Detection and Comparison of Structure and Function of Wild-type Pneumolysin and Its Novel Mutant PIyM2

Here is reported a novel pneumolysin（Ply） mutant（PlyM2） that addresses a long-standing problem for vaccine development in this field： detoxification of Ply in the premise of retaining antigenic integrity. Structure and function of wild-type Ply（PIyWT） and PIyM2 mutants were detected and compared. Their structures were not signi- ficantly different according to the analysis by thermal-dependent fluorescence spectroscopy and circular dichroism spectroscopy. PlyM2 was confirmed to have lost hemolytic activity and yet could induce neutralizing antibodies to prevent in vitro hemolysis by PIyWT and Streptococcus pneumoniae（S, pneumoniae）. These results give support to PIyM2 to be a new protein antigen for inclusion in the development of an effective pneumocoecal multiprotein vaccine.

肺炎链球菌溶血素的体外表达及活性鉴定

目的体外扩增肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)的溶血素(pneumolysin,ply)基因,在大肠杆菌中高效表达,并验证其生物活性。方法分离培养D39型肺炎链球菌并提取其基因组DNA,采用PCR技术体外扩增ply基因,体外重组将ply序列克隆到原核表达载体pET28(a)内,测序鉴定后将重组子转化到E.coliRosetta(DE3)中,经IPTG诱导大量表达融合6个组氨酸标签的Ply重组蛋白,经Ni-NTA树脂纯化后,获得的重组蛋白经SDS-PAGE鉴定后检测其溶血活性和细胞毒性。结果克隆的ply序列与GenBank中的数据相符,并实现了Ply蛋白的可溶表达。所获重组蛋白纯度达到95%。溶血实验显示Ply对人红细胞具有极高的溶血活性,与对照组相比较差异有统计学意义(P<0.05),并呈剂量依赖。细胞毒实验显示Ply对脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)细胞具有明显抑制作用,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),并呈剂量与时间依赖性,IC50(24h)为1.525μg/ml。结论经测序鉴定ply基因正确扩增,并成功表达、纯化出具有高溶血活性和细胞毒性的Ply蛋白。

肺炎链球菌溶血素对感染性肺炎的诊断价值

目的利用原核表达技术获得肺炎链球菌溶血素(PLY)重组蛋白,探讨其对肺炎链球菌感染性肺炎的血清学诊断价值。方法根据Gen Bank中肺炎链球菌ply基因序列,切除羧基端33个核苷酸,设计合成特异性引物,从标准菌株的肺炎链球菌中提取DNA为模板,扩增目的基因ply,克隆后构建原核表达载体PET32a-ply,然后将其转化到大肠埃希菌DH5a BL21(DE3)中,以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导其大量表达,获得融合6个组氨酸标签、无溶血活性的重组蛋白,经Ni-NTA树脂纯化,获得重组蛋白,经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定后,采用免疫印迹法检测其免疫原性;以重组蛋白PLY为抗原,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测临床诊断为社区获得性肺炎(CAP)并经细菌学确诊的患者血清中相应的Ig M抗体,评价其对肺炎链球菌感染性肺炎的快速诊断价值。结果成功构建出原核表达载体PET32a-ply,并实现了无溶血活性的PLY蛋白的可溶性表达,其具有较好的免疫原性。CAP患者血清抗PLY-Ig M抗体阳性率高于体检健康者(P<0.05),其诊断的敏感性均高于常规的痰培养和血培养(P<0.05)。结论以重组蛋白PLY为抗原的ELISA可用于肺炎链球菌感染的血清学快速诊断,在临床上具有重要的应用价值。

肺炎链球菌自溶素和溶血素基因的PCR法鉴定

肺炎链球菌是一种致病率和致死率很高的病原菌 ,若无丰富临床检测经验从临床标准中分离鉴定此菌较困难 ,本实验以寡核苷酸引物YH1 YH2、YH7 YH8分别扩增肺炎链球菌自溶素和溶血素基因的 35 4bp和 30 7bp的DNA片段 ,通过改变各种反应条件 ,建立了这两种病原因子基因的PCR检测方法。用此方法对 2 0株肺炎链球菌标准菌株及 7株对照菌株进行了鉴定 ;其扩增产物分别经限制性内切酶TthHB81和和AccI进行酶切以确认扩增产物是否正确 ;用酚 氯仿抽提纯化的全细胞DNA对PCR方法的检测灵敏度进行了测定 ;并利用此方法对 2 8份临床标本分离物进行了鉴定。结果 所有 2 0株肺炎链球菌均可分别用引物YH1 YH2、YH7 YH8扩增出 35 4bp和 30 7bp的DNA片段 ,而对照菌株均呈阴性 ;自溶素及溶血素基因的扩增产物分别经限制性内切酶TthHB81和AccI消化后产生的片段和预期的完全一致 ;两对产物均可从 10fg的全细胞DNA中扩增出目的DNA片段。所建立的两套PCR系统对 2 8份临床标本分离物进行鉴定 ,其中PCR阳性的 15份分离物经生化学特性检查被鉴定为肺炎链球菌。本试验所建立的两套PCR检测系统具有特异性强 ,灵敏度高及操作简单等优点 ,均可用于肺炎链球菌的鉴定。

肺炎链球菌溶血素诱导THP-1细胞凋亡涉及MAPK1/3信号途径

目的探讨肺炎链球菌溶血素(pneumolysin,Ply)对人急性单核细胞白血病单核细胞株THP-1细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用及机制。方法 MTT法检测Ply对THP-1细胞的增殖抑制。瑞氏染色观察Ply对人THP-1细胞形态的影响。AnnexinV-FITC/PI双标法检测细胞凋亡。琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞DNA片段化现象。免疫组化和Western blot检测MAPK1/3蛋白表达的变化。结果将人THP-1细胞分别与0.05、0.1、0.5、1、2.5、5μg/ml Ply共同孵育后,在24、48、72、96 h用MTT法检测细胞增殖抑制率,发现Ply对人THP-1细胞具有明显的增殖抑制作用,并且呈剂量和时间依赖性,IC50(24 h)为1.31μg/ml;0.05μg/ml和0.1μg/ml Ply分别处理THP-1细胞12 h后,通过瑞氏染色法观察人THP-1细胞可见凋亡小体及核碎裂象等典型的凋亡形态学改变;用0.05μg/ml Ply和0.1μg/ml Ply作用THP-1细胞12 h后细胞早期凋亡率分别为11.83%和48.45%(P<0.05);提取凋亡THP-1细胞DNA,进行琼脂糖凝胶电泳可见典型的"梯状"条带;Ply作用于人THP-1细胞后,胞内MAPK1/3蛋白表达降低(P<0.05)。结论 Ply可诱导人THP-1细胞凋亡,此作用涉及MAPK1/3信号通路的参与。

肺炎球菌溶血素溶血活性致大鼠脑损伤机制研究

目的溶血活性是肺炎球菌溶血素(pneumolysin,PLY)的重要生物学特性之一。运用不同溶血活性的PLY建立脑损伤模型,探讨溶血活性对PLY致大鼠脑损伤的作用机制。方法 4周龄大鼠,经左侧颈内动脉注入等剂量溶血活性缺失的PLY[PLY(-)]及溶血活性正常的PLY[PLY(+)],观察脑组织神经损伤情况及炎症因子水平。结果 PLY(+)组脑组织神经元烯醇化酶(Neuron-specific enolase,NSE)[(122.495±4.852)%]及胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)水平[(135.697±2.727)%]较PLY(-)组及等渗盐水(NS)对照组[(80.467±2.460)%,(89.622±3.226)%]均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),PLY(-)组NSE[光度值(102.081±2.150)%]及GFAP水平[光度值(96.323±4.113)%]也高于对照组(NSE光度值80.467±2.460,GFAP光度值89.622±3.226),差异有统计学意义(P<0.05);PLY(+)组TNF-α及IL-6水平[(103.902±3.221)、(52.030±1.817)ng/mL]较PLY(-)组[(94.152±3.032)、(41.628±2.972)ng/mL]及NS对照组[(69.986±3.567)、(21.246±3.118)ng/mL]均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),PLY(-)组TNF-α[(94.152±3.032)ng/mL]及IL-6水平[(41.628±2.972)ng/mL]也较NS对照组[(69.986±3.567)ng/mL,(21.246±3.118)ng/mL]明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论溶血活性在肺炎链球菌造成脑损伤过程中具有重要作用,并且一定程度上可促进炎性因子释放。

肺炎球菌溶血素的纯化及其免疫效果

目的从6B、9V、14、19F型肺炎球菌培养物中纯化肺炎球菌溶血素(PLY),并检测其免疫原性和保护作用。方法采用自溶、硫酸铵沉淀及三步柱层析法纯化PLY,并检测PLY免疫NIH小鼠后血清抗体滴度及其保护效果。结果纯化的6B、9V、14、19F型PLY纯度依次为83.4%、99.2%、70.1%和76.6%;9V型PLY表观相对分子质量为52840,与文献报道的53000相一致。从4种血清型肺炎球菌中纯化的PLY均能诱导小鼠产生高且稳定持久的抗体滴度。各免疫组小鼠分别感染6B、9V、14、19F型肺炎球菌,存活率均显著高于对照组。结论4种血清型PLY均具有良好的免疫原性和保护作用。

野生型肺炎链球菌溶血素通过PI3K-I/Akt/mTOR途径诱导A549细胞自噬

目的:研究肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,Sp)诱导人肺上皮细胞自噬发生的现象及其机制。方法:常规培养人肺上皮A549细胞与野生型Sp;将GFP-LC3真核载体转染A549细胞,分为实验组(Sp,MOI=30∶1)、阴性对照组[渥曼青霉素(wortmannin,WT),2μmol/L 2 h,自噬抑制剂]、阳性对照组[雷帕霉素(rapamycin,Rapa),1 mmol/L 10 h,mTOR抑制剂]和参照组(WT和Sp共同处理),各组处理时间均为1、2、3和4 h;荧光显微镜观察各组自噬点形成,透射电镜观察各组细胞自噬体结构,Western blot检测各组微管相关蛋白轻链-Ⅰ/Ⅱ(microtuble-associated protein light chain 3-Ⅰ/Ⅱ,LC3-Ⅰ/Ⅱ)、磷酸化UNC-51-K激酶1(phosphorylated UNC-51-like kinase1,P-ULK1)和螯体1(sequestosome 1,P62)的表达;将溶血素表达载体RFP-PLY(red fluorescent protein-pneumolysin)、GFP-LC3或(和)RFP-PLY转染/共转染A549细胞,Western blot检测各组磷酸肌醇3-激酶-Ⅰ/Ⅲ(phosphoinositide 3-kinase-Ⅰ/Ⅲ,PI3K-Ⅰ/Ⅲ)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、Beclin-1蛋白(Beclin 1 protein,Beclin-1)和哺乳动物雷帕霉素靶(mammalian target of rapamycin,mTOR)的表达。结果:处理A549细胞3 h后,与阴性对照组(WT)相比,Sp感染后,自噬点明显增多(t=41.313,P=0.001),电镜观察到典型的自噬体结构,LC3-Ⅱ蛋白表达明显上调(t=121.592,P=0.000);A549细胞转染RFP-PLY处理3 h后,与阴性对照组(WT)相比,Sp感染同样观察到明显的自噬现象,PI3K-I、Akt蛋白和mTOR表达下调(tPI3K-I=16.544,PPI3K-I=0.004;tAkt=22.679,PAkt=0.002;tmTOR=19.503,PmTOR=0.003),而PI3K-Ⅲ和Beclin-1水平无明显差异(tPI3K-Ⅲ=3.572,PPI3K-Ⅲ=0.070;tBeclin-1=0.799,PBeclin-1=0.508)。结论:野生型Sp诱导A549细胞自噬可能通过PI3K-I/Akt/mTOR信号途径。

肺炎链球菌融合蛋白疫苗研究进展

肺炎链球菌是一种对人类健康危害较大的条件致病菌,目前其疫苗研究已取得了巨大突破,但既往研究主要集中在荚膜多糖疫苗上,存在诸多局限性。近年来,随着生物学技术及基因工程技术的飞速发展,由肺炎链球菌毒力因子及表面蛋白制作的蛋白疫苗研发迅速。其中,将肺炎链球菌不同的表面蛋白质作为免疫原组分构建的融合蛋白疫苗,极大地增强了疫苗的免疫原性,且已取得一定的试验效果,未来进一步研究将有望取代荚膜多糖疫苗。

肺炎球菌荚膜多糖和溶血素结合疫苗的制备及其免疫原性的研究

目的研制肺炎球菌荚膜多糖(PS)与肺炎球菌溶血素(蛋白)偶联结合疫苗。方法用PCR扩增肺炎球菌溶血素(Pn)基因,将其克隆入表达载体pET-28a质粒中,然后转化大肠杆菌JM109(DE3)宿主细胞,并以IPTG诱导进行蛋白质表达,对所得蛋白质用固相Ni-NTA树脂作纯化,再用SDS-PAGE鉴定表达的纯化蛋白(rPn)。以福尔马林脱毒rPn,去除其溶血活性,然后用氨基还原法将脱毒的rPn与PS(19F血清型)偶联结合,加入铝佐剂制备成疫苗。以该疫苗腹腔注射接种小鼠,用ELISA法检测小鼠血清中抗PS及抗Pn的抗体水平。结果成功扩增和克隆了Pn基因,经诱导表达得到rPn蛋白,纯化后纯度达90％以上。PS与Pn结合物经凝胶层析柱分离,其洗脱峰较PS与Pn二峰明显前移。用该结合疫苗免疫的小鼠血清中抗PS(19F)抗体及抗Pn抗体的效价均明显高于阴性对照组(P＜0．01)。结论用基因工程技术制备的肺炎球菌溶血素作为蛋白载体,脱毒后与肺炎球菌多糖偶联而成的结合疫苗能在小鼠体内诱导出明显的免疫应答反应。

肺炎链球菌溶血素致脑损伤中细胞凋亡及凋亡诱导因子的变化及意义

目的探讨肺炎链球菌溶血素（PLY）致感染性脑损伤中细胞凋亡及凋亡诱导因子（AIF）的表达及意义。方法SD大鼠80只按随机数字表法分为PLY组颈内动脉注射0．2mL（7μg）PLY]和生理盐水（NS）组（颈内动脉注射等体积NS），每组40只。每组按观察时间点分为6h、12h、24h、48h4个亚组，每亚组10只，其中5只注射EB，甲酰胺法测定脑组织EB含量判断血脑屏障（BBB）的破坏程度。5只不注射EB，取脑组织切片，应用免疫组化和TUNEL染色分别检测脑组织神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、AIF蛋白含量和细胞凋亡。结果与NS组比较，造模后各时间点PLY组大鼠脑组织EB、NSE、GFAP、AIF蛋白含量均较高。细胞凋亡较多，差异均有统计学意义（P〈0．05）；PLY组大鼠脑组织凋亡细胞数与AIF蛋白的表达呈正相关关系（r=0．959，P=0．000）。结论细胞凋亡参与了PLY诱导的脑损伤的发展过程，A1F可能介导了神经细胞的凋亡。

褪黑素对肺炎链球菌溶血素致大鼠脑损伤细胞凋亡的影响

目的探讨褪黑素(MT)对肺炎链球菌溶血素(PLY)致脑损伤细胞凋亡的影响。方法幼鼠84只随机分成3组:9 g.L-1盐水组(NS组)28只,颈内动脉注射9 g.L-1盐水;PLY组28只,颈内动脉注射0.2 mL(7μg)PLY;MT组28只,腹腔注射(1 g.L-1)MT 10 mg.kg-1,15 min后颈内动脉注射0.2 mL(7μg)PLY。每组按照注射后不同的时间点(24 h、48 h)分为2个亚组。预定时间点处死动物,制备脑组织标本。干湿质量法测定其脑组织含水量(BWC),甲酰胺法测定伊文思兰(EB)水平,免疫组织化学技术测定凋亡诱导因子(AIF)表达,原位末端标记法检测细胞凋亡。结果 HE染色光镜下可见PLY组血管间隙增宽,大脑皮质炎性细胞浸润,胶质细胞和神经元细胞有不同程度肿胀、空泡变性。NS组无上述病理变化。MT组大鼠脑组织改变较PLY组轻。PLY组各时间点脑组织BWC水平、EB水平、AIF水平明显增加,24 h高于48 h,差异有统计学意义。PLY组各时间点凋亡细胞数明显增加,48 h高于24 h,差异有统计学意义。各时间点PLY组与对照组比较均有统计学差异。予以MT干扰后各时间点脑组织各指标以及凋亡细胞数均降低,与PLY组比较,差异有统计学意义。结论 MT能够降低AIF表达,减少神经细胞凋亡,保护脑组织。

一种减毒肺炎链球菌溶血素突变体的构建与表达

目的使用重叠PCR方法构建构建△Al46Ply突变体，原核可溶性表达△Al46Ply蛋白，并明确其毒力变化情况；分析肺炎链球菌溶血素（pneumolysin，Ply）在不同血清型肺炎链球菌（streptococcus pneumoniae，SPN）中的表达情况。方法以SPND39型基因组DNA为模板设计合成构建突变体pry基因所需引物；利用重叠PCR方法扩增合成△Al46ply突变体。通过溶血实验分析其溶血活性，利用中和试验验证△A146Ply诱导产生的特异性抗体中和野生Ply毒素溶血能力，并利用Western印迹检测5株不同血清型肺炎链球菌流行菌株中Ply蛋白表达情况。结果突变体基因测序结果显示，Plyl46位密码子GCT3个碱基被缺失，△Al46ply突变体构建成功，并实现了△Al46Ply的可溶性表达，得到纯度〉90％的重组蛋白。△A146Ply蛋白浓度为100000ng／ml亦未表现出溶血活性。△Al46Ply蛋白诱导产生的特异性抗体能够中和野生Ply毒素的溶血活性。Western印迹结果显示，△Al46Ply诱导产生的多克隆抗体可与国内临床常见4株肺炎链球菌有交叉反应。结论△Al46Ply蛋白是一种安全的肺炎链球菌疫苗候选分子，可刺激机体产生具有中和作用的特异性抗体。

肺炎链球菌蛋白PLYd和PsaA的制备与鉴定

目的:对2种肺炎链球菌蛋白肺炎链球菌脱毒溶血素(detoxified pneumolysin,PLYd)和肺炎链球菌表面黏附素(pneumococcal surface adhesin A,Psa A)进行全基因合成、重组表达、制备和鉴定。方法:根据Gen Bank中PLYd,Psa A的基因序列和氨基酸序列,通过密码子优化和全基因合成的方式获得2种蛋白的基因,在PLY基因中引入多位点突变保证表达的蛋白无毒性,构建无标签、高效重组表达菌株,建立2种重组蛋白的纯化制备方法,并进行抗原鉴定及免疫原性检测。结果:人工合成的PLYd,Psa A基因序列经鉴定与预期一致。2种蛋白在大肠杆菌中均获得了高效表达,表达量在40%以上,经2步纯化其纯度均达到95%。2种蛋白均能与阳性血清产生特异性抗原抗体反应,免疫小鼠后均可诱导产生较高水平的蛋白特异性抗体。结论:成功制备2种无标签肺炎链球菌蛋白PLYd,Psa A,且具备与天然抗原相似的抗原性和免疫原性,为开展应用研究奠定基础。

肺炎链球菌溶血素致大鼠脑损伤模型髓样细胞触发受体1的动态变化及意义

目的 探讨髓样细胞触发受体1（TREM-1）在肺炎链球菌溶血素（PLY）致大鼠脑损伤中的动态变化及意义.方法 将64只SD大鼠按简单随机法均等分为PLY组和对照组,分别经左侧颈内动脉注射0.1mL PLY和等体积灭菌9g/L盐水;观察注射后4h、6h、12 h和24 h不同时间点脑组织大体和组织学变化,并应用免疫组织化学法检测脑组织中神经细胞损伤标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和神经元特异性烯醇化酶（NSE）蛋白表达水平,同时应用酶联免疫吸附法检测TREM-1、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及白细胞介素6（IL-6）表达水平.结果 PLY组脑组织大体和组织学结果提示大鼠脑损伤存在,且脑组织中GFAP和NSE蛋白表达及TNF-α和IL-6表达在4h开始增加,随注射时间点推移,其表达水平动态增加,与相应时间点对照组相比,差异均有统计学意义（P均＜0.05）.PLY组脑组织TREM-1蛋白表达在4h明显增加,在6h有所下降,但仍高于对照组,差异均有统计学意义（P均＜0.05）,12 h与24 h TREM-1蛋白表达水平明显下降,与对照组相比差异无统计学意义（P均＞0.05）.结论 TREM-1蛋白表达在PLY诱发的大鼠脑损伤早期明显上调,可能通过促进炎性因子TNF-α和IL-6的表达而参与脑损伤的病理发展过程.

肺炎链球菌ply基因缺陷菌株的构建及毒力变化的初步研究

目的 构建肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae,Sp）溶血素基因（pneumolysin,ply）缺陷菌株,并对其毒力作初步研究,为进一步探索宿主对溶血素的防御应答奠定基础.方法 采用长臂同源多聚酶链反应（LFH-PCR）技术将ply基因替换为红霉素耐药基因（erm）后同源重组于肺炎链球菌,在含红霉素的血平板上筛选出ply缺陷菌株.用PCR鉴定缺陷菌株,观察体外缺陷菌株生长情况,并在小鼠体内感染模型研究其毒力侵袭变化.结果 PCR结果显示ply基因完全被erm基因所替代,构建ply缺陷菌成功 单个菌落培养基生长情况表明ply基因缺陷并未对细菌的体外生长造成影响 但在小鼠鼻腔感染模型中,缺陷菌株入血时间（6 h）明显晚于野生菌株（2 h）,且各时间点的菌量均显著低于野生菌株,两者比较差异有统计学意义（P＜0.01） 小鼠腹膜感染模型显示野生菌株半数致死时间为3 d,而缺陷菌株半数致死时间为18d,两者比较差异有统计学意义（P＜0.01）.结论 采用LFH-PCR技术作基因突变完全替代ply基因,方法简便快捷 ply的缺陷不影响细菌在体外的生长,但可显著降低细菌在宿主体内的毒力和侵袭.

溶血素的定点突变及与表面蛋白A的表达

目的利用基因定点突变技术扩增Ply突变基因△Ply,基因重组技术构建△Ply与PspA基因的串联融合表达蛋白PspA-△Ply。方法根据肺炎链球菌TIGR4型表面蛋白A和溶血素基因序列设计引物,定点突变法扩增Ply突变基因,PCR法扩增PspA基因。运用基因重组技术构建pET32a-PspA-△Ply表达载体,双酶切与测序验证重组质粒;重组质粒转化入大肠埃希菌BL21(DE3),经不同时间、不同温度、不同浓度IPTG诱导表达融合蛋白,Western免疫印迹鉴定表达产物。结果 Ply突变基因测序证实ply基因的△A146R147碱基成功突变,双酶切与测序证实pET32a-PspA-△Ply构建正确,Western免疫印迹见重组质粒转化菌在120×103现特异性条带。结论成功实现Ply基因的定点突变,构建PspA-△Ply融合蛋白表达载体,为研究新型抗肺炎链球菌蛋白疫苗奠定基础。

肺炎链球菌核酸疫苗在恒河猴体内的免疫原性研究

目的研究肺炎链球菌溶血素（pneumolysin，PN）核酸疫苗在恒河猴体内的免疫原性。方法将肺炎链球菌溶血素全长基因和切去羧基端33个核苷酸的基因分别插入到质粒pVAX1载体中，构建成Ppn和Ppnd两种核酸疫苗。采用体内电转染初免结合相应蛋白质抗原加强的策略免疫恒河猴。结果切去肺炎链球菌溶血素基因羧基端33个核苷酸，表达的重组截短溶血素蛋白保留了抗原性但去除了溶血活性，从而保证了疫苗的安全性。给恒河猴肌肉内注射500μg核酸疫苗加电转染能诱导出特异性抗体免疫应答，用相应蛋白质加强免疫后血清抗体几何平均滴度提高了约4倍。结论采用电转染技术结合蛋白质加强免疫的策略，能增强肺炎链球菌溶血素核酸疫苗在恒河猴体内的特异性抗体水平。

肺炎链球菌溶血素致幼鼠感染性脑损伤动物模型的建立

目的探讨经颈内动脉注射肺炎链球菌溶血素（PLY）建立感染性脑损伤动物模型的方法和可行性。方法采用颈内动脉注射PLY制作幼年大鼠感染性脑损伤动物模型。选取健康普通级1月龄SD大鼠160只,体质量100~120 g,雌雄不限,随机分为PLY组和对照组,其中PLY组（实验组）80只,颈内动脉注射PLY0.2 mL（7μg）;对照组80只,颈内动脉注射等体积9 g.L-1盐水。根据不同观察时间点（注射后6 h、12 h、24 h及48 h）,将PLY组SD大鼠分为4个亚组,每个亚组中分别有10只注射伊文思蓝（EB）,测定不同时间点脑组织EB水平;注射EB组经右颈外静脉近心端注入20 g.L-1EB（2 mL.kg-1）,推注时间1~2 min。各组处理后,待观察至相应时间点,将大鼠麻醉行心脏灌注后断头取脑,用于制作脑组织标本,以备观察。采用干湿质量法检测其脑组织含水量（BWC）,甲酰胺法测定其脑组织EB水平,利用免疫组织化学法检测其脑组织神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。结果与对照组相比,HE染色光镜下观察,PLY组脑组织可见血管扩张、血管周围间隙增宽、炎细胞浸润、神经元空泡变性、星形胶质细胞体积增大肿胀、细胞核固缩等改变。各时间点PLY组BWC、EB水平、NSE及GFAP表达量均明显高于对照组,差异均有统计学意义（Pa〈0.01）。结论经幼鼠颈内动脉注射PLY可以成功建立幼鼠感染性脑损伤模型。

肺炎链球菌溶血素的研究进展

肺炎链球菌溶血素(Pneumolysin,PLY)是肺炎链球菌的一种重要毒力因子,包含4个结构域,是胆固醇依赖性细胞溶血素(CDCs)的家族成员之一。PLY可广泛作用于宿主组织细胞,发挥细胞毒性作用。PLY可活化补体经典途径,诱导巨噬细胞和单核细胞等产生细胞因子,介导机体免疫应答过程。PLY是肺炎链球菌蛋白疫苗和相关小分子药物研制的重要靶标。本文就PLY的结构、功能及相关疫苗的最新研究进展进行综述。