NR2F2基因调控猪PK15细胞增殖和凋亡的研究

旨在探究NR2F2基因对猪PK15细胞增殖和凋亡的影响。本研究在猪PK15细胞中过表达NR2F2基因,通过qRT-PCR、Western blot、CCK-8、EdU、流式细胞术、划痕试验等方法检测了过表达NR2F2基因对细胞增殖的影响;采用CO-IP技术验证NR2F2与Smad4蛋白结合能力;用qRT-PCR方法检测了NR2F2基因对Smad 4基因表达以及下游基因Cyclin B、CDK1、CDK4、Cyclin D 1表达的影响;挽救试验过表达NR2F2基因且干扰Smad 4基因检测下游基因及增殖基因Ki67、PCNA的表达。结果发现,过表达NR2F2基因极显著上调了Ki 67基因的表达(P<0.01),显著上调了PCNA的表达(P<0.05),促进了细胞周期的进程,抑制了细胞凋亡,促进了细胞的增殖。CO-IP结果证明了NR2F2与Smad4蛋白物理性结合,且发现过表达NR2F2基因后,Smad 4基因表达显著上升(P<0.01),Smad 4基因调控的下游基因Cyclin B、CDK1、CDK4、Cyclin D 1表达显著升高(P<0.01);干扰NR2F2基因后,Smad 4基因表达显著下降(P<0.01),Smad 4基因调控的下游基因表达显著降低(P<0.01)。挽救试验发现,过表达NR2F2基因后,干扰Smad 4基因的表达,能显著降低Cyclin D1、Cyclin B、CDK 1以及Ki67、PCNA的表达(P<0.01,P<0.05)。本研究结果表明,过表达NR2F2基因后促进了细胞的增殖,抑制凋亡,且NR2F2蛋白能与Smad4蛋白结合并影响Smad 4基因的表达,进而影响下游基因的表达。

裂殖壶菌pks2基因启动子序列扩增及其活性分析

针对目前裂殖壶菌(Aurantiochytrium limacinum)基因工程相关研究中,对内源启动子的了解和利用仍处在初步阶段的现状,本研究从裂殖壶菌中产多不饱和脂肪酸的主要途径聚酮合酶(PKS)途径出发,利用热不对称交错PCR技术(TAIL-PCR),针对pks2基因扩增出了未知的5’端侧翼序列,初步分析得到pks2基因启动子序列,并分别在原核宿主大肠杆菌(Escherichia coli)与真核宿主酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中对启动子活性做进一步研究,发现了pks2基因启动子可以在大肠杆菌和酿酒酵母中有效启动绿色荧光蛋白的表达,而且pks2基因启动子相较于pks1、pks3基因启动子具有更高的启动活性,显现出了其作为启动子用于基因工程研究的可操作性。

穴位刺激联合COX-2抑制剂对乳腺癌骨转移大鼠镇痛、NK细胞活性及PK2蛋白水平的影响

目的:探究穴位刺激联合COX-2抑制剂对乳腺癌骨转移大鼠镇痛、NK细胞活性及PK2蛋白的作用机制。方法:选取50只SPF级SD雌性大鼠,随机数字表法分为正常(A)组、模型(B)组、穴位刺激(C)组、COX-2抑制剂(D)组与穴位刺激联合COX-2抑制剂(E)组,每组10只,对B、C、D与E组采用胫骨内注射乳腺癌细胞建立乳腺癌骨转移模型,A组不建立该模型,建模成功后,对C组给予穴位刺激治疗,对D组给予灌胃25 mg/kg的塞来昔布,对E组给予穴位刺激联合塞来昔布治疗,A组、B组同期给予灌胃同体积生理盐水,观察并记录大鼠疼痛情况,双能线骨密度仪检测大鼠骨密度及骨矿物质含量,HE染色法检测骨组织病理形态,免疫印迹法检测NK细胞活性,免疫组化法检测PK2蛋白表达。结果:与A组比较,B组50%PWT、TWL显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05),双侧后肢负重差值显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05),与B组比较,C组、D组与E组50%PWT、TWL明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05),双侧后肢负重差值显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05),且D组与C组比较差异无统计学意义(P>0.05),E组比D组变化明显,差异具有统计学意义(P<0.05);A组大鼠骨组织形态完整,骨小梁排列整齐,骨皮质连续,无坏死区域,骨髓腔内充满深染的血细胞,B组骨组织形态遭到破坏,骨皮质出现连续性中断,并可见大量肿瘤细胞浸润,瘤细胞形态不规则,且排列紊乱,细胞核大,异型性明显,与B组比较,C组、D组与E组病理形态明显改善;与A组比较,B组BMD、BMC显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05),与B组比较,C组、D组、E组BMD、BMC显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05),且D组与C组比较差异无统计学意义(P>0.05),E组比D组升高显著,差异具有统计学意义(P<0.05);与A组比较,B组大鼠胫骨组织中NKp30、NKp44、NKp46蛋白表达显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05),与B组比较,C组、D组与E组大鼠胫骨组织中NKp30、NKp44及NKp46蛋白表达显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05),且D组与C组比较差异无统计学意义(P>0.05),E组比D组升高显著,差异具有统计学意义(P<0.05);与A组比较,B组大鼠胫骨组织中PK2蛋白表达显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05),与B组比较,C组、D组与E组大鼠胫骨组织中PK2蛋白表达显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05),且D组与C组比较差异无统计学意义(P>0.05),E组比D组升高显著,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:穴位刺激联合COX-2抑制剂对乳腺癌骨转移大鼠具有显著的镇痛作用,并可显著改善NK细胞活性,促进PK2蛋白表达。

梵语-龟兹语文书PK AS 2B治风方考

梵语-龟兹语双语医学文书PK AS 2B共载有3颂药方,其内容与古印度阿育吠陀医学典籍《百医方》相对应。其中有1颂药方为治风方,属于阿育吠陀医学经典药方,同类药方还见于其他多部医典。该方治风理念既包含阿育吠陀医学思想,又包含佛教医学理念;同时该药方的梵语部分和龟兹语部分并不一一对应,反映出古代龟兹地区的医学在接受外来医药文化过程中的融合与创新。

大鼠海马脑片缺氧诱导Ca^(2+)/CaM PKII活性抑制机理的研究

采用大鼠海马脑片体外缺氧模型，观察了Ca2+和氯胺酮对海马脑片Ca2+／CaMPKⅡ活性的影响，同时观察了缺氧对神经元胞外谷氨酸堆积的影响。结果如下：（1）有钙或无钙培养时，酶活性随缺氧时间的延长均下降，但前者比后者酶活性下降更显著，提示外ca2+在神经元缺氧损伤中起重要作用。（2）海马脑片在体外缺氧30min，谷氨酸在胞外的堆积增加2倍多。（3）单纯过量外源性谷氨酸能引起酶活性显著下降，提示脑缺氧时酶活性的抑制与兴奋毒性有关。（4）氯胺酮对缺氧和单纯外源性谷氨酸所诱导的酶活性抑制均有明显的拮抗作用，说明脑缺氧引起酶活性下降与NMDA受体介导有关。我们的结论是：脑缺氧时该酶活性的抑制是与下列途径有关：谷氨酸→NMDA受体→Ca2+→Ca2+靶酶。

适合猪圆环病毒2生长的PK15均质细胞株的构建

为筛选出PCV2培养滴度最高的PK15细胞克隆株,采用稀释法从PK15混合细胞中分离单细胞克隆株,获得的细胞克隆用于接毒试验,即用同步接种法将猪圆环病毒2(PCV2)病毒细胞混合液以1∶100的比例接种单克隆细胞,接毒后经PCR与定量PCR检测得出A10细胞克隆培养PCV2,获得的病毒含量最高。将A10细胞进行第2轮细胞克隆,之后用同步接种法和异步接种法将PCV2感染A10细胞,并检测A10细胞接毒后的PCV2 DNA含量,2种接毒方法获得的最高PCV2基因组的拷贝数分别为3.0×109、6.2×109/mL,高于用PK15混合细胞培养PCV2所获得的最高PCV2基因组拷贝数(107/mL)。综合以上结果,构建的PK15均质细胞克隆株比PK15混合细胞更适合PCV2的培养。

复方苦芩对感染猪传染性胃肠炎病毒的PK-15细胞中Bcl-2/BAXmRNA转录的影响

【目的】探讨中药复方苦芩对感染猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)的猪肾细胞(PK-15)中凋亡基因Bcl-2/BAX mRNA转录的影响。【方法】体外扩增TGEV,用TGEV感染PK-15细胞的模型进行体外试验研究,试验中设有复方苦芩组、空白组、模型组及黄芪多糖组,在测定了病毒半数感染细胞量(TCID50),复方苦芩及黄芪多糖药液对PK-15细胞的最大无毒浓度后,制作细胞爬片采用瑞士染色法染色观察PK-15细胞的形态变化;按试剂盒操作提取各试验组RNA并及时反转录为cDNA,采用实时荧光定量PCR法检测细胞中Bcl-2和BAX mRNA转录情况。【结果】与空白组相比,模型组的PK-15细胞发生了明显的细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),细胞变细长,细胞间成网状,细胞核着色较浅,出现核浓缩、固缩、碎裂等现象;与模型组比,复方苦芩组与黄芪多糖组细胞病变得到改善,而复方苦芩组效果更加明显,大部分细胞核结构清晰,染色质着色均一,少部分细胞核变大或碎裂;与空白组相比,模型组Bcl-2 mRNA转录量减少(P<0.01),复方苦芩组Bcl-2基因转录量增加,为模型组的1.403倍(P<0.01)、黄芪多糖组的1.078倍(P>0.05);与空白组相比,模型组BAX mRNA转录量明显升高,而其他3组BAX基因转录差异不明显(P>0.05),模型组BAX基因转录量为空白组的1.440倍、复方苦芩组1.290倍、黄芪多糖组的1.490倍,差异极显著(P<0.01),复方苦芩组、黄芪多糖组BAX基因转录量分别为空白组的1.116倍、0.966倍,差异不显著(P>0.05);与空白组相比,模型组Bcl-2/BAX mRNA转录比值降低,差异极显著(P<0.01);与模型组相比,复方苦芩组、黄芪多糖组Bcl-2/BAX mRNA转录比值均增加,分别为模型组1.809倍和1.940倍,差异极显著(P<0.01),复方苦芩组Bcl-2/BAX mRNA转录比值分别为空白组的0.749倍(P<0.01)、黄芪多糖组的0.933倍(P>0.05)。【结论】复方苦芩可通过上调PK-15细胞Bcl-2 mRNA转录,下调BAX mRNA的转录,从而抑制TGEV引起的PK-15细胞凋亡。

3种介导猪NR2F2基因转染PK15细胞方法的比较研究

试验旨在研究3种转染方法对猪肾上皮细胞(PK15)的转染效率,为以PK15细胞为模型研究外源基因的功能提供参考。本研究以PK15细胞为研究对象,用脂质体、电穿孔、慢病毒3种转染方法转染后,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,采用实时荧光定量PCR检测EGFP和NR2F2基因的表达情况,采用CCK-8检测细胞存活率,进而比较3种方法的转染效果。结果显示,转染PK15细胞后,电穿孔和慢病毒方法转染效率极显著高于脂质体(P<0.01),但电穿孔方法和慢病毒方法之间差异不显著(P>0.05);EGFP和NR2F2基因的实时荧光定量PCR结果显示慢病毒方法效果最好,脂质体方法较差,与细胞转染效率基本一致;CCK-8结果显示,电穿孔转染后细胞存活率最低,极显著低于对照组(P<0.01),脂质体方法显著低于对照组(P<0.05),慢病毒方法与对照组间差异不显著(P>0.05)。综合考虑转染效率及细胞活性,本研究认为慢病毒转染方法最适合转染PK15细胞,为今后高效转染PK15细胞提供了理想的方法。

PK-15细胞微载体悬浮培养及PCV2增殖工艺研究

研究表明,PCV2仅在PK15等少数哺乳动物细胞上增殖,但由于PCV2毒力弱,且不产生细胞病变,获得高滴度病毒难度较大[1]。因此,PCV2的培养滴度高低已成为制约现有疫苗质量的关键瓶颈之一。为建立在生物反应器内微载体逐级放大培养PK-15细胞和增殖PCV2技术,本研究以德国Sartorius14L生物反应器微载体悬浮培养PK-15细胞,对PK-15细胞初始接种密度、搅拌转速、微载体浓度、PCV2接毒时间、接毒剂量、收毒时间等工艺参数进行了摸索和优化[2-3]。结果表明:3g/L的微载体和60r/min的搅拌转速下,采用0.5×106cells/mL的初始接种密度操作工艺可获得最佳PK-15细胞生长效能。细胞生长后6h接毒,采用感染复数(MOI)为0.5的接毒比例,细胞接毒后在微载体上生长96h可获得最高的PCV2增殖滴度108.5TCID50/mL,利用该工艺,经过消化转移将PK-15细胞从14L反应器放大至42L反应器,微载体上细胞贴附均匀、生长旺盛,42L反应器中培养72h细胞密度可达39.0×105cells/mL,病毒滴度108.3TCID50/mL,应用生物反应器培养PCV2滴度较常规转瓶培养工艺提高了近10倍。进一步表明PCV2悬浮培养放大与接毒工艺稳定,为下一步实现工业级规模化生产奠定基础。

猪链球菌2型对PK-15细胞的黏附动力学

为研究携带不同毒力因子的猪链球菌2型对细胞侵袭作用的差异,本实验室从全国各地分离100多株猪链球菌,PCR鉴定出10株链球菌2型,其中携带毒力因子菌株为7-4[MRP+EF+]、8-3[MRP+EF-]、ZH-1[MRP-EF+],另外选择1株LN-2[MRP-EF-]与PK-15细胞进行黏附动力学试验,结果表明MPR毒力因子与菌株对PK-15细胞黏附具有密切相关性。

PCV-2感染对PK-15细胞抗病毒相关因子转录时相的影响

【目的】了解猪圆环病毒2型(PCV-2)感染对PK-15细胞抗病毒相关因子转录时相的影响,探讨宿主-病毒之间的作用关系。【方法】运用荧光定量PCR技术,测定和分析PCV-2感染PK-15细胞后0(未接种病毒),1,6,12,24,48,72 h时病毒DNA含量及细胞因子IFN-βI、FN-γI、FNAR-1I、FNAR-2、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、MX1、NOS、RNaseL和IRF-3 mRNA转录水平的变化。【结果】PCV-2感染PK-15后1 h就可以检测到病毒DNA,在感染后24 h病毒开始大量迅速增殖,于感染72 h时达到最高峰。与0 h相比,PCV-2感染后IFN-βI、RF-3的表达量在感染12 h时显著增加,其他时间表达量下降;IFN-γ、MHC-Ⅱ的表达量在感染12 h时增加不明显,其他时间表达量下降;感染PCV-2后IFNAR-2、MHC-Ⅰ、MX1的表达量下降;RNaseL的表达量在感染12 h时显著减少,其他时间表达量增加,48 h时表达量增加显著;IFNAR-1的表达量在感染72 h时显著增加,其他时间表达量下降;未检测出NOS的表达。【结论】随着PCV-2病毒含量的增加,以上几种主要抗病毒因子的表达量不明显或有所下降,表明PCV-2感染PK-15细胞后可逃避机体的抗病毒作用机制。

Ca^（2＋）／CaMPKⅡ与脑缺血兴奋毒性关系的研究

采用大鼠海马脑片体外缺血模型，观察了“缺血”或谷氨酸及氯胺酮对海马脑片Ｃａ￣（２＋）／ＣａＭＰＫⅡ活性的影响，同时观察了缺血对神经元胞外谷氨酸堆积的影响。结果如下：（１）Ｃａ￣（２＋）／ＣａＭＰＫⅡ活性随“缺血”时间的延长而逐渐下降，缺血１０，２０和３０ｍｉｎ，酶活性分别为对照组的６３％，４４％和２９％（１０ｍｉｎ，Ｐ＜０．００２；２０和３０ｍｍ，Ｐ＜０．００１），提示该酶对缺血非常敏感。（２）单纯过量外源性谷氨酸作用３０ｍｉｎ，能引起酶活性显著下降到仅为对照组的２４％，提示脑缺血时酶活性的抑制与兴奋毒性有关。（３）海马脑片在体外缺血３０ｍｉｎ时，谷氨酸在胞外的堆积增加２倍多（从１２８±２０升高到４３１±７４ｎｍｏｌ·ｍｇ￣（－１）ｐｒｏ·ｍｉｎ￣（－１），ｎ＝６）。（４）氯胺酮对“缺血”和单纯外源性谷氨酸所诱导的酶活性抑制均有明显的拮抗作用，但其拮抗作用显著不同，前者可使酶活性恢复至对照的６２％，后者高达９２％。说明脑缺血引起酶活性下降不仅与ＮＭＤＡ受体有关，而且与其它因素有关。

PCV-2感染对PK-15细胞IL mRNA转录水平的影响

【目的】观察猪圆环病毒2型(PCV-2)感染对猪肾传代细胞(PK-15细胞)炎性细胞因子白细胞介素(IL)mRNA转录水平的影响,探讨宿主与病毒之间的作用关系及细胞炎性反应机制。【方法】以未感染PCV-2的PK-15细胞为对照组,运用相对定量PCR技术,测定和分析PCV-2感染PK-15细胞后,PCV-2DNA相对含量的变化,以及炎性细胞因子IL-6、IL-8、IL-12p35、IL-12p40、IL-13、IL-17、IL-18mRNA转录水平在1,6,12,24,48,和72h的变化。【结果】PCV-2感染后,PK-15细胞的IL-6、IL-13、IL-17、IL-18的mRNA转录水平在12h显著增加,24h后mRNA转录水平下降;IL-8的mRNA转录水平在48h时最高,为对照组的2.5倍,但72h时恢复至与对照组水平相当;随着感染时间的延长,IL-12p35、IL-12p40的mRNA转录水平显著下降。【结论】PCV-2感染后可引起PK-15细胞中IL-6、IL-8、IL-13、IL-17、IL-18等细胞因子mRNA转录水平增加,而IL-12mRNA转录水平下降,提示PCV-2感染后引起的PK-15细胞炎性反应与其分泌的炎性细胞因子的改变有关。

白藜芦醇通过诱导ROS及活化AMPK促进Hep-2细胞自噬作用

目的探讨白藜芦醇通过诱导ROS及活化AMPK促进Hep-2细胞自噬的可能机制。方法采用40μM浓度白藜芦醇复合培养液作用于Hep-2细胞6h后,western blot分别分析蛋白水平,DCFH-DA染色法分析细胞内活性氧水平。结果白藜芦醇促Hep-2细胞自噬作用与其促活性氧增多有关,经白藜芦醇处理后,Hep-2细胞内活性氧增加约6倍,进一步研究发现,活性氧通过激活AMPK-mTOR途径而促进Hep-2细胞自噬。结论白藜芦醇诱导Hep-2细胞自噬的机制可能与通过活性氧激活AMPK-mTOR途径促进Hep-2细胞自噬有关。

DRB对人喉癌Hep-2细胞系中PK-CK2 mRNA表达的影响及其与细胞凋亡的关系

目的探讨5,6-二氯-1--βD-呋喃核糖苯并咪唑(DRB)对人喉癌Hep-2细胞系中蛋白激酶CK2(PK-CK2)mRNA表达的影响及其与细胞凋亡的关系。方法不同浓度的DRB作用于人喉癌Hep-2细胞后,采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Hep-2细胞PK-CK2 mRNA表达水平的变化,采用流式细胞术检测Hep-2细胞凋亡率的变化。结果随着DRB浓度的增加或作用时间的延长,Hep-2细胞PK-CK2 mRNA表达水平呈下降趋势,实验组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),流式细胞术检测二倍体峰前出现凋亡峰,5、10、20、40、80μmmol/L DRB与Hep-2细胞共育2h后的细胞凋亡率分别为0.68%、1.17%、7.25%、10.40%、22.66%。结论DRB可下调Hep-2细胞PK-CK2 mRNA表达水平,诱导细胞凋亡,这些可能是DRB抗癌作用的重要机制之一。

DNA-PKcs雌激素受体及c-erbB-2在乳腺癌中的表达及相互关系

目的探讨乳腺癌组织中DNA依赖蛋白激酶(DNA-PK)的催化亚单位DNA-PKcs的表达变化与雌激素受体(ER)及癌基因c-erbB-2的表达是否具有相关性.方法采用免疫组化SP法检测120例乳腺癌组织中DNA-PKcs的表达情况,同时检测这些组织中的ER及癌基因c-erbB-2的表达.结果DNA-PKcs的表达在ER阳性组明显高于ER阴性组,在c-erbB-2阳性组的表达明显低于c-erbB-2阴性组,差异均有统计学意义(P<0.01).结论DNA-PKcs在乳腺癌组织中的表达与雌激素受体(ER)及癌基因c-erbB-2的表达具有密切相关性,研究与乳腺癌的预后有一定相关性.

可溶性和颗粒性Ca^（2＋）／CaM PKⅡ对脑缺血与再灌注敏感程度差异性的研究

研究了蒙古沙土鼠脑缺血和再灌注时１０００００×ｇ离心的大脑皮质可溶性和颗粒性Ｃａ（２＋）／ＣａＭＰＫⅡ活性变化的规律性及差异性。实验结果为：（１）随着脑缺血时间的增加，两部分酶活性均逐渐降低，但可溶性酶活性比颗粒性酶活性下降得更快。（２）随着脑缺血后再灌注时间的延长，两部分酶活性均逐渐升高，但可溶性酶活性比颗粒性酶活性上升得更快。结果表明，可溶性酶比颗粒性酶对脑缺血与再灌注更敏感，该酶活性的变化反映了脑缺血的状态，是脑缺血的重要生物化学指标，可用以研究缺血性脑损伤机制和治疗。

敲除RIG-I基因的PK-15细胞系的建立及RIG-I对猪圆环病毒2型感染的作用

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建敲除RIG-I基因的PK-15细胞,初步探究视黄酸诱导基因I(retinoic acid-inducible gene-I,RIG-I)对猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染的作用。本研究根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计了针对猪RIG-I基因的2条sgRNA,构建重组载体pUC19-RIG-I-sgRNA1和pUC19-RIG-I-sgRNA2,转染PK-15细胞,通过流式细胞仪分选单细胞、测序、Western blot检测RIG-I敲除情况。PCV2感染细胞后,通过荧光定量PCR分析RIG-I及其下游分子mRNA水平,IPMA方法及TaqMan定量PCR检测病毒增殖水平。结果显示,筛选出的1株RIG-I基因缺失37 bp的PK-15细胞,Western blot检测RIG-I蛋白不表达。PCV2感染正常PK-15细胞48 h和72 h后,RIG-I mRNA水平上调,表明PCV2可激活RIG-I。敲除RIG-I基因,可下调MAVS、STING、IRF3、IFN-β的mRNA水平,抑制PCV2在PK-15细胞中复制,初步表明RIG-I信号通路促进PCV2在PK-15细胞中复制。本研究为PCV2感染的天然免疫机制研究提供了良好的细胞模型。