小麦返白系返白期间Poly(A)RNA与蛋白质水平的变化

比较了小麦返白系与其原始品种矮变1号在返白期间Poly(A)RNA与蛋白质水平的变化。在心叶变白过程中。返白系的蛋白质含量下降,随着复绿又回升;而RNA含量变化与此大致呈平行关系。在全白阶段,返白系的Poly(A)RNA含量大幅度下降。体外合成的蛋白质也少得多,但其翻译活性/Poly(A)RNA及各期的蛋白质/Poly(A)RNA比例并不比对照低。可能返白系在返白期间蛋白质水平的变化与转录水平的基因调控有关。

微小RNA miR-199a／a^＊模拟物转染肝癌细胞HepG2中Met原癌基因的表达

目的探讨在肝癌细胞系HepG2中,Met是否为miR-199a/a*的靶基因。方法将miR-199a/a*的模拟物及阴性对照物分别转染至HepG2细胞中,转染后48 h及72 h分别提取RNA及蛋白行RT-PCR及Western Blot检测Met的表达。结果与阴性对照相比,转染Up-miR-199a*组的Met mRNA(P<0.05)和蛋白(P<0.001)表达水平均显著下调;而Up-miR-199a组与阴性对照组相比无统计学差异。结论肝癌细胞HepG2中miR-199a*负调控Met的mRNA及蛋白表达。

猪垂体Poly（A）~＋RNA的制备及其体外翻译

本文用ＬｉＣｌ沉淀法提取了猪垂体总ＲＮＡ，经。ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）－ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ柱亲和层析，分离纯化了猪垂体Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ．用自制的兔网织红细胞体外翻译体系鉴定，表明该Ｐｏｌｙ／（Ａ）＋ＲＮＡ具有较高的翻译活性．ＳＤＳ－ＰＡＯＥ，放射自显影分析翻译产物提示，在制各的猪垂体Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ中，编码猪生长激素前体的ｍＲＮＡ占有较高的比例．

土壤原核微生物RNA加Poly(A)尾的方法研究

采取共提取法提取土壤微生物总RNA后,经过去DNA、过柱纯化等手段,利用Poly(A)聚合酶在纯化RNA末端添加Poly(A)尾,将产物逆转录成c DNA第一链,用细菌16S r DNA引物和nos Z(氧化亚氮还原酶基因)引物扩增目的片段。结果表明:利用此方法能够获得带有Poly(A)尾的土壤原核微生物核糖体RNA和m RNA,产物经过一次转录后,可用于扩增土壤微生物目的基因。此方法相对于利用目的基因特异下游引物来作为逆转录引物获得c DNA更加方便,用于研究土壤原核微生物多个基因的表达特征时,此方法十分实用。

Poly(I:C)模拟RNA病毒在气道炎症研究中的应用

目的使用poly(I:C)模拟RNA病毒感染,建立一个安全有效的病毒感染模型,探讨病毒诱发气道的炎症。方法BALB/c小鼠随机分为对照组和poly(I:C)组,poly(I:C)组连续3d应用poly(I:C)滴鼻后,连续5d观测小鼠肺泡灌洗液(BALF)细胞学改变,ELISA测定IFN-γ浓度,同时观察小鼠肺病理改变。结果对照组小鼠BALF中中性粒细胞数和IFN-γ浓度分别为(1.53±0.06)×106/L和(7.11±1.11)ng/L。自Poly(I:C)滴鼻后第1天起,小鼠BALF中性粒细胞数和IFN-γ浓度开始升高,分别为(2.00±0.12)×106/L和(8.01±1.79)ng/L,肺间质内出现炎症细胞。这些变化在滴鼻后的第3天达到高峰,BALF中性粒细胞数和IFN-γ浓度分别为(4.30±0.32)×106/L和(13.51±1.40)ng/L,大量炎症细胞聚集在肺间质,随后炎症变化开始下降。对照组和poly(I:C)刺激组的BALF中淋巴细胞数均为(2.10±0.11)×106/L。结论Poly(I:C)可以模拟RNA病毒感染,诱发病毒感染相似的气道炎症,促使中性粒细胞聚集,破坏正常气道,刺激IFN-γ分泌。但是poly(I:C)诱发的气道炎症是有时间限制的。

一种简便的植物poly(A)^+RNA(多聚腺嘌呤核糖核酸)提取方法

液氮速冻植物材料后,在微碱性条件下用SDS-苯酚法和氯化锂沉淀法,快速从小麦幼苗叶片中分离制备总RNA,所得RNA纯度合格,且未降解.从总RNA经oligo(dT)柱亲和层析分离poly(A)^+RNA,采用重复过柱法,使poly(A)^+RNA纯度较好.此法操作简便,成本低廉,是一种较好的poly(A)^+RNA提纯方法,值得推广.

鲮鱼垂体Poly(A)^+RNA的分离和纯化及其生物活性鉴定

本文利用快速保温法分离纯化了鲮鱼垂体Poly(A)^+RNA,并首次在北农大“白粒146号”小麦麦胚体系中进行了体外翻译活性测定,对鲮鱼Poly(A)^+RNA其最适镁离子浓度为1.7mmol/L,最适Poly(A)^+RNA浓度为0.12μg/50mL,但钾离子浓度及预保温对蛋白质的合成影响不大。实验结果表明鲮鱼垂体Poly(A)^+RNA的体外蛋白翻译活性达对照组的22倍。由于改进了方法,简化了操作程序,因此使鲮鱼垂体Poly(A)^+RNA的翻译活性大大提高了。

以CB-F83-Oligo(dT)-纤维素批量亲和层析分离poly(A)RNA

Poly（A）RNA分离是反向转录cDNA,构建cDNA文库以及进行差异杂交等的基础工作,也是改善RNA凝胶吸Ep和S1核酸酶保护实验质量的基本措施。Poly（A）RNA的分离主要采用Oligo（dT）-纤维素柱亲和层析的方法。我们在非洲爪赡卵母细胞及早期胚胎Poly（A）RNA的分离过程中,先后使用了Poly（A）Quick Column（Stratagene产品）和 Oligo（dT）Cellulose,Type 7（pharmacia产品）柱亲和层析以及CB-F

双抗体免疫沉淀法纯化牛生长激素poly(A)^+RNA的研究

我们用双抗体免疫沉淀法,从牛垂体多聚核糖体中分离出牛生长激素特异多聚核糖体,由此多聚核糖体纯化的牛生长激素Poly(A)^+RNA,可以在麦胚体外翻译系统中和兔网织红细胞体外翻译系统中促进^(14)C-亮氨酸的参入。合成的含^(14)-亮氨酸的翻译产物中有91％可以被牛生长激素抗体沉淀。用SDS-11％PAGE对翻译产物进行鉴定表明,翻译产物在25KD处呈一条放射自显影带,与报导的牛生长激素前体分子量相吻合。

1,4—二取代酰氨基硫脲类化合物(DATCD_s)的植物生理效应与应用研究——Ⅵ.DATCD—A对离体黄瓜子叶中RNA代谢的调控

DATCD—A抑制RNA水解酶活性,提高RNA合成速率,诱导离体黄瓜子叶中与RNA基因达相关的poly(A)RNA含量的增加,并增加总RNA的含量。

共载siRNA与多西他赛的透明质酸修饰的还原敏感型纳米粒质量评价

研究和评价共载特异性抑制环氧化酶（COX-2）表达的小干扰RNA（siRNA）和多西他赛（DTX）的透明质酸修饰二硫键交联的聚乙酰亚胺（PEIss）与聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）形成的还原敏感型肿瘤靶向纳米粒（DTX/si COX-2/HRPSP NPs）的体外质量。首先,通过溶剂挥发法制备DTX/si COX-2/HRPSP NPs,同时制备不含二硫键交联的透明质酸修饰的PEI-PLGA纳米粒（DTX/si COX-2/HPP NPs）作为对照。结果显示,两者NPs呈核壳圆形,粒径处于150～200 nm之间,体外释放实验表明,DTX/si COX-2/HRPSP NPs中的DTX在24 h内呈现缓释行为,且HRPSP NPs在p H 5.0中8 h时的累积释药量较p H 7.4中释药量高10%～25%,证明酸性条件更有利于纳米粒中DTX的释放,具有肿瘤微环境敏感性。体外细胞摄取实验表明,当N/P比为40/1,孵育时间在14～16 h时,纳米粒的摄取量最高,受体靶向抑制试验显示,HRPSP NPs能特异性结合CD44受体,具有肿瘤细胞靶向性。最后,通过Western blot方法测定不同纳米粒对细胞内Bcl-2,bax,caspase-3和COX-2蛋白的相对表达效率。结果显示,实验组与对照组相比,促凋亡蛋白bax和caspase-3显著增加,抗凋亡蛋白Bcl-2显著下降,COX-2蛋白的表达也相应降低,尤其以DTX/si COX-2/HRPSP NPs组最为明显（P〈0.01）,实现了小分子药物和siRNA协同特异性治疗的目的。

小RNA干扰PCBP2在神经胶质瘤细胞中对P53相关基因的调节和对细胞增殖的影响

目的探索多聚胞嘧啶结合蛋白2(PCBP2)表达下调对相关基因和胶质瘤细胞增殖的影响。方法 3株神经胶质瘤细胞系(T98G、U87MG和U251)各分为2组,分别转入特异性靶向PCBP2基因的小干扰RNA(siRNA)和对照siRNA,用Western blot法检测siRNA对PCBP2蛋白的抑制效果及对P53蛋白和它的两个靶基因PUMA和BAX的表达影响,同时检测P53共调节因子FHL2和同家族成员FHL1表达变化。用生物素pull-down分析PCBP2是否和FHL家族成员mRNA结合。用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brd U)掺入法检测细胞增殖能力,Hoechst染色观察细胞凋亡率。结果 PCBP2 siRNA转染这3株细胞后使PCBP2蛋白表达水平明显下调(P<0.05);增加P53及它的靶基因PUMA和BAX的蛋白表达(P<0.05);抑制FHL2蛋白(P<0.05),但并不结合其mRNA的3'非编码区(3'UTR);Brd U阳性细胞减少(P<0.05);Hoechst染色阳性细胞增多(P<0.05)。结论抑制PCBP2表达可以增强胶质瘤细胞中P53通路活性,并减弱细胞增殖能力,诱导细胞凋亡。

慢病毒介导的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1siRNA对大鼠脑梗死后神经血管单元的影响

目的观察慢病毒介导的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)siRNA对大鼠脑梗死后神经血管单元(NVU)的影响。方法 SD大鼠132只随机分为假手术组(n=32)、脑梗死组(n=30)、空病毒组(n=32)和PARP-1组(n=38)。空病毒组和PARP-1组大鼠分别于侧脑室注射空病毒和携带目的基因的病毒5μl进行RNA干扰,14 d后进行脑梗死模型制作。造模术24 h后依据Longa 5分法进行神经功能评分。采用TTC染色检测脑梗死体积,HE染色观察脑组织病理改变,伊文思蓝(EB)通透率检测计算脑组织EB含量,脑组织干湿重法测定脑组织含水量,电镜观察NVU超微结构的改变。结果假手术组与空病毒组间大鼠PARP-1 mRNA表达水平的差异无统计学意义(P=0.244)。与空病毒组比较,PARP-1组RNA干扰后3 d、5d、8 d PARP-1 mRNA表达水平均明显下降(均P<0.05)。假手术组大鼠无神经功能缺损,无脑梗死。与假手术组比较,脑梗死组和空病毒组大鼠缺血侧脑组织EB含量和脑组织含水量明显增加(均P<0.05)。与脑梗死组和空病毒组相比,PARP-1组大鼠神经功能评分显著降低,脑梗死体积明显减小,脑组织EB含量和脑组织含水量明显减少(均P<0.05)。HE染色显示,假手术组大鼠海马神经细胞染色均匀,细胞排列紧密整齐且结构清晰;脑梗死组和空病毒组大鼠海马神经细胞肿胀、破裂、轮廓模糊,染色较深;PARP-1组神经细胞排列整齐,染色均匀。电镜可见,假手术组海马NVU超微结构清晰完整;脑梗死组和空病毒组神经细胞变性,线粒体肿胀、嵴减少,髓鞘变薄、分层,血管内皮细胞凋亡、基底膜不连续,突触数量减少、结构破坏;而PARP-1组海马NVU超微结构损伤明显减轻。结论抑制PARP-1的表达,可明显改善脑梗死大鼠的神经功能,缩小脑梗死体积,减轻脑梗死后NVU的损伤。

反义RNA和反义硫代寡核苷酸抗HBV转基因小鼠病毒疗效的比较

目的 比较人工合成的反义硫代寡核苷酸 (asODN )和反义RNA真核表达质粒 (PCEP4-ac)在乙型肝炎(HBV)病毒转基因小鼠体内的抗病毒作用。 方法 设计合成针对HBV -pre -c/c基因的反义硫代寡核苷酸 5‘ -CAT GCCCCAAAGCCAC -3’。构建HBV -c区反义RNA真核表达质粒 (PCEP4-ac) ,并以半乳糖 -多聚赖氨酸 (Gal15 -PLL)作肝靶向载体。将 2 0只HBV转基因小鼠分为反义寡核苷酸、反义RNA真核质粒表达、生理盐水组。靶向反义硫代寡核苷酸以每只体重 15 0ug剂量 ,反义RNA真核质粒每只 10 0ug剂量 ,尾静脉注射给药 ,对照组用同样体积生理盐水同样方法给药。 结果 注射asODN和PCEP4-aC后 7d血清HBsAg已有所下降 (P <0 .0 5 ) ;14d时显著下降 (P <0 .0 1) ,且血清HBV -DNA转阴率分别为 66.7% ( 4 /6)和 62 .5 % ( 5 /8) ,而生理盐水组无明显变化。 结论 反义硫代寡核苷酸和反义RNA真核表达质粒均能在乙肝转基因小鼠体内抑制HBV复制和表达 ,且两者在抑制作用上无明显差异性。

多聚胞嘧啶结合蛋白E2的RNA干扰对白血病32DP210细胞分化影响的分子机制探讨

目的:Bcr/abl诱导多聚胞嘧啶结合蛋白E2[poly(rC)-binding protein-E2,hnRNP-E2]的异常表达在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)急变中起着重要作用。本研究旨在探讨hnRNP-E2特异性小发夹RNA(shor thairpin RNA,shRNA)对小鼠白血病32DP210细胞分化的影响,并初步探讨其可能的分子机制。方法:构建能表达特异性抑制小鼠hnRNP-E2基因表达的shRNA(即sh-hnRNP-E2)反转录病毒载体,经Phoenix-Ampho细胞包装后,取上清液感染小鼠白血病32DP210细胞,然后采用RT-PCR和Western印迹法验证sh-hnRNP-E2对hnRNP-E2 mRNA的干扰以及蛋白表达抑制效果,瑞氏染色法观察靶细胞分化情况,FCM法检测粒系分化抗原Gr-1表达情况,Western印迹法检测下游野生型CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding protein α,C/EBPα)的表达情况。结果:sh-hnRNP-E2反转录病毒感染32DP210细胞后,显著抑制靶细胞内hnRNP-E2 mRNA和蛋白的表达;靶细胞形态学出现粒系分化特征,细胞表面粒系分化抗原Gr-1表达被诱导;同时,靶细胞内野生型C/EBPα蛋白的表达恢复。结论:sh-hnRNP-E2特异性沉默靶细胞内hnRNP-E2基因表达后,可促进32DP210细胞向粒系分化;其机制可能与hnRNP-E2表达受抑制后,不能再对C/EBPα的翻译模式进行异常调控,从而恢复野生型C/EBPα的表达有关。

乙烯诱导下草莓果实采后RNA代谢与蛋白质合成活性的变化

草莓草果实在乳白时期采收（开花后约４０ｄ），分别用１０μｌ／Ｌ，５０μｌ／Ｌ和１００μｌ／Ｌ的外源乙烯进行处理。处理后的果实大分子ＲＮＡ和ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ水平以及ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ与总ＲＮＡ的比例均有增高。果实体内ＲＮＡ酶活性和体外蛋白质的合成水平也升高。乙烯很可能是促进草莓果实成熟衰老的因素之一。

siRNA沉默Ran基因对结肠癌细胞株凋亡和Caspase-3、PARP表达的影响

背景:结肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一。本课题组前期研究发现结肠癌特异性抗原类硫氧还蛋白-2(Txl-2)的亚型之一Txl-2b可与Ras相关核蛋白(Ran)相互作用,但Ran在结肠癌发病过程中的作用和机制鲜有报道。目的:以RNA干扰技术靶向沉默结肠癌细胞株Ran基因,观察该方法对细胞凋亡和半胱天冬酶-3(caspase-3)、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)表达的影响。方法:设置si-1、si-2、si-3以及阴性对照(NC)组,分别将终浓度为20、40、60 nmol/L的Ran小干扰RNA(siRNA)-1、siRNA-2、siRNA-3以及NC siRNA转染结肠癌细胞株HCT116、DLD-1。采用蛋白质印迹法检测siRNA干扰效率以及caspase-3、PARP表达的变化;采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果:20 nmol/L siRNA-1、siRNA-2抑制Ran表达的效果最佳。si-1组HCT116、DLD-1细胞的早期凋亡率较NC组显著增加(19.37%±7.57%对4.83%±1.72%;16.53%±3.38%对6.27%±3.13%;P均<0.05)。si-1组、si-2组HCT116、DLD-1细胞的晚期凋亡率较NC组显著增加(15.97%±3.31%、16.33%±5.40%对6.40%±1.05%;22.93%±1.57%、11.50%±0.70%对6.20%±0.98%;P均<0.05)。si-1组、si-2组DLD-1细胞与NC组相比,被切割的caspase-3(活性形式)和被切割的PARP(非活性形式)表达水平显著升高。结论:沉默Ran基因能明显促进结肠癌细胞凋亡,其机制与调控caspase-3、PARP表达有关。

利用eIF4E分离纯化非编码RNA的新方法

人翻译起始因子eIF4E是特异性识别并结合mRNA帽结构的蛋白质.该文通过克隆人源基因eIF4E,并利用原核细胞大肠杆菌BL21成功表达了具有帽结合功能的eIF4E蛋白,利用该蛋白亲和纯化分离得到了具有帽子结构的RNA.通过对比用oligo(dT)分离得到的非编码RNA,eIF4E法得到了更多种类的非编码RNA.本研究为非编码RNA的分离与发现提供了一个重要的工具.

长链非编码RNA PCBP1-AS1在乳腺癌组织中的表达及临床意义

目的:研究多聚胞嘧啶结合蛋白1反义长链非编码RNA(lncRNA PCBP1-AS1)在乳腺癌组织中的表达及临床意义。方法:选取2013年5月至2016年4月在本院进行手术治疗的105例乳腺癌患者作为研究对象,将切除的癌组织作为试验组,同时取同一患者的癌旁(距肿瘤边缘>2 cm)组织作为对照组。用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测lncRNA PCBP1-AS1表达情况;分析lncRNA PCBP1-AS1与乳腺癌病理参数关系;分析lncRNA PCBP1-AS1表达情况对乳腺癌患者生存情况的影响;Cox回归分析影响乳腺癌的预后因素。结果:试验组lncRNA PCBP1-AS1表达明显低于对照组(P<0.05);乳腺癌患者癌组织中lncRNA PCBP1-AS1表达水平与患者年龄、肿瘤直径、绝经情况和病理类型相关性不明显(P>0.05),与淋巴结转移和TNM分期有关(P<0.05);绘制乳腺癌患者术后36个月生存曲线,lncRNA PCBP1-AS1高表达患者的总生存率明显高于低表达患者(P<0.05);对lncRNA PCBP1-AS1表达、淋巴结转移和TNM分期进行Cox回归分析,显示lncRNA PCBP1-AS1表达是影响乳腺癌患者预后的独立保护因素,TNM分期是影响乳腺癌患者预后的独立危险因素。结论:乳腺癌患者癌组织中lncRNA PCBP1-AS1呈低表达,其表达水平与淋巴结转移和TNM分期有关,lncRNA PCBP1-AS1表达是乳腺癌预后独立保护因素,可作为乳腺癌预后判断指标之一,有望成为乳腺癌治疗的潜在靶点。

阿柔比星B结合DNA和体外抑制DNA依赖性RNA合成DNA碱基顺序选择性研究

采用荧光淬灭法和体外无细胞RNA合成系统研究了阿柔比星B结合DNA和抑制NA依赖性RNA合成的DNA碱基顺序选择性，结果表明阿柔比星B与小牛胸腺DNA，poly[d(1-T)]和poly[d(G-C)]有明显结合；结合RNA的活性小，与天然DNA的结合力较与变性DNA的结合力大，Scatchar分析显示阿柔比星B结合3种DNA的亲和性依次为poly[d(A-T)]>poly[d(G-C)]＞小牛胸腺DNA。同样，用大肠杆菌RNA多聚酶和大鼠肝细胞核游离RNA多聚酶实验均显示阿柔比星B的抑制力依次为poly[d(A-T)]>polyu[d(G-C)]>poly[d(I-C)]。上述结果证明抑制RNA合成的碱基顺序选择性与其结合DNA碱基顺序的选择性有关。