钩端螺旋体vwA1和vwA2基因原核表达产物功能的初步研究

目的构建致病性问号钩端螺旋体（简称钩体）黄疸出血群赖型赖株伽A1和优以2基因原核表达系统，初步了解目的重组表达产物rVwA1和rVwA2与血小板性出血相关性。方法采用高保真PcR扩增问号钩体赖株vwA1和vwA2基因并测序，常规方法构建伽A1和似值2基因原核表达系统。采用sDs-PAGE联合Bio—Rad凝胶图像分析系统检查rVwAl和rVwA2表达情况及其可溶性，Nj-NTA亲和层析柱提纯rVwA1和rVwA2。采用实时荧光定量RT—PcR检测问号钩体赖株感染人脐静脉内皮细胞株HuVEc前后vwA1—mRNA和vwA1-mRNA水平变化。采用流式细胞术检测rVwA1与人血小板膜糖蛋白结合能力。采用酶切试验及SDs-PAGE观察人血管性血友病因子裂解酶ADAMTs13水解rVwA2的情况。结果所克隆的钩体vwA1和vwA2基因与报道的相应基因比较，其核苷酸和氨基酸序列相似性均为100％。所构建的vwA1和vwA2基因原核表达系统能分别表达可溶性rVwAl和rVwA2。问号钩体赖株感染HuVEc8h后，钩体vwA1-mRNA和vwA2-mRNA水平均显著上调（P〈0．05）。流式细胞术检测结果显示，钩体rVwA1与人血小板结合率为60．8％。人ADAMTS13可水解重组人vwF—A2（rhvwF—A2），但不能水解钩体rVwA2。结论vwA1和vwA2基因可能在钩体感染中发挥作用，其中vwA1基因产物功能与钩体病出血密切相关。