菌株与敏感菌株的适合度。结果表明,上述4个地区的平均烯酰吗啉抗性频率及抗性等位基因频率分别为64.0%和74.7%,其中山东省蓬莱区最高(91.2%和96.3%),河北省廊坊市(73.8%和85.0%)和云南省宾川县(75.0%和82.6%)次之,山西省清徐县(16.7%和34.7%)最低。适合度分析发现,田间抗性菌株的产孢能力明显高于敏感菌株,但二者的复合适合度指数无显著差异。上述结果表明,4省份霜霉病菌群体均对烯酰吗啉产生了不同程度的抗性,田间抗性菌株与敏感菌株相比无明显适合度变化。

葡萄霜霉病有效药剂筛选及药效评价

采用叶盘漂浮法测定了保护性杀菌剂二硫代氨基甲酸盐类、咪唑类、吡啶类,内吸性杀菌剂酰胺类、烟酰胺类、甲氧基丙烯酸酯类、三唑类、氨基甲酸酯类、恶唑类及多种复配剂等对葡萄霜霉病菌的毒力,并进行了田间药效试验。室内药剂测定结果表明,当前生产上的主要药剂和新投入到市场中的部分药剂对葡萄霜霉病菌表现较高毒力;6种复配药剂对葡萄霜霉病菌菌株的毒力高于单剂。田间试验结果表明试验药剂均可有效地控制葡萄霜霉病的发生和危害。

避雨栽培对葡萄霜霉病菌孢子囊飞散时空动态的影响

【目的】葡萄霜霉病是葡萄生产上最重要的病害之一,在多雨潮湿地区常造成严重的产量损失。研究旨在明确避雨栽培对葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)孢子囊飞散的影响,确定孢子囊飞散与病情变化之间关系,揭示避雨栽培对病菌数量的控制作用,推测避雨栽培下霜霉病的初侵染来源,为葡萄霜霉病的科学防控提供理论依据。【方法】2013年生长季7—9月份,分别对沈阳地区露地和避雨栽培小区内葡萄霜霉病发病情况进行定株定枝系统调查,统计得到病叶率和病情指数。应用SPSS19.0中回归曲线估计程序构建葡萄霜霉病流行时间动态模型,获得能描述不同栽培模式下葡萄霜霉病发病动态的模型参数,并推导2种栽培模式下霜霉病流行时期和流行速率。通过对田间小区内的孢子囊飞散进行定期监测,对比不同栽培模式下孢子囊飞散时间动态差异,探索关键流行时期内病害流行速率与捕孢量之间的关系。对比分析避雨栽培对葡萄霜霉病孢子囊水平、垂直方向飞散的影响,明确关键流行时期内孢子囊的主要来源和孢子囊飞散的主要影响因素。【结果】避雨和露地栽培下葡萄霜霉病的季节流行曲线趋势一致,均表现为典型的S形曲线。应用SPSS19.0软件分析,明确了Logistic模型能够反映沈阳地区葡萄霜霉病流行时间动态情况。露地和避雨栽培下病害流行时期:指数增长期分别为7月5—23日和8月18—30日,逻辑斯蒂增长期分别为7月23日至8月19日和8月30日至9月17日,衰退期分别为8月19日至葡萄生育末期和9月17日至葡萄生育末期。露地栽培下整个生长季孢子囊飞散表现为多峰曲线,当日降雨对孢子囊飞散有显著的冲刷作用。沈阳地区露地和避雨栽培下孢子囊飞散盛期分别为7—8月和8—9月。避雨栽培可明显降低空中孢子囊数量,从而减少孢子囊与避雨设施内葡萄叶片的接触概率,达到降低菌源基数的作用。避雨设施边行最早捕获孢子囊,且数量最多,随着逐渐向中心靠近,首次捕孢时间逐渐推迟,数量逐渐降低。葡萄叶幕对于孢子囊水平方向的飞散具有显著的阻隔效应。不同栽培模式下均以接近地面处的捕孢量最大,且随着高度增加,捕孢量逐渐减少。避雨设施对于接近棚顶处的孢子囊飞散有着显著的遮蔽作用。【结论】避雨栽培可推迟葡萄霜霉病始发时间和首次捕孢时间,缩短病害流行过程和孢子囊飞散周期,显著降低病害流行程度和孢子囊飞散数量。孢子囊飞散受到葡萄叶幕和避雨设施显著的阻隔效应。避雨栽培下葡萄霜霉病的初侵染主要为本地露地栽培下葡萄霜霉病病株上的病斑产生的孢子囊。

葡萄霜霉菌孢子囊扩散动态及与田间病情的相关性

病原体的数量和密度是病害发生和流行的重要因素之一,也是病害预测预报的重要依据。葡萄霜霉病是新疆葡萄上的一种重要病害,有必要对其病菌的扩散动态进行研究,从而对病害进行预测。采取孢子捕捉和田间系统调查相结合的方法,研究了葡萄霜霉菌孢子囊的时空扩散动态,并分析其与田间病情的相关性。结果表明,葡萄霜霉菌孢子囊一般在6月上中旬开始出现,7月下旬到9月上旬为高峰期,随后进入消退期。其孢子囊通常在葡萄冠层以下分布较多,一天24 h内都可捕到孢子囊,但一般8:00左右和20:00左右捕捉量最多。孢子囊的扩散与温度呈正相关,与湿度和降雨量呈负相关。在P<0.01水平下,霜霉病菌孢子囊扩散动态与5 d后病害的发生呈显著正相关。

葡萄霜霉病拮抗细菌的筛选、鉴定及发酵条件优化

【目的】分离获得对葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)具有明显拮抗效果的菌株,优化其产生抑菌活性物质的发酵条件,为葡萄霜霉病菌的生物防治提供潜在的资源菌。【方法】从染病葡萄植株健康叶片中分离内生菌,采用离体叶片防效试验筛选拮抗菌。根据菌株的形态与生理生化特征、16S r DNA序列分析对其进行鉴定,并采用单因素试验优化培养基组分及发酵条件。【结果】从健康叶片中共分离得到56株内生细菌,其中编号为CS5的菌株对葡萄霜霉病菌的拮抗效果最佳,7 d后对葡萄离体叶片霜霉病防治效果达96.23%,初步鉴定该菌株属于芽孢杆菌属。其最佳发酵碳源为可溶性淀粉,氮源为酵母膏,初始p H值为6.0。【结论】经鉴定,拮抗菌株为Bacillus amyloliquefaciens。在优化的发酵条件下,该菌株对葡萄霜霉病具有更好的拮抗作用。

山葡萄种间杂交F1～F4代对霜霉病抗性的遗传分析

1973—2006年对我国东北山葡萄抗寒的种质资源(品种、品系)与不抗寒的欧亚种酿造葡萄品种进行种间杂交、回交和重复杂交。共定植42个组合杂种苗,定植成活7680株。观察42个组合7680株杂种苗F1￣F4代对霜霉病抗性的的抗性分离,共分离出抗病(2￣3级)3747株,占杂种苗总株数48.8%。其中抗病×抗病的10个组合共分离出抗病2303株、占69.3%,分别高于抗病×不抗病、中等感病×中等感病、中等感病×高感病、高感病×高感病的组合的23.2、29.2、45.3和54.8个百分点。遗传规律是:山葡萄种间杂交后代F1￣F4对霜霉病抗性分离,表现为连续分布,倾向于抗病亲本,后代群体抗病性主要由亲本抗病性决定,杂交组合中抗病亲本越多,分离出的抗病单株越多,为多基因控制的数量性状遗传、"抗病基因"有累加效应、呈显性遗传给后代。已选育出抗霜霉病、抗寒、可酿造干红山葡萄酒的新品种左优红、品系94-7-75、94-8-168、95-2-482和2002-1-135。

避雨栽培对葡萄霜霉病发生的影响与葡萄冠层微气象因子的关系

系统比较了云南省石林县(‘红地球’)和弥勒县(‘水晶葡萄’)葡萄园采用避雨栽培和露天栽培对葡萄霜霉病Plasmoparaviticola(Berk.&Curtis)Berl.&de Toni.的防治效果,监测了田间葡萄园内避雨栽培和露天栽培处理中葡萄霜霉病的发生流行与植株冠层气象因子的变化情况,并结合适宜葡萄霜霉病病害循环的温度、相对湿度、叶面持露时间及田间葡萄植株冠层微气象因子的变化对避雨栽培有效防治葡萄霜霉病的气象原理进行了分析。结果表明,避雨处理可有效控制葡萄霜霉病的发生和危害,石林县和弥勒县两地葡萄园的防治效果分别达到97.84%和66.29%。弥勒县‘水晶葡萄’对霜霉病的抗性较强,霜霉病发生较轻,但在避雨栽培条件下霜霉病的病情指数也显著低于对照。植株冠层微气象因子变化分析表明,避雨栽培可以减少决定霜霉病菌能否成功侵染的叶面水膜持续时间,创造不适宜霜霉病菌萌发和侵入的条件,还可以显著减低棚内植株冠层适宜孢子囊产生的相对湿度的持续时间,减少霜霉病菌的侵染菌量,从而有效地控制了霜霉病的发生和危害。

葡萄种质资源抗霜霉病鉴定

【目的】明确83个葡萄种质资源对霜霉病的抗病性,旨在为霜霉病的防治和抗霜霉病育种中的亲本选择提供依据。【方法】通过室内离体叶片接种鉴定、田间发病高峰期自然条件鉴定,明确供试种质资源对霜霉病的抗性;通过现场调查葡萄叶片上茸毛的多少和叶片钾、钙含量测定,初步明确它们与品种抗性的关系。【结果】在83个葡萄种质资源中,未发现对霜霉病表现免疫的品种,卡托巴表现高抗;北醇等9个品种表现抗病;弗雷等45个品种表现感病;红地球等28个品种表现高感。其抗性与叶片中钾、钙含量没明显关系。【结论】不同葡萄品种对霜霉病的抗性存在明显差异,大多数美洲种和欧美杂交种对霜霉病的抗性强于欧亚品种;其抗病性与叶片背面茸毛的有无及多少存在一定关系,但并不绝对;与叶片钾、钙含量无明显关系。

不同葡萄品种对霜霉病的抗性鉴定

【目的】葡萄霜霉病是新疆葡萄上最严重的病害之一,通过抗病品种进行防治是最简单、最经济、最有效的措施。搞清目前当地一些品种对葡萄霜霉病的抗性,为防治该病提供依据。【方法】通过对不同葡萄品种的室内离体叶片接种试验、田间接种试验、大田发病情况调查及不同品种田间接种后病斑大小和单斑含孢量的测定,及其叶片背面气孔数量和结构的扫描电镜观察等,对不同品种的抗性进行比较和鉴定。【结果】室内外接种试验和大田调查都表明,在供试品种中,弗雷和克瑞森比较抗病,且其病斑较小,单斑含孢量也较少。其叶片气孔数量和大小与感病品种无核白鸡心等相比也较少而小。【结论】克瑞森和弗雷比较抗病,无核紫、紫香无核、红提、无核白鸡心和里扎马特等感病或高度感病。

山葡萄种内杂交F_1对霜霉病抗性遗传的研究

通过田间自然鉴定和室内人工接种鉴定，研究了山葡萄种内杂交、自交和自然授粉实生的１２个组合２５８０株杂种苗对霜霉病的抗性及其遗传特征。结果表明，山葡萄有抗霜霉病和不抗霜霉病的类型。后代组合群体的抗病性差异显著，呈连续性分布，表现出数量性状遗传特征，Ｆ１代感病级次高于亲中值，抗病类型的品种、品系中存在微效抗病多基因，后代群体抗病性主要由亲本抗病性所决定。已从通化３号×双庆、左山一自然授粉实生组合中选育出抗霜霉病的两性花新品系０１６、８８－１００和７７－７－６４。

生防细菌SY286的筛选及其对葡萄霜霉病的防治效果研究

从辽宁省9个地区葡萄园采集葡萄叶片36份，分离获得303株细菌，并筛选出对葡萄霜霉病菌Plasmopara viticola具有抑制作用的12株细菌，其中抑制作用最强的为菌株SY286，其在离体叶片上对葡萄霜霉病防效可达93.18%。在2012-2013年进行2次田间防效试验，结果表明菌株SY286发酵原液对葡萄霜霉病防效可达80%以上。抑菌谱试验表明，该菌株对供试的10种植物病原真菌均有较好的抑菌作用，抑菌带宽度为5.93～24.90 mm。经形态观察、生理生化特征和16S rDNA 同源性分析，鉴定为苍白杆菌Ochrobactrum sp.。

霜霉病菌对葡萄细胞壁水解酶的诱导作用与寄主抗病性的关系

葡萄霜霉病菌能诱导葡萄叶片几丁质酶和 β- 1 ,3-葡聚糖酶的积累 ,但 2种酶在积累的速度上和幅度上 ,抗病品种和感病品种有显著的差异。与感病品种乍娜、红提相比 ,抗病品种赤霞珠 2种酶活性不仅升高的速度快、幅度大 。

葡萄品种抗霜霉病不同鉴定方法的比较和相关性分析

[目的]选择适宜的接种方法是品种抗病性鉴定能否成功及鉴定结果是否可靠的重要因素之一。研究通过对葡萄品种抗霜霉病不同鉴定方法的比较和相关性分析,旨在寻找一种简单、快速的鉴定方法,为品种抗病性鉴定和霜霉病菌致病性分化研究奠定基础。[方法]采用室内离体叶片接种鉴定、田间叶片接种鉴定和自然条件下发病鉴定三种方法对15个抗病性不同的葡萄品种进行抗霜霉病鉴定,鉴定结果用DPS软件进行相关性分析,并对三种方法的可行性进行比较。[结果]三种鉴定方法的结果基本一致,其相关系数均在0.95以上,从中初步筛选出对霜霉病高抗、抗病、感病和高感的品种,为品种抗病性鉴定和霜霉病菌致病性分化研究奠定了基础。[结论]室内离体叶片接种鉴定方法简单,快速,环境条件易控制,其结果可以反映葡萄品种对霜霉病的抗感程度。

葡萄霜霉病菌拮抗放线菌PY-1发酵条件优化

为探讨暗黑链霉菌Streptomyces atratus PY-1液体摇瓶发酵条件,提高其活性次级代谢产物的产量,以菌体生物量和发酵液抑制葡萄霜霉病菌Plasmopara viticola活性为指标,采用单因子试验和正交试验对菌株PY-1的最适发酵培养基成分及发酵条件进行优化。结果表明,菌株PY-1最适发酵培养基为玉米粉50 g/L、葡萄糖5 g/L、蛋白胨5 g/L、氯化铵5 g/L、氯化钠0.5 g/L;最佳发酵培养条件为培养温度28℃、培养时间5 d、初始p H 7.0、250 m L三角瓶装液量90 m L、接种量体积分数5%、摇床转速180 r/min。在最佳发酵培养基和培养条件下,菌株PY-1发酵液抑菌率达到99.26%,抑菌能力提高8.35%。

不同酒葡萄品种感染霜霉病后叶片生理特性的变化

为在酒葡萄的栽培中选用抗性品种和为病害防治提供依据,以不同抗性的酒葡萄品种SV6059(抗病品种)和品丽珠(感病品种)为试验材料,研究了在葡萄霜霉菌诱导下,叶片的超氧化物歧化酶(SOD)的活性、可溶性糖、可溶性蛋白、叶绿素含量及含水量的动态变化。结果表明:在葡萄霜霉菌诱导下抗病品种SV6059感病后在短时间内(6d)能使SOD酶活性、可溶性糖含量、叶绿素含量和含水量基本恢复到正常的状态,其自我调节恢复正常的能力显著大于感病品种品丽珠,其可溶性糖的含量和含水量比感病品种高,而可溶性蛋白质的含量和光合色素的含量比感病品种低。抗病品种SV6059和感病品种品丽珠在诱导后第4天SOD酶活性、可溶性糖含量和叶绿素含量均达到高峰。抗病品种抑制叶绿素含量和含水量下降的能力明显强于感病品种。

天水地区葡萄霜霉病田间病情、孢子囊数量动态及病害始发关键因子分析

葡萄霜霉病是为害天水地区葡萄的主要病害,为明确当前环境条件下天水地区田间霜霉病发生、霜霉病菌孢子囊数量时间动态及病害初始发生的关键因子,本研究采用捕孢法及病害定点调查,对葡萄生长期田间霜霉病菌孢子囊数量及霜霉病发生动态进行了观测,用农田小气候自动观测仪记录田间气象数据。结果表明,天水地区葡萄霜霉病菌孢子囊始见期一般为7月初左右,若条件适宜,7月下旬至8月下旬为扩散盛期,9月以后进入快速消退期;田间病害始发期为7月上中旬,条件适宜时8月中下旬进入盛发期。在田间检测到霜霉病菌孢子囊后7 d左右田间开始见到霜霉病斑,从病害始发期至盛发期田间病情扩展与霜霉菌孢子囊数量呈显著正相关;葡萄霜霉病的发生与温度、相对湿度、降水等气象因子密切相关,其中有效降水是影响葡萄霜霉病初始发生及蔓延流行的关键气象因子。

葡萄霜霉病田间调查及防治效果试验

葡萄霜霉病是中国葡萄产区的重要病害之一,为了该病害的防治,2012年笔者调查了北京地区30个不同葡萄品种霜霉病的田间发生情况,并对病情指数进行了差异显著性和聚类分析。结果发现:30个葡萄品种被划分为4类:第1类包括‘甲斐乙女’、87-1、‘京早晶’、‘黑奥林’、‘红富士’、‘奥迪亚无核’和‘红伊豆’,田间发病程度最重,病情指数为61.63～49.96;第2类包括‘茉莉’、‘贵妃玫瑰’、‘秋黑’、‘亚都蜜’、‘龙宝’、‘美人指’和‘红宝石无核’,发病程度较重,病情指数为44.91～28.56;第3类包括‘红双味’‘、玫瑰香’‘、里扎马特’‘、无核早红’‘、世纪无核’‘、亚历山大’和‘黄意大利’,发病程度中等,病情指数为23.86～12.64;第4类包括‘葡萄园皇后’、‘巨峰’、‘香妃’、‘魏可’、‘醉金香’、‘藤捻’、‘红脸无核’、‘夏黑’和‘黎明无核’,发病最轻,病情指数为10.47～3.78。调查结果一定程度上反映了这些品种在生产上对霜霉病的抗性,为抗病品种的利用提供了参考依据。另外,试验还在田间进行了6种农药对霜霉病防治效果的比较,结果发现它们对葡萄霜霉病均有较好的防治效果。其中,代森锰锌、波尔多液和百菌清效果最好,可达87.23%～76.48%,它们可作为田间防治霜霉病的推荐药剂。

葡萄叶片叶绿素质量分数与其霜霉病抗性的关系

对甘肃省8个不同鲜食葡萄品种进行抗性鉴定,并研究叶片叶绿素质量分数与霜霉病抗性的关系。结果表明,‘醉人香’‘高妻’和‘夏黑’为抗病品种,‘红地球’和‘奥古斯特’为感病品种,‘瑞必尔’‘金秀’和‘火焰无核’为高感品种。葡萄叶片内叶绿素总质量分数和品种与霜霉病的抗性不显著相关,但叶片叶绿素总质量分数降幅与霜霉病的抗性呈显著负相关,即叶片叶绿素总质量分数降幅与叶片病情指数呈显著正相关。叶片叶绿素总质量分数降幅低于30%时,品种表现为明显抗病;降幅为30%～40%时,品种表现为感病;而降幅高于40%时,品种表现为高感。表明,葡萄叶片叶绿素总质量分数降幅可作为葡萄对霜霉病抗性鉴定的辅助指标。