家蚕微孢子虫极管蛋白1(NbPTP1)的基因克隆及原核表达

极管作为微孢子虫高度特异的结构,在微孢子虫侵染宿主细胞的过程中扮演重要角色。利用家蚕微孢子虫和兔脑炎微孢子虫基因组数据,通过共线性分析获得一个编码家蚕微孢子虫假定极管蛋白的基因NBO_7g0016。序列特征分析表明该基因编码富含脯氨酸的409个氨基酸,预测蛋白质分子质量39.6 kD,蛋白质序列的N端具有信号肽,有40个潜在的O-糖基化位点和17个磷酸化位点。以家蚕微孢子虫基因组DNA为模板克隆NBO_7g0016基因,并构建插入该基因的重组质粒,转化E.coli BL21(DE3)进行原核表达,融合蛋白经亲和层析纯化后免疫昆明小鼠制备多克隆抗体。免疫印迹实验证明该基因编码的蛋白质在成熟孢子中有表达,间接免疫荧光实验将蛋白质定位于家蚕微孢子虫的极管,确证该蛋白质为家蚕微孢子虫极管蛋白1(NbPTP1,GenBank登录号:EOB15198.1)。初步推测家蚕微孢子虫极管蛋白1具有糖基化修饰特征。

蓝狐脑炎原虫病的诊断与鉴定

某养殖场幼龄蓝狐(Alopex lagopus)不同程度脱水、生长停滞,剖检可见肾脏苍白肿大。取肾脏、脑组织研磨,差速离心后染色检测到典型脑炎原虫形态,大小1~2μm。肾脏石蜡切片经革兰染色、改良马松三色染色观察到大量染色虫体。肾脏研磨液提取基因组DNA,根据NCBI的脑炎原虫(Encephalitozoon cuniculi,E.cuniculi)基因组设计2对特异性引物,分别扩增脑炎原虫核糖体DNA内转录间隔区1(ITS1)和极管蛋白1(PTP1)的基因片段。PCR结果显示,引物ITS1和PTP1分别扩增出762 bp和1 071 bp的片段,两片段序列与脑炎原虫相应序列的相似性均为99.7%。对ITS1基因序列进行分析,鉴定为脑炎原虫基因Ⅲ型。此外,PTP1基因的系统进化树分析了该菌株(称为JL-1),与2014年辽宁LN-1株、2001年美国CDC. V282株关系最近。

家蚕微孢子虫极管蛋白1(NbPTP1)在果蝇S2细胞中的表达与糖基化修饰

极管蛋白(Polar tube protein)是极管的主要成分,能特异性定位于微孢子虫极管,在微孢子虫侵染宿主过程中发挥重要作用。文中分析了家蚕微孢子虫极管蛋白1中潜在的O-、N-糖基化修饰位点,克隆了家蚕微孢子虫极管蛋白1全基因序列,并将其插入带有V5和His标签的真核表达载体pMT/Bip/V5-His A中,成功构建了pMT/Bip/V5-His A-NbPTP1重组质粒,经转染果蝇S2细胞后,发现NbPTP1基因能在果蝇细胞中高效表达。此外,Lectin blotting和β-消除反应分析结果表明:果蝇S2细胞内表达的NbPTP1具有O-糖基化修饰特征。以上结果为研究NbPTP1的糖基化修饰特征与其功能之间的关系提供了基础,有助于揭示微孢子虫侵染机制,建立可行有效的微孢子虫病诊断和防治措施。